EQUIPE CYTOKINE ET NOS/IMMUNIT ET

PATHOGNIE
LBCM, FSB, USTHB
MME BOUKERCHA.A

GNOMIQUE
&
BIOINFORMATIQUE
1

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-201

PROGRAMME GENOMIQUE & BIOINFORMAIQUE

TD (n1): Les marqueurs gntiques

Polymorphisme et informativit
Marqueurs morphologiques et cytogntiques
Marqueurs protiques
Marqueurs ADN : RFLP, Mini et Microsatellites, STS,
EST, SSCP, RAPD, AFLP, SNPs
TD (n2): Cartographie gntique
Construction de carte
Cartographie comparative
Cartographie dun gne dintrt
TD (n3): Cartographie physique
Fragmentation de lADN

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

PROGRAMME GENOMIQUE & BIOINFORMAIQUE

TD (n4): Exposs
Gntique inverse : du gne la fonction (principe)
Squenage de lADN (principes et nouvelles mthodes)
Mutagnse dirige (ADN-T)

TD (n5): Exposs
SAGE(Serial Analysis of Gene expression) (principe et nouvelle
mthodes)
Puces ADN et profils dexpression des gnes (principes et
nouvelles mthodes)
Knock-out de gnes (principes et nouvelles mthodes)
TP (n6):
Introduction la Bio-informatique
3
Portails et bases de donnes bio-informatiques
TP (n7):
L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

PROGRAMME GENOMIQUE & BIOINFORMAIQUE

TP (n8) :
La comparaison de squences dADN (mthodes
dalignement)
TP (n9) :
La comparaison de squences Protiques
TP (n10) :
La prdiction de gnes
TP (n11) :
La prdiction de la structure et de la fonction des
protines
TP (n12) :
Haut dbit et automatisation
Robotique et les logiciels

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-20

LES MARQUEURS GNTIQUES

TD n1
5

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

QUEST CE-QUE LA CARTOGRAPHIE EN

GNTIQUE ?
La
cartograph
ie
La
cartograph
ie de
liaison

Les cartes gntiques

Les cartes
dhybridation

La
cartographi
e physique

Les cartes de restriction

Les cartes
cytogntiques

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-20

QUEST CE-QUE UN MARQUEUR

GNTIQUE ?
Squence dADN reprable spcifiquement.
Pas forcment codante
Utilise pour baliser le gnome

En contrle du transfert de gnes, le marqueur:

code pour des caractristiques dtectables
gne TK)

Facilite le reprage des cellules transformes (ex:

Le marqueur est dtect :

Par expression phnotypique.

Par hybridation avec une sonde complmentaire 7

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

DO VIENNENT LES MARQUEURS

MOLCULAIRES ?
Polymorphismes

Htrognit alllique au sein dune population

allles : diffrentes versions dun gne.
Mutations

Polymorphisme nuclotidique SNP

Source de nouvelles variations sur la quelle agissent des
facteurs environnementaux (Slection naturelle)
Un polymorphisme peut tre dtecte au niveau.
Phnotypique.
Chromosomique.
Molculaire

8
L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

DO VIENNENT LES MARQUEURS

MOLCULAIRES ?
Ces variations dans la squence d'ADN n'ont pas

de consquence pathologiques.
Les

polymorphismes
"mutations".

Ceci

sont

le

implique que "mutation"

synonyme de "pathologie"

rsultat

de

n'est

pas

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-20

DO VIENNENT LES MARQUEURS

MOLCULAIRES ?
Ces variations de squence peuvent avoir lieu
Dans les gnes

avec une consquence

consquence
Groupe sanguin
Couleur des yeux
sans consquence
Synonymes

Hors des gnes

sans

10

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-2

11

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

DIFFRENTS TYPES DE MARQUEURS

MOLCULAIRES

RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism)

Microsatellites et minisatellites
STS (Sequenced Tag Site)
EST (Expressed Sequence Tags)
SNP (Single Nucleotide Polymorphism (snips))

12

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

13

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-

LES MARQUEURS : RFLP

RESTRICTION FRAGMENT LENGHT POLYMORPHISM

Les polymorphismes de longueur des fragments de restriction

(RFLP) variation entre individus ou souches dans le profil dADN

obtenue aprs coupure par des enzyme de restrictions (southern blot)

Exemple : MboI : isole de la bactrie Moraxella bovis , reconnait

le site GATC
Le polymorphisme de taille reflte directement des variations de
squences.
Utilis pour les cartes physiques et gntiques
Variante: Possibilit de raliser la PCR-RFLP.
14

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

LE SOUTHERN BLOT

15

LES MARQUEURS: MICROSATELITES

Squence dADN longue de quelques nuclotides

rpte plusieurs fois.

