Deteccin de protenas transgnicas en harinas

de maz comercializadas en Bogot, Colombia

(22 Febrero 2016, Rev. Salud Pblica. 18 (3): 470-483, 2016)

Sergio Alejandro Castro lzate. 20152180016.

Carlos Alberto Buitrago Bohrquez.
20152180026.

Fig. 1. Protena
Cry1Ac (PDB, 2016)

Tabla de Contenido.

Resumen.
Antecedentes.
Materiales y Mtodos.
Resultados.
Discusin.
Conclusin.
Bibliografa.

Resumen.
El siguiente artculo tiene como objetivo
detectar la presencia o ausencia de
protenas transgnicas derivadas de cultivos
genticamente modificados.
Para esto se usaron 11 protocolos de
extraccin de protena en 17 harinas. Luego
se determin la presencia de 7 protenas
transgnicas (CP4EPSPS, Cry1Ab, Cry1Ac,
Cry1f,
Cry2A,
Cry34Ab1
y
Cry3Bb1)
utilizando kits de Eliza.

Fig. 2. Kit de Elisa, materiales utilizados para realizar la tcnica de Elisa.

(Fuente: http://www.cosmobiousa.com/images/csbkitslarge.jpg)

Antecedentes.
El maz se da en una basta cantidad en todo el
mundo. Para el ao 2013-2014 se produjeron 1.010
millones de toneladas. El maz genticamente
modificado ocupo, en 2013, 51 millones de
hectreas en todo el mundo. Colombia lo importa
de Estados Unidos, Brasil y Argentina.

Fig. 3. reas con

cultivos de organismos
genticamente
modificados u OGM.
(Pixeltoo, 2005)

OGM y alimentos transgnicos.

Por medio de la ingeniera gentica se pueden
obtener organismos genticamente modificados
(OGM) con caractersticas especificas, consecuencia
de la insercin de genes provenientes de otros
organismos.
Un alimento transgnico es aquel que ha sido
producido por un OGM y que puede expresar los
genes de este en su estructura.
Estos alimentos pueden contener trazas
de
protenas codificadas por los transgenes (protenas
transgnicas)

Protenas transgnicas en plantas del maz.

Estas nacen de la necesidad de proteger las plantas
contra herbicidas como el glifosato y plagas de
colepteros y lepidpteros.
La mayora proviene de microorganismos como el
Bacillus thuringiensis y Agrobacterium Sp.

Fig. 4. Bacillus
thuringiensis.
(www.bt.ucsd.edu)

Fig. 5. Agrobacterium sp. (Guerrero J.,

2012)

Algunos ejemplos de protenas

transgnicas.

Fig. 6.
Endotoxina
insecticida
Cry3Bb1 (PDB,
2016)

Fig. 7. Toxina
Cry34Ab1
(PDB, 2016)

Fig. 9. CP4 EPSPS (PDB,

2016)

Fig. 8. Protena
insecticida
Cry2AA (PDB,
2016)

Legislacin.
Ley 740 de 2002. Protocolo de Cartagena sobre
Seguridad de la Biotecnologa del Convenio sobre
la Diversidad Biolgica.
Resolucin 4254 de 2011 del Ministerio de Salud y
Proteccin Social.

Fig. 10. Mapa de los pases que

permiten la comercializacin de
alimentos genticamente modificados.
(Zhitelew, 2015)

Materiales y mtodos.
Se utilizaron harinas de maz, para consumo humano, que se
comercializaron en almacenes de cadena de Bogot D.C. en el
ao 2013.

Tabla 1. Harinas de maz

utilizadas (Tabima. L,
Chaparro. A, y Trujillo, M.

