TIPOS DE PCR

TIPOS DE PCR
PCR simples:
utiliza-se um par de primers, que limitam a
regio do DNA a ser amplificada >> 1 amplicon

TIPOS DE PCR
PCR multiplex:
so utilizados dois ou mais pares de primers
para amplificar diferentes regies do genoma
de
um mesmo organismo, ou genomas de
diferentes organismos
2 primers
(duplex)
2 amplicons

TIPOS DE PCR
PCR Nested:
duas reaes de PCR consecutivas >> maior
sensibilidade
1a etapa: PCR simples utilizando um par de primers
externo

2a etapa: PCR simples utilizando um par de primers

internos

TIPOS DE PCR
RT-PCR:
utilizada quando o molde a ser amplificado uma
molcula de RNA.
1a etapa: sntese de um cDNA a partir do RNA alvo, por
ao da enzima transcriptase reversa

2a etapa: PCR usando como alvo o cDNA

TIPOS DE PCR
RealTime-PCR (PCR em tempo real):
permite a quantificao do DNA alvo (ou RNA,
quando acoplada a uma reao de transcrio reversa)

SYBR Green: corante que

se liga fita dupla de DNA,
emitindo luz

TCNICAS MOLECULARES
QUE UTILIZAM A PCR

PCR-RFLP
(Restriction
Fragment
Length
Polymorphism Polimorfismo do tamanho do
fragmento de restrio)
RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA
amplificao randmica de DNA polimrfico- utiliza
1 primer com sequncia arbitrria, e portanto sua
sequncia alvo desconhecida.
(1) Obteno de fingerprints (impresses digitais)
genmicos de indivduos, variedades e populaes;
(2) Anlise da estrutura e diversidade gentica em
populaes naturais;
(3) Estabelecimento de relacionamentos filogenticos
entre diferentes espcies;

PCR-SSCP (Single Strand Conformational Polymorphism

Polimorfismo conformacional da fita simples). Triagem de
mutaes. A mudana em uma base na seqncia do cido nuclico
amplificado pela tcnica de PCR pode ser detectada pela tcnica SSCP.

PCR-RFLP
AMPLIFICAO SEGUIDA DE DIGESTO COM
ENZIMAS DE RESTRIO

Pesquisas de SNPs (Single Nucleotide

Polymorphism)= Polimorfismo de Nucleotdeo nico

A molcula de DNA (1) difere da molcula

de DNA (2) em um par de bases individual
(polimorfismo C/T).

Reconhecem uma sequncia de bases

especfica na hlice dupla do DNA, e cortam
ambas as fitas da hlice, em lugares
determinados.
Indispensveis na anlise da estrutura dos
cromossomos, no isolamento de genes e na
criao de molculas novas de DNA que podem
ser clonadas.

PCR-RFLP
Stio de restrio
DNA alvo

Amplicon

Fragmento 1

Fragmento 2

Clivagem com enzima de restrio

Medicina
Forense

As sequncias NVTR (variable number of tandem repeats)=

Nmero varivel de repetio em tandem) tem sido analisadas
em PCR. Essas sequncias nucleotdicas curtas, repetidas de 20 a 100 vezes,
apresentam um padro que varia de pessoa para pessoa, a menos que sejam
geneticamente idnticas. Alternativa simples e rpida para utilizao em medicina
forense, em substituio tcnica de RFLP.

Desequilbrio na sntese das cadeias alfa da

hemoglobina, com deleo de um ou ambos
genes da globina alfa.

 345pb
322pb

A mutao pontual na
regio 3 no traduzida
com substituio de uma
guanina por uma
adenina no nucleotdeo
20210 (20210 GA)
resulta numa molcula
de RNA mais estvel,
resultando em aumento
da produo de
protrombina,
favorecendo a formao

A mutao R506Q do fator V (Fator V Leiden)

resulta da substituio da guanina pela adenina
na posio 1691 do gene FV, formando uma
protena com um resduo de Glutamina no lugar
da Arginina na posio 506, que resistente
protena C ativada.

