TEHNICI MODERNE ÎN

BIOLOGIA CELULARĂ

Y
—TUDIUL PROCE—ELOR
CELULARE

2 aspecte:
Tehnici si metode adecvate de
urmă
urm ărire a fenomenelor celulare
Modelarea experimentală
experimentală a
fenomenelor celulare

i
MODALITĂŢI DE —TUDIU
1. °
°

2. °
°

3. °
°

v
MODALITĂŢI DE —TUDIU
°
° Ñ cand celulele sau organele ale carui
celule dorim sa le studiem sunt abordate in
organismul intact.

Avantaje: rezultatele obţinute sunt edificatoare

pentru procesul studiat la nivel de organism
Dezavantaje: rezultatele
rezultatele experimentelor sunt
dificil de interpretat datorită influen
influenţţelor
elor
celorlalte componente ale organismului

º
MODALITĂŢI DE —TUDIU
°
°
r cand organul de interes este

°
r
mentinut la locul sau in organism dar
sunt controlate unele influente cum
sunt cele nervoase sau endocrine

Avantaje: se pot studia variaţiile

procesului în condiţii controlate
Dezavantaje: nu se poate identifica
rezultatul cu cel în vivo
[
MODALITĂŢI DE —TUDIU

°
° r cand organul , ţesutul sau

celulele sunt izolate din organism
Avantaje: se permite un control
riguros al experimentului.
Dezavantaje: nu se poate garanta
obţinerea aceloraşi rezultate in
vivo.
 
Tehnici in vitro

Baia de organ

Cultura de celule

å
 Baia de organ
Ñ permite menţ
menţinerea viabilit
viabilităţ
ăţiiii unor
fragmente de organ sau ţesuturi.
Ñvariate în
în func
funcţţie de organul supus
experimentului
Ñ asigur
asigurăă o temperatura constant
constantă ă,
oxigenarea materialului biologic ,
posibilitatea controlă
controlării compozi
compoziţţiei mediului
din baie şi culegerea de date func funcţţionale şi
eşantioane
ü
Culturi de celule Ñ Etape
A Ô
    
a tesutului cu obtinerea

a
unei suspensii de celule
A ›  unei popu
populaţ
laţii celulare pure
A I
  în flacoane de cultură
cultură sau
plă
plăci Petri ob
obţţinâ
inându
nduÑÑse astfel o cultură
cultură
primară
primar ă

 
 resuspendarea celulelor din
A
 

cultura primara urmată

urmată de de
reî
reînsă
nsămânţarea în flacoane de cultură
cultură sau
plă
plăci Petri ob
obţţinâ
inându
nduÑÑse culturi secundare
secundare

Culturi celulare Ñ Evoluţie

1. 



 sau de inducţinducţie Ñ celulele
îş
îşii refac suprafaţ
suprafaţa şi se acomodează
acomodează
cu mediul de cultură
cultură
2. F

 °

  Ñ celulele se divid
rapid, exponenţ
exponenţial
3. 

 °   Ñ numă
umărrul de celule
rămâne constant. In aceast
această ă faz
fazăă se
efectuează
efectueaz ă pasarea
4. 


 
° Ñ sc scăăderea nr. de
celule datorită
datorită îmb
mbăătr
trâ
ânirii şi mor
morţţii .
Y
Medii de cultură Ñ
Componente
1. Amimoacizi şi vvitamine
itamine
2. —ăruri r necesare menţ
menţinerii echilibrului
ionic şi pH mediului de cultur
culturăă
3. Glucoza pentru necesarul energetic
4. —er fetal
5. Antibiotice
6. Rosu fenol ca indicator de pH

YY
1. M
°
°
 °
2. ° °
°


  ° 



 °°°
°
°
°
°
  °°°
 
  
°
° 
  
 °°
°
°
°
°°  °
  °  °
  
°°°
   °°
°
 

°
°




Yi

Ñ utilizează un  


. .
Ñ se stabileşte criteriul dupa care se va
efectua analiza,
analiza, precum şi limitele maximă
şi minimă ale acestuia
Ñ Rezultat: diferit
diferitee popula
populaţţii celulare.

Rezultatul analizei cantitative este afisat sub

forma unei histograme.