Extraccin de protenas.
Para la extraccin de protenas se utilizaron diferentes
protocolos y las muestras B8, A5 y O2. Los protocolos se
definen por dos pasos principales:
Lisis o rompimiento celular.
Separacin y purificacin de las protenas.
Tcni
ca
T1

Protocolo de extraccin.
Extraccin con buffer carbonato

T2

Extraccin alcalina

T3

Extraccin con buffer fosfato de sodio (PBS)

T4

Extraccin con bfer fosfato de sodio (PBS)-sodio dodecil sulfato (SDS)

T5

Extraccin con buffer Tritn X-100

T6

Extraccin con buffer carbonato y sonicacion por 20 minutos

T7

Extraccin con NaCl 1 M y sonicacion por 20 minutos

T8

Extraccin con buffer fosfato de sodio (PBS) con sonicacion por 20 minutos

T9

Extraccin con buffer carbonato y sonicacion por 30 minutos

T10

Extraccin con NaCl 1 M y sonicacion por 30 minutos

T11

Extraccin con buffer fosfato de sodio (PBS) con sonicacion por 30 minutos
Tabla 2. Protocolos de
extraccin de protenas.
(Tabima. L, Chaparro. A, y
Trujillo, M. 2016)

Cuantificacin de protena total.

Se realiz por espectrofotometra utilizando el
ensayo colorimtrico de Bradford que se da a 595
nano metros. Se realizo por triplicado con cada
harina.

Fig. 11. Componentes fundamentales

de un espectrofotmetro de haz
simple.

Deteccin de protenas transgnicas.

Se utilizaron pruebas de Elisa, los controles
positivos utilizados fueron grano de maz
modificado genticamente y certificado por el
INVIMA y autorizado en Colombia para el consumo
humano,
NK603,
NK603+MON810
y
NK603+MON89034. Como prueba negativa se
utilizaron semillas de maz obtenidas de un
mercado local de municipio de Cachipay.
La prueba de Elisa detecta alrgenos por medio de
enzimas que se unen a los anticuerpos que se
producen, esta unin se da en los epitopes.

Anlisis Estadstico.
Se utilizaron bloques completos al azar, con tres
repeticiones por tratamiento. Se realizaron una
serie de pruebas para detectar 3 elementos.
Prueba de Bartlett (Misma varianza)
Prueba de Shapiro-Wilk (Distribucin normal)
Prueba de Tukey (Diferencia de medias de
tratamiento)
Se determino que las muestras sern positivas si
presentan valores superiores a 0,2.

Resultados.
Mejor protocolo de extraccin de protena total:
Buffer
Carbonato
0.3 y 2.3 mg/g

Buffer PBS
A5 no se
detecta
protena.
Si
.

Extraccin
alcalina
5.7 y 10.7 mg/g

B8 y
O4
Fosfato
sdico+SDS
Concentracin
<

Tritn x-100
4.8 y 6.0 mg/g

Concentraciones de protena total para cada

mtodo.

Figura 12 : Concentracin total obtenida en los diferentes

mtodos de extraccin en las harinas. (Tabima. L, Chaparro. A,
y Trujillo, M. 2016)

Prueba de Tukey.

Figura 3 :Comparacin de mtodos de extraccin de protena

total en harina de maz (Tukey 95%) (Tabima. L, Chaparro. A, y
Trujillo, M. 2016)

Concentracin de protenas totales para

cada mtodo y prueba de Tukey.
Teniendo en cuenta estas graficas , los mejores mtodos
de extraccin fueron el fosfato sdico con SDS al 1% , La
extraccin alcalina y el buffer con tritn X-100 al 1%.
Aunque al llevar acabo las pruebas de ELISA en los
controles positivos (muestra de grano transgnico
NK603, MON810+NK603 y MON89034+NK603) los
protocolos T4 y T2 Generaron interferencia.
En cambio con el buffer tritn X-100 al 1% se alcanzaron
valores de absorbancia superiores a 0,2 , esto indica
deteccin positiva de la protena transgnica.
Respecto a esto se decidi usar este control para las
siguientes extracciones de protena total para evaluar la
presencia de protenas genticamente modificadas en la
harina.

Protena total soluble de las harinas de maz

evaluadas.