Hypervariables; sur un locus, ils montrent souvent
des dizaines dallles diffrents lun de lautre dans
le nombre de rptitions.
Font partie des squences intergniques, non
codantes Tlomriques, centromriques (Junk DNA)
Les polymorphismes peuvent se visualiser sur un gel
de squenage
Squences de type SSR (SSR: Simple Sequence
Repeats)
19

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-20

SIMPLE SEQUENCE REPEATS (SSR)

Rptition parfaite ou non dun fragment de longueur K
(K-mere)
Fragment long (14 500 pb): minisatellite
(VNTR = variable number of tandem
repeats)
Fragment court (1 13 pb): microsatellites
(STRs = simple tandem repeats)
STR reprsentent 3% du gnome humain,
20

0,5% dinuclotides, 85% (AC)/(AT)

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-20

21

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

LES MARQUEUERS:
EST (EXPRESSED SEQUENCE TAG)
Marqueurs de squences exprimes.
Squences codantes
Issues du squenage systmatique des extrmits dADNc

partiels.
Spcifique dun ARNm

Cellule > ARNm > ADNc plus stable mais ADNc nest pas une copie
exacte de lADN du gne , car suite l'pissage, l'ARN ne garde pas
les rgions non codantes de l'ADN (introns).
Squence partielle dADNc (100pb),
correspond lextrmit 3OH dun gne.
Indicateur du nombre de gnes dans 1 gnome
Surestimation du nombre de gnes

Epissage alternatif.

22

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

PRINCIPE DE L'OBTENTION DES EST

1- construction d'une banque d'ADNc :Les ADNc sont insrs dans un mme type
de vecteur>>> toutes les squences en amont et en aval des ADNc (squences
d'ADN du vecteur) sont identiques pour tous les clones>>> on utilise les mmes
jeux d'amorces pour le squenage de tous les clones, ce qui permet
l'automatisation et donc un squenage grande chelle.
2- Sequenage de 100 nuclotides chaque extrmit de
l'ADNc insr >>>>L'information est partielle par rapport la
taille de certains ADNc (grande taille plusieurs milliers de
nuclotides), mais elle est suffisante pour caractriser de
manire univoque chaque clone. Ces squences partielles
d'ADNc
sont
appeles marqueurs
de
squence
exprime (EST).
23

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-20

ASSEMBLAGE DES EST

La comparaison des squences permet d'aligner les parties qui

se recouvrent partiellement ou "chevauchantes".

Les squences chevauchantes peuvent tre assembles en

enchanements plus grands que l'on appelle des contigs.

Cette opration d'assemblage est effectue par des programmes

informatiques tels que :

Phrap
CAP3("Contig Assembly Program")
24

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

LES MARQUEURS :
EST (EXPRESSED SEQUENCE TAG)
La banque "dbEST" du NCBI (cre en 1993) contient74

millionsd'EST (Janvier 2013) obtenues par diffrents

projets de squenage.
Des banques diminuent lextrme redondance des
squences d'EST en regroupant les squences
correspondant au mme gne :UniGene
La banque "dbGSS" ("database of Genome Survey

Sequence") est semblable dbEST, mais les squences

sont d'origine gnomique et non issues d'ADNc (plus de
35 millionsde GSS - Janvier 2013)
25

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

LES MARQUEURS :
STS (SEQUENCE TAG SITE)
Courte squence unique dans le gnome
Facilement amplifiable par PCR
Dfinie par le couple damorces oligonuclotidiques
Archive sous forme damorces oligonuclotidiques
Utilises pour crer des cartes physiques.
Non codante (pas de signification biologique)
Peut tre codante, correspond des EST
Peut tre un marqueur microsatellite

Permettant dans ce cas dintgrer la carte physique la carte

gntique

26

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

LES MARQUEURS:
SNP (SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM (SNIPS)
Mutation ponctuelle isole
polymorphisme dun seul nuclotide
Variation stable de squence dADN gnomique
Retrouv toutes les 1000pb dans le gnome humain, Chez 10% de

la population
Pas dimplication fonctionnelle/dfinissent un locus unique
SNPc se trouvent dans des rgions codantes/rgulatrices
Intressants pour raliser la cartographie des maladies
multifactorielles
Etudes dassociation de gnes candidats impliqus
dans ces maladies.

27

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

PCR-RFLP
A prsent, lutilisation la plus courante des RFLP est en aval de
PCR
(PCRRFLP) pour dtecter les allles qui
diffrent en squence a un site de restriction donn.
La PCR remplace le southern Blot:

1/PCR amorces spcifiques qui ciblent le SNP

2/coupure du produit de PCR par lenzyme de restriction adquate
3/analyse des profils dADN par Electro
Le polymorphisme de taille reflte directement des variations de
squences.
28

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-2

PHOTO GEL ACRYLAMIDE APRS PCR-RFLP

-

10
9
mPM

1 TNC
305p
b
191p
b
114p
b

-/-

+/-

+/
+

29

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015

DAUTRES MARQUEURS MOLCULAIRES

..

AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) ?

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ?
SSCP (single strand conformation polymorphism) ?
Marqueurs anonymes ?

Trouvez deux avenages et deux inconvnients pour les diffrents

marqueurs dcrits
30

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE-20

CARTOGRAPHIE GNTIQUE

TD nII
31

L3BS -TD GENOMIQUE & BIOINFORMATIQUE2015