Anlise da Mutao R506Q

163

267
200
163

67

67

37

37

NN NN

NL NN

Amplificao da regio que flanqueia a mutao (267

pb) , seguida da digesto com enzima Mnl I.
Variante original: 163, 67 e 37pb
200, 267 pb

Variante Leiden:

Angiotensina
I
ECA

Polimorfismo:
I (insero) / D (deleo)

Regio de Amplificao do
Gene da ECA
1441
1501
1561
1621
1681
1741
1801
1861
1921
1981
2041
2101

TGAGACCCTG
CCCTCACAGG
TGTAAGCCAC
ATACAGTCAC
GCAGTGGCGG
CCTCAGCCTC
TATTTTTAGT
CGTGATCCGC
TTATGTGGTT
GAGGTGAGCT
ATGGCCACAT
GCGGGGAGAG

Alelo I
Alelo D

TCTCAGAAAG
ACTGCTGAGG
TGCTGGAGAC
TTTTTTTTTT
GATCTCGGCT
CCAAGTAGCT
AGAGACGGGG
CCGCCTCGGC
TCGCCAATTT
AAGGGCTGGA
CCCGGAAATA
CCATCCTCCA

AAAAAAAAAA
CCCTGCAGGT
CACTCCCATC
TTTTTGAGAC
CACTGCAACG
GGGACCACAG
TTTCACCGTT
CTCCCAAAGT
TATTCCAGCT
GCTCAAGCCA
TGAAGACCTG
GTTTTACCCG

AAAAAGGAGA
GTCTGCAGCA
CTTTCTCCCA
GGAGTCTCGC
TCCGCCTCCC
CGCCCGCCAC
TTAGCCGGGA
GCTGGGATTA
CTGAAATTCT
TTCAACCCCC
TTATGGGCAT
AAATACGTGG

GGAGAGAGAC
TGTGCCCAGG
TTTCTCTAGA
TCTGTCGCCC
GGGTTCACGC
TACGCCCGGC
TGGTCTCGAT
CAGGCGTGAT
CTGAGCTCCC
TACCAGATCT
GGGAGGGCTG
AACTCATCAA

TCAAGCACGC
CCGGGGACTC
CCTGCTGCCT
AGGCTGGAGT
CATTCTCCTG
TAATTTTTTG
CTCCTGACCT
ACAGTCACTT
CTTACAAGCA
GACGAATGTG
GCGAGACAAG
CCAGGCTGCC

480pb
PD
PD

PR
PR

190pb

Amplificao do segmento
do gene da ECA

500bp

480bp

300bp
200bp

190bp

100bp

DD

DD DD ID

II

ID ID

ID

ID

C-

O gentipo I/D tem sido estabelecido como fator de risco

cardiovascular em determinadas populaes.

PESQUISAS DE
AGENTES
INFECCIOSOS
>> GENOMA DE DNA
>> GENOMA DE RNA

Pesquisa de Citomegalovrus:
genoma de DNA
pode estar em pequena quantidade na amostra
>>> PCR-nested
alvo o gene MIE

Gene MIE do CMV

171601
171661
171721
171781
171841
171901
171961
172021
172081
172141

caagcgtcac
tccataaata
aatattttct
gccgccatgg
aactctatat
cgGGCCttag
agctccttaa
tacatgctct
tctaagatat
ttctcttccg

tagtgacctt
tgtgatcaat
gggcataagc
cctgactgca
tcctgtagca
cctgcagtgc
tacaagccat
gcatagttag
ctaaggcatt
tctgggtata

gtactcatta
gtgcgtgagc
cataatctca
gccattggtg
catatacatc
accccccaac
ccacatctcc
cccaatacac
ctgcaaacat
ttttttcagc

cacattgttt
accttgtctc
tcaggggagc
gtcttaggga
atctttctcc
ttgttagcGG
cgcttatcct
ttcatctcct
cctcccatca
atgtgctcct

ccacacatgt
tctcctcatc
actgaggcaa
aggctgagtt
taagttcatc
CGCCcttgct
caggtacaat
cgaaaggctc
tattaaaggc
tgattctatg

agtgaggata
caaaatctta
gttctgcagt
cttggtaaag
ctttttagca
cacatcatgc
gtagttctca
atgaacctta
gccagtgaat
ccgcaccatg

Amplificao do segmento do
gene MIE
A
amplificao feita em
duas reaes
consecutivas (nested-PCR) de acordo com a tcnica
padronizada no laboratrio (3).
Diagrama do Nested PCR para CMV
primer2

DNA alvo
primer1

primer4

1 PCR
Produto: 305pb
primer3

2 PCR
Produto: 146pb

305 pb
210 pb
146 pb

HCV >> 9 gentipos conhecidos

diferena entre gentipos: mutaes pontuais
genoma RNA
alta sensibilidade

DIAGNSTICO E TIPAGEM MOLECULAR:

PCR-NESTED / RFLP

RFLP para genotipagem de HCV

1

9 10 11

Perfil de restrio dos

diversos tipos de HCV
encontrados
1, 3, 5, 8,10: HinfI / BstNI
2, 4, 6, 9,11: RsaI / HaeIII
1, 2: tipo 1
3, 4: tipo 2
5, 6: tipo 3
8, 9: tipo 4
10,11: tipo 6
7: Marcador 25pb