Yv
° °



Ñ permite analiza şi separarea celulelor
pe baza unor caractere morfologice şi
biochimice
Oferă
Ofer ă informa
informaţţii asupra :
1. mărimii relative a celulelor
2. granularităţ
granularităţiiii interne
(neomogenitatea internăinternă
citoplasmatică
citoplasmatic ă) relativ
relativăă
3. intensitatea relativă
relativă a fluorescen
fluorescenţţei.
Yº
° °


 ! °
° 
1. măsurarea caracteristicilor fizice ale
celulei
2. identificarea si separarea
populaţţiilor de celule sanguine (
popula
granulocite, monocite , limfocite T sau
B)
3. măsurarea cantitcantităţ
ăţiiii de AD
ADNN din
celulă
celulă
4. măsurarea cantitcantităţ
ăţiiii intracelulare
de Ca Y[

5. masurarea pHÑ pHÑului intracelular

° °
°



Y 
  ° 




Ñ tehnic
tehnică
ă ce permite izolarea
diferitelor elemente ultrastructurale
si biochimice ale celulelor

Yå
  ° 



!
 
 °

r
rdistrugerea
integrităţ
integrit ăţiiii tisulare şi apoi celulare cu
obţţinerea unei suspensii de organite
ob
şi membrane veziculate în mediul de
omogenizare

prin centrifugare şi/ sau

—   
prin
ultracentrifugare
Yü
"#$

a. prin 

°


° Diferen
Diferenţţa de
osmolaritate între mediul i.c. si cel e.c. duce
la umflarea celulelor pana la ruperea
membranelor.
b. prin 
  ° 
r

r presupune ruperea
membranelor sub acţ acţiunea undelor
ultrasonice
c. 
 °
  se realizeaza sub
acţţiunea forţ
ac forţelor de frecare şi torsiune care
contribuie la ruperea membranelor. Y
—%
A °  °

 r cand organitele se
depun la baza tubului , în ordinea
densităţ
densit ăţiiii lor prin centrifugari repetate
la forţ
forţe din ce în ce mai mari
A
 ° 

 °  rprintr printrÑÑo
singură
singur ă centrifugare la for forţţe suficient
de ridicate se obţ obţin organitele ca frac
fracţţii
separate .

i
   & &  &


 °  °





& °
 °
°



°!
' & 


& 

°°
& 
°

' &  ° 

  °& 

a   &
a ° °°


& 


' °
°



 °
„
  °


 °
áltr s ic r

°

 °



 °




&  °

iY
 ()"
Ñtehnica de investigare celulară
celulară ce permite
identificarea morfologică
morfologică şi ultrastructural
ultrastructuralăăa
unor compuş
compuşi radioactivi.

trasori radioactivi :
Ñ aminoacizi, glucide, nucleotide a

 

 

Ñ fosfat sau sulfat radioactiv





 
Ñ liganzi radioactivi specifici 


 

ii
)
*

+$
(#+$
#—(+
+

iv
+$
PRINCIPIU: particulele înc ncă
ărcate
electric migrează
migrează într
ntrÑÑun mediu
vâscos , sub ac
acţţiunea unui câ
câmp
electric.

Aplicaţii practice: studiul proteinelor şi a

acizilor nucleici.

iº
+$
%#+
a.  °° °

  , cand migrarea se
realizează
realizează în gel întrÑ
ntrÑo singu
singură direc
direcţţie
b. °° °

 , câ
când migrarea se
realizează
realizează succesiv în două
două direc
direcţţii

Aplicaţii practice r electroforeza

unidimensională
A —D— r PAGE
A FOCALIZAREA IZOELECTRICA
i[
ELECTROFOREZA —D—Ñ
PAGE
Ñrealizeaz
realizează
ă separarea proteinelor dintr
dintrÑÑ
un amestec pe baza gabaritului
molecular direct proporţ
proporţional cu masa
moleculară
moleculară.

Principiu: adsorb
Principiu: adsorbţţia dodecilsulfat
dodecilsulfatului
ului de
sodiu unitar pe proteine,
proteine, realiz
realizâând o
densitate de sarcină
sarcină negativ
negativăă
uniformă
uniform ă. i 
ELECTROFOREZA —D—Ñ
PAGE

iå

°

°

°
Ñ separarea proteinelor dintrÑ
dintrÑun amestec
se face pe baza punctului lor
izoelectric.

Principiu: migrarea prot

prote
einel
inelor
or în func
funcţţie
de punctul izoelectric, până în zona
cu pHÑ
pHÑul identic cu cel al punctului lor
izoelectric,, unde devin neutre oprindu
izoelectric oprinduÑÑ
şi miscarea. iü

°

°

°

*
°
 °


 

°

°

i




°° °

Ñmigrarea proteinelor în doudouăă direc

direcţţii :
1. in prima direcţ
direcţie în funcţ
funcţie de punctul lor
izoelectric Ñ FOCALIZARE IZOELECTRICA
2. a doua direcţ
direcţie Ñ —D— r PAGE , în
funcţţie de greutatea moleculară
func moleculară a
proteinelor.

