INMUNOFLUORESCENCIA

Identificar y localizar Ag en el interior o

superficie de la clula
Fluoresceina fijado a una molcula de Ac
Mtodos directos e indirectos
Actualmente :CMF:cuantificar hemorragia
maternofetal,identificar cl transfundidas y
seguimiento de la supervivencia

ENZIMOINMUNOANLISIS
Medir Ag o Ac
Fosfatasa alcalina puede unirse a moleculas de Ac

sin destruir su especificidad

Utilizada para unir Ig unida a GR y demostrar
hemorragia fetomaterna

PRUEBA DE ADHERENCIA DE
GR
EN
FASE
SLIDA
PRUEBA DIRECTA:
Ac fijado a la microplaca y se agregan GR
(+) GR se adhieren a los bordes
(-) GR se asientan en los bordes

PRUEBA INDIRECTA
GR con Ag conocido unidos a una placa pretratada con

glutaraldehido y poli-lisina, Ac especifico

Se agrega suero ,incubar,lavar proteinas remanentes
Indicador para el Ac fijado GR recubiertos con IG
Interpretacin : Idem

PRUEBA DE ADHERENCIA DE
GR EN FASE SLIDA

PRUEBA DE GEL
Utiliza microtubos contenidos en una tarjeta de

gel.Este formato permite la centrifugacin simultnea

de los tubos(6) en equipos especialmente diseados
La incubacin del Ac con los GR en suspencin se
realiza en la parte superior del tubo ,luego se
centrifuga para que los GR entren en contacto con el
As que baa el gel
Los geles actan como filtro,reteniendo los
aglutinados y dejando pasar los GR libres que se
depositan en el fondo

EXISTEN 3 FORMULACIONES BSICAS

DEL GEL
Gel neutro:
Solo contiene la matriz del gel-sephadex

para

deteccin deaglutinados producidos por Ac

aglutinantes
Prueba inversa ABO,investigacin de Ac frios y
pruebas enzimticas

Gel especifico:
Mezcla de gel-sephadex contra un Ag de gr

sanguineo
Determinacin de Gr sanguineo
Gel antiglobulina:
Se usa en la P de Coombs para identificar Ac
antieritrocitarios incapaces de producir
aglutinacin directa

Puede ser utilizado para detectar e identificar Ags

y Ac,pruebas de compatibilidad pretransfusional

En los tubos que contiene el panel ABO,el gel est

en medio salino,mientras que en los del panel

selector est en reactivo de Coombs

VENTAJAS:
Puede efectuarse tcnicas en salino,

enzimtico,antiglobulinico

Es automatizable
DESVENTAJAS:
Costo y equipamiento

Partculas de gel :filtros que atrapan los

aglutinados
Aglutinados grandes:Parte superior
Aglutinados pequeos: Parte Inferior
No aglutinados :extremos en pico
APLICACIONES:
Detectar e identificar Ac o Ag
Pruebas de compatibilidad

Prueba Funcional: ERITROFAGOCITOSIS

En 3 portaobjetos colocar 1,5 ml. de sangre del
paciente recin extrada e incubar durante 60 minutos a
37C en cmara hmeda. Retirar el cogulo formado y lavar
las clulas obtenidas por su capacidad de adherirse al
vidrio con una solucin de Hanks a 37C.
Preparar las siguientes suspensiones al 5% en
solucin fisiolgica:
a) Hemates Propios (HP)
b) Hemates Normales (HN)
d) Hemates Normales Sensibilizados (HNS) con anti-D
(clase IgG) diluido convenientemente.

A 2,5 ml de las mismas agregar 1 ml de suero humano

fresco compatible y 1,5 ml de solucin de Hanks.
Incubar los portaobjetos con 1 ml de cada una
de estas mezclas durante 3 hs. a 37C en cmara
hmeda. Posteriormente lavar con solucin de Hanks a
37C.
Fijar las clulas mononucleares obtenidas con
metanol durante 1 minuto y colorear con la tincin de
May Grunwald Giemsa.
Realizar la observacin microscpica de los
preparados contando 200 elementos y calcular los
porcentajes de clulas fagocticas activas (CFA).
Valor normal < 4%.

