Bioseparaciones

Cromatografa
PRESENTADO POR: JUAN SEBASTIN BUSTOS

Introduccin

La mayora de los bioprocesos involucran al menos una

operacin cromatogrfica que frecuentemente es la
clave para la factibilidad tcnica del proceso de
separacin. Aunado a que es una operacin
relativamente cara, se debe tener un especial cuidado
en su escalamiento.

La cromatografa de lquidos ha sido ampliamente

explotada para llevar a cabo dichos anlisis debido a su
versatilidad. La resolucin de mezclas de protenas por
cromatografa de lquidos se basa en que bajo un
conjunto de condiciones especficas, los solutos
disueltos en una fase mvil interactan con una fase
estacionaria.

Que es la cromatografa?
En que consiste?

Qu es?
Lacromatografaes

un tipo de tcnica
aplicada para la separacin de varios
elementos que conjugan a unamezcla,
esta divisin se fundamenta en las
caractersticas fsicas y qumicas que
posea cada elemento.

En que Consiste?
A grandes rasgos la cromatografa consiste
en la la utilizacin de dos fases:una fase
mvil, el cual es una solucin que est
compuesta por distintos elementos; y una
fase estacionaria, esta se caracteriza por
ser unmaterial solidoque permanecer
sin cambios antes o despus de la
implementacin de latcnica

Fundamentos
El

principio de separacin que emplea

cada una de ellas.

Las caractersticas de las matrices que

utilizan.

La

presin a la que se operan.

La

relacin de equilibrio del sistema

cromatogrfico.

La

cintica de la adsorcin

Tipos de CromatografaBioseparaciones
1.

Cromatografa de Interaccin
hidrofbica (HIC)

2.

Cromatografa de intercambio inico

3.

Cromatografa de exclusin molecular

4.

Cromatografa de fase reversa

Cromatografa de Interaccin
hidrofbica (HIC)

La cromatografa de interaccin hidrofbica

(Hydrophobic Interaction Chromatography,
HIC) es uno de los mtodos de purificacin
de macromolculas biolgicas ms
utilizado, especialmente para protenas
terapeticas (Lienqueo y col., 2007; Mahn y
col., 2005). Los mecanismos de adsorcin
en el cual estn basados las interacciones
hidrofbicas de las moleculas con la fase
estacionaria fueron primeramente
demostradas por Tiselius en 1940 (Porath
1987).

Fase estacionaria o matriz. La fase estacionaria en HIC presenta

pequeos grupos no-polares unidos a estructuras de polmeros
hidroflicos. Por lo tanto, existen varios tipos de fases estacionarias en
HIC que pueden diferir en la naturaleza qumica del ligando, las
superficie o concentracin del ligando sobre el soporte y la naturaleza
qumica y el tamao de partcula del soporte base (Lienqueo y col.,
2007; Queiroz y col., 2001). En laTabla 3se muestran algunas de las
matrices comerciales disponibles (OTanell 2008).

La unin y/o la elucin en HIC son logradas por la adicin o

remocin de sales u otros solutos. La estructura formada por las
sales aumenta la fuerza de las interacciones hidrofobicas

Cromatografa de intercambio
inico

La cromatografa de intercambio
inico (Ion Exchange
Chromatography, IEC) separa las
molculas en base a su carga
ionica neta. La separacin se lleva
a cabo por la competencia entre
protenas con diferente carga
superficial por grupos cargados
opuestamente sobre un
adsorbente o una matriz de
intercambio icnico. Actualmente,
IEC es una de las tcnicas de
purificacin de protenas ms
usadas.

Fase estacionaria o matriz. La eleccin de una matriz de

intercambio inico adecuada es probablemente uno de los
aspectos ms importantes y debe estar basada en diversos
factores, que incluyen los siguientes: 1) la fuerza del
intercambiador de iones, 2) el flujo y/o volumen de muestra y 3)
las propiedades de la muestra. Como se mencion anteriormente
y como se muestra en laTabla 2, los grupos funcionales de
intercambio inico pueden caer dentro de dos categoras

Fase mvil . Varios factores son importantes en la seleccin de la

fase mvil , que pueden incluir: 1) la carga del buffer, 2) la fuerza
ionica del buffer y 3) el pH. El buffer de tris es utilizado con
intercambiadores DEAE, mientras que los buffers de fosfatos y
acetatos son frecuentemente utilizados con intercambiadores CM

Cromatografa de exclusin
molecular

La cromatografa de exclusin molecular (Size Exclusin

Chromatography, SEC) es el nombre general para los procesos de
separacin de biomolculas de acuerdo a su tamao cuando una
solucin fluye a travs de una cama empacada con un medio
poroso (Irvine 1997; Kostanski y col., 2004)

Para la separacin en SEC, se utilizan las propiedades de tamiz

molecular de una variedad de materiales porosos. El proceso de
separacin depende del tamao y el volumen hidrodinmico
(volumen que ocupa una molcula en solucin), el cual define la
capacidad de la molcula de penetrar o no en los poros de la fase
estacionaria.