Rezultatul se prezinta sub forma unei hărţi cu

proteinele separate în planul gelului.
v




°° °






 
°

°

—D—Ñ

vY
(#+$
Ñ o variantă
variantă a electroforezei ce combin
combinăă
migrarea în ccâ
âmp electric a proteinelor cu
realizarea unei reactii imune de tip Ag
AgÑÑAc

Reactia imuna:
imuna:
Ñdupa terminarea migrarii electroforetice,
Ñconcomitent (imunoelectroforeza în rachetrachetă)
ă) Ñ
apreciere cantitativă
cantitativă a Ag (= suprafaţa
suprafaţa
descrisă
descris ă de linia de precipitare cu linia de
start)).
start vi
(#+$

vv
#—(+

+
Ñmetod
metodăă de extragere a proteinelor
separate electroforetic dintrÑ
dintrÑun gel , cu
adsorbirea lor pe niste hâ
hârtii cu
proprietăţ
propriet ăţii speciale.

Proteinele suferă reac

reacţţii de
recunoaş
recunoa ştere specific
specificăă prin intermediul
unor interacţ
interacţiuni de tip receptor r
ligand sau Ag r Ac.
vº
Bloturile
Ñ Metodă de transfer a unor proteine,
secvente ADN sau ARN, dintrÑdintrÑun gel
electroforetic pe un suport care permite
vizualizarea lor ulterioară
Ñ Utilizate pentru identificarea prezenţei
unor proteine/ secvenţe ADN întrÑîntrÑun
lizat celular

v[
—outhern Blot
Ñ Utilizat pentru identificarea unei anumite
secvenţe ADN, prin folosirea unei probe
ce conţine secvenţa complementară
celei căutate.
Ñ Proba de hibridizare este marcată
fluorescent sau radiografic, permiţând
depistarea ulterioară a preparatelor care
conţin secvenţa căutată
v 
Northen Blot
Ñ Detectarea anumitor secvente de ARN
Ñ —imilară ca procedur㠗outhern Blot r
ului
Ñ Furnizează informaţii legate de
exprimarea anumitor gene în anumite
populaţii celulare

vå
Õestern Blot
Ñ identificarea unei anumite
proteine întrÑ
întrÑun omogenizat
tisular
ÑProteinele din preparat sunt
separate prin electroforeză în
gel, apoi transferate pe o
membrană suport unde, prin
adăugarea Ac specific, se va
identifica prezenţa/absenţa
proteinei sau cantitatea ei în
proba dată. vü
Õestern Blot
Utilizări:
A Cea mai folosită metodă pentru
determinare cantitativă de proteine
A Oferă informaţii legate de modificarea
cantitativă a unei proteine în funcţie de
tipul celular sau tratamentele aplicate
unei populaţii celulare

v
PCR (POLYMERA—E CHAIN
REACTION)
Ñ Folosită pentru obţinerea unui număr mare
de copii a unei anumite secvenţe de ADN
Etape
1. denaturarea ADN cu separarea catenelor
complementare
2. adaugarea primerilor (secvenţe ADN
complementare secvenţeiÑ
secvenţeiÑţintă)
3. sub acţiunea TaqÑ
TaqÑpolimerazei se
sintetizează noi secvenţe de ADN dc
º
ºY
RT r PCR (REVER—E
TRAN—CRIPTA—E PCR)

Ñ Metodă foarte sensibilă de detectare şi

cuantificare a ARNm
Ñ Iniţial din ARNÑ
ARNÑul ţintă se sintetizează
secvenţa cADN, apoi urmează etapele PCR
Ñ Utilizată în diagnosticul unor boli genetice,
cuantificarea expresiei diverselor gene prin
determinarea cantităţii de ARNm

ºi
Animale transgenice

Ñ Animale de laborator cărora li se inseră

gene mutante pentru a studia efectul lor
asupra organismului gazdă.
Ñ Mediu de studiu pentru evoluţia unor boli cu
determinism genic şi a opţiunilor terapeutice

ºv
Animale de laborator transgenice

ºº
Animale knockout
Ñ Înlocuirea genei de interes cu o genă
inactivă sau o alelă mutată
Ñ Animalul purtător nu va exprima
această genă, putânduÑ
putânduÑse studia efectul
absenţei ei in organism.

º[

° , ,


º