Imgenes de
eritrofagocitosis

CFA

GRs
adheridos

GR
fagocitado

-INHIBICIN DE LA HEMAGLUTINACIN:

Neutraliza un Ac especfico con su sustancia soluble

correspondiente en las pruebas de identificacin de Ac

( til cuando se trabaja con muestras sricas que contienen
mltiples especificidades)
TRATAMIENTO ENZIMTICO:
Se utilizan para tratar Gr con el fin de potenciar cierta
reactividad de Ac o proporcionar una mas efectiva
adhesin de Ac en los procedimientos de autoadsorcin
POTENCIACIN DE LA REACTIVIDAD
La potencicin de la reactividad Ac con clulas tratadas
enzimticamente se demuestra en los sistemas: Rh, Kidd;
Lewis, Ii, P
DESTRUCCIN DE LA REACTIVIDAD:
El tratamiento Ez puede tambien usarse par destruir la
reactividad de los Ag: M, N, Fya, Fyb, Pr, Cha, Rga

 ADSORCIN:

Proceso utilizado para eliminar Ac del suero, se pueden

utilizar Gr lavados, tratados enzimticamete,o estromas

eritrocitario
*Eliminacin de auto Ac frios o calientes: generalmente se
utilizan Gr autlogos para la adsorcin
*Eliminacin de Aglutininas ABO no necesarias: esto puede
hacerse en la preparacin de antisueros puros
ELUCIN:
Proceso utilizado para la eliminacin de Ac unidos a

hematies:
1 se lavan las clulas con SF,para eliminar cualquier Ac no
unido.
Mtodos: *Por calor( disocia el Ac de los Ag eritrocitarios :
56-60C durante 10 min efectivo para los Ac IgM
*Congelacin /descongelacin: bueno para la disociacin de
las IgM
*Solventes orgnicos: Eter ,etanol , cloroformo, xileno :
Para la IgG
*Elucin cida con Digitonina y Glicina: (por alteracin del
Ph)

-TITULACIN DE Ac:

Es un mtodo para determinar semicuatitativamente la cantidad

de Ac presente en un suero determinado
El ttulo se expresa como la recproca de la dilucin srica mas
alta que provoca la aglutinacin macroscpica
Aplicaciones :en estudios prenatales
UTILIZACIN DE REACTIVOS SULFHIDRILOS:
El 2ME rompe los enlaces disulfuros y son utilizados para inactivar
la capacidad de aglutinacin de las IgM, destruyendo la estructura
pentamrica de la IgM .Son tiles para investigar las IgG
clncamente significativa en presencia de un autoAc y para la
deteminacin de ABO y Rh en presencia de un autoAc fro
PRUEBAS PARA Ag ERITROCITARIOS
Cuando el paciente tiene un Ac complicado a veces es til tipificar
los Gr del paciente para los otros Ag de grupo sanguineo
frecuentes para determinar de que Ag carece el paciente y tener
informacin sobre que Ac podra formar el paciente

 -FUENTE DE REACTIVOS : Antisueros :Plasmas extraido de

donates que fueron inmunizados por transfusin o embarazo o

animales inmunizados con Ag purificados .
Se debe ensayar el antisuero para especificidad , avidez y ttulo
ANTICUERPOS MONOCLONALES ; Son sintetizados por
Hibridomas linfocitarios (fusin de celulas productoras de AC de
animales y clulas neoplasicas)
Los Ac monoclonales se diferencian de los Ac convencionales por
la especificidad ( reaccionan con uno en vez de con mltiples
determinantes
antignicos.)
el
grado
de
pureza
y
reproductibilidad
Algunos reactivos derivados de Ac monoclonales murinos:anti A,
anti B, antiH, Anti M, anti N, anti Lewis , anti P y los de origen
humano:antiD, anti C, anti E , antic
LECTINAS: contiene proteinas receptoras que reaccionan con
carbohidratos de la membrana del Gr para causar
hemaglutinacin

GRACIAS!