Fase estacionaria o matriz. Un amplio rango de

matrices preparativas y analticas esta disponible
comercialmente, en laTabla 1se muestran
algunas de las matrices preparativas ms
utilizadas en la separacin de protenas. Las
matrices preparativas ms usadas son
frecuentemente de polmero naturales como
agarosa o dextrano, pero tambin pueden estar
compuestas por poliacrilamida (Cutler, 2008;
Hagel, 2011).

Fase mvil . En contraste con otros tipos de cromatografa, la

selectividad de una matriz de SEC no se puede ajustar
cambiando la composicin de la fase mvil . Las matrices de SEC
tienden a ser compatibles con muchos buffers acuosos; incluso
en la presencia de surfactantes, agentes reductores o agentes
desnaturalizantes

Cromatografa de fase reversa

La cromatografa de fase reversa (Reversed Phase

Chromatography, RPC) describe un tipo de cromatografa en la
cual la fase estacionaria es menos polar que la fase mvil . La
RPC es una tcnica de purificacin capaz de separar
componentes con caractersticas muy similares, como protenas
que difieren en solo un aminoacido e isomeros conformacionales
de pptidos (de Collongue-Poyet y col., 1995; McNay y Fernandez
2001). Sin embargo, el valor de la RPC puede estar limitado por
diversos factores, como el uso de solventes y su disposicin final
as como a los bajos porcentajes de recuperacin debidos a los
cambios conformacionales ocasionados por las interacciones
envueltas en el proceso (McNay y Fernandez 2001; Sokol y col.,
2003).

Fase estacionaria. Hay dos tipos

principales de medios para RPC, uno
basado en una matriz hidroflica de perlas
de slice cubierta con una fase hidrofbica
unidos por cadenas de carbono
(hidrocarburos normalmente n-alquilo o
aromticos), y otro basado en una matriz
de polmero hidrofobico. Las matrices de
alta porosidad proporcionan una superficie
interna de alta capacidad de unin.

Fase mvil . La retencin hidrofbica del

soluto en la fase estacionaria puede
disminuirse aadiendo un disolvente
organico a la fase mvil acuosa. Al
disminuir la polaridad de la fase mvil, la
distribucin de los solutos cambia hacia la
fase mvil . Los dos solventes ms
utilizados son el acetonitrilo y el metanol,
siendo el acetonitrilo la opcin ms
popular

Ventajas y desventajas

Ventajas:

1.

Es evidente que la cromatografa es un poderoso metodo de

separacin y anlisis de protenas

2.

Son claras sus ventajas en la purificacin de protenas,

particularmente las de inters farmacutico

3.

La cromatografa ha sido utilizada con xito para determinar

cambios conformacionales y estabilidad en protenas, que
adems pueden ser correlacionados con los mtodos
tradicionales; como fluorescencia

Desventajas:

1.

Es importante considerar que la versatilidad de las tcnicas

cromatogrficas genera un sin nmero de condiciones
experimentales, que pueden depender de las caractersticas de
cada protena

2.

Alto costo de capital

3.

Operaciones de alto costo

4.

Baja recuperacion del producto

Tendencias

Con el advenimiento de los procesos de bioseparacion por

membrana y otros nuevos tipos de separacin. El uso de de
nuevas tcnicas puede reducir significativamente el numero de
pasos necesarios para la bioseparacion. Algunas de las nuevas
tendencias son :

Cromatografa de membrana y un monolito

Ampliado de la cromatografa de cama

Cromatografa de alta resolucin de ultrafiltracin

BioseparationsHybrid

Referencias
Antonio-Prez,

A., Ramn-Luing, L.A. y Ortega-Lpez, J. (2012).

Chromatographic refolding of rhodanese and lysozyme assisted by the GroEL
apical domain, DsbA and DsbC immobilized on cellulose.Journal of
ChromatographyA 1248,122-129. [Links]
Corbett, R.J.T. y Roche, R.S. (1984). Use of high-speed size-exclusin
chromatography for the study of protein folding andstability.
Biochemistry23,1888-1894. [Links]
Cummins, P.M., Dowling, O. y O'Connor, B.F. (2011).Ion-Exchange
Chromatography: Basic Principles and Application to the Partial Purification of
Soluble Mammalian Prolyl Oligopeptidase Protein Chromatography. In: Walls
D, Loughran ST, editors: Humana Press. p 215-228. [Links]
Cutler, P. (2008).Size-Exclusin Chromatography Molecular Biomethods
Handbook. In: Walker JM, Rapley R, editors: Humana Press. p 719729.
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