Tabla 3 :Concentracin de protena total soluble de las harinas

de maz evaluadas (Tabima. L, Chaparro. A, y Trujillo, M. 2016)

Protena total soluble.

Para este control se analizaron 27 muestras de

harina de maz (19 harinas comerciales, 3
controles positivos y un control negativo)
Estas concentraciones variaron entre 4 y 11 mg/g
de harina , y se destacaron las harinas
provenientes de los granos de maz entero o
partido, es decir los controles positivos
(transgnico) el maz de chcala (control negativo)
y el cuchuco de maz .

Harinas de maz en las que se detecto la

presencia de protenas transgnicas.
Las muestras B2 , A3 O3 y C2 presentaron
densidad ptica (D.O) superiores a 0.2 para la
protena CP4EPSPS.
En la protena Cry1F fue detectada en las
muestras B2, B8, A3, O3, C1 y C2.
Para la protena Cry34Ab1 se realizo ELISA de
tipo cuantitativo y se detecto en la harina A3
una concentracin de 0,1 mg/g.
En las 19 harinas comerciales no se detecto
presencia del evento Cry2A

Deteccin presencia de protenas

transgnicas.

Tabla 4: Harinas de maz en las que se detecto la presencia de

protenas transgnicas (Tabima. L, Chaparro. A, y Trujillo, M.
2016)

Discusin.
La eleccin del protocolo T4 para la extraccin de
protenas coincide con los estudios de Margarit
(2006), aunque en estos la extraccin por agua
alcalina no dio concentraciones superiores a 0,1
mg/g.
El proceso de sonicacion no permiti la separacin
efectiva de las protenas, por el contrario en
estudios de Oszvald (2008) se obtuvo hasta el
90% de las protenas contenidas
El mtodo de extraccin por Tritn X-100 es
efectivo ya que este es un detergente no
desnaturalizante, sin embargo para el caso del
SDS este acta rompiendo los enlaces no
covalentes desnaturalizando las protenas.

Ausencia de evento Cry2A

Existen dos causas para este fenmeno:
La protena transgnica no se encuentra
expresada.
El proceso de pre-coccin causa un cambio en la
estructura terciaria de la protena Cry inutilizando
la prueba Elisa para estas protenas ya que se
modifican los epitopes de la molcula. Estos
resultados concuerdan por los encontrados por De
Luis (2009)

Fig.12. Epitopes de la
gliadina. (PDB, 2008)

Efectos de la pre-coccin y porcentajes de

las protenas.
Se encontr que cuando el grano de maz se
somete a temperaturas y presiones, la cantidad
de protenas disminuye entre el 20% y 30%.
La protena CP4EPSPS, se encontr en una
concentracin similar en la harina C2 y en el
control positivo NK603.
La protena Cry1F tambin se encontr en
proporciones similares en la harina C2SP y en el
maz transgnico reportado en el INVIMA como
TC1507.
La protena Cry1AB se encuentra en un porcentaje
similar en la harina C2 y en el control positivo
NK603+MON810.
La nica protena que se encontr en
concentraciones bajas fue la Cry34Ab1 detectada

Conclusin.
Siete de las 19 harinas de maz evaluadas
contienen trazas de protenas transgnicas (B2,
B8, A3, O3, O1, C1 Y C2)
que confieren
resistencia a lepidpteros o colepteros y
tolerancia al glifosato. Las protenas transgnicas
encontradas en las harinas de maz (CP4EPSPS,
Cry1Ab, Cry1F, Cry34Ab1, Cry3Bb1) estn
aprobadas para el consumo humano segn datos
del Ministerio de Salud y Proteccin Social,
aunque su etiquetado no es obligatorio ya que no
presentan modificaciones en las propiedades
organolpticas, nutricionales, condiciones de uso
o presencia de alrgenos.

Bibliografa.
Tabima. L, Chaparro. A, y Trujillo, M. (2016). Deteccin de protenas
transgnicas en harinas de maz comercializadas en Bogot,
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