Ingeniera Bioqumica II

Exposicin Oral de Publicacin

Cientfica
04 de Junio de 2016

Ctedra: Ingeniera Bioqumica II

Docente: Alejandra Cardillo
Ao: 2016
Autores:

Javier Rocha Martn;

Guisan; Fernando Lpez-Gallego.

Jos

Publicacin: Inmobilizing Systems

Biocatalysis for the Selective Oxidation of

Glycerol Coupled to In Situ Cofactor
Recycling and Hydrogen Peroxide
Elimination (2015)

Resumen
El empleo de cascadas qumicas sintticas

empleando sistemas multienzimticos, por

homologa con las redes metablicas in vivo,
presenta un inters creciente en las
biotransformaciones industriales.
No obstante, las enzimas presentan desventajas

como la inhibicin por sustratos, productos u otras

sustancias presentes en el aducto a procesar que,
debido a sus efectos sobre la actividad,
selectividad y/o estabilidad del catalizador, tienden
a limitar sus aplicaciones prcticas.

Resumen
Entre

las alternativas para mejorar la

aplicabilidad de los sistemas enzimticos se
incluyen la ingeniera enzimtica (reduciendo
la susceptibilidad a inhibidores por mutaciones
puntuales) y la inmovilizacin en soporte slido
(garantizando su estabilidad, reusabilidad ,
etc).

En el presente trabajo se investig el proceso

de
conversin
de
glicerol
a
1,3dihidroxiacetona (DHA) acoplado al reciclaje de
la coenzima NAD(H) y a la eliminacin del
perxido de hidrgeno, una cascada de
reacciones redox catalizada por tres enzimas
coinmovilizadas en la misma matriz.
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Resumen
Las enzimas empleadas son la glicerol

deshidrogenasa (GlyDH) de Geobacillus

Stearothermophilus, la NADH oxidasa
(NOX) de Thermus thermophilus y la
catalasa de hgado bovino (CAT).

Resumen
No existiendo una qumica superficial universal

para la inmovilizacin, el soporte slido debi

ser activado con grupos amino y aldehdo. En
particular, se activaron partculas de agarosa
(Ag-AG), tratadas post inmovilizacin con
aldehdos de dextrano para mejorar la
estabilidad multimrica.

La coinmovilizacin en relaciones de actividad

ptimas entre la terna de enzimas y la

modificacin de la GlyDH para reducir el efecto
de la inhibicin por DHA (el paso limitante en la
cascada) permitieron incrementar ampliamente
el rendimiento de la reaccin.

Resultados y discusin
1. Relacin ptima de actividades del
sistema
Se experiment con diversos ratios de
actividad GlyDH/NOX y CAT/GlyDH a
actividad de NOX constante (ratio ptimo
250:4:1):

Resultados y discusin
1. Relacin ptima de actividades del
sistema
Para el ratio ptimo de actividades el rendimeinto en

DHA se incrementa principalmente por la

disponibilidad de coenzima NAD+ reciclada (por accin
de la NOX) y ausencia de H2O2 (por accin de la CAT).

No obstante el aumento observado en el rendimiento,

ste nunca result mayor al 15% del valor terico. Esto

se debe a la fuerte inhibicin por producto de la GlyDH,
el cual resulta el paso controlante en la cintica del
sistema multienzimtico.

Resultados y discusin
2. Inhibicin mitigada por ingeniera
enzimtica

La estructura de rayos X y estudios cinticos

en la GlyDH de Geobacillus s. permiti predecir
racionalmente los residuos potencialmente
involucrados en la unin del DHA.

Luego de un anlisis con el algoritmo

COREX/BES, los residuos H271, H270, E268, y

K97 presentaron bajos factores de estabilidad,
indicando alta flexibilidad. Esto parece indicar
que la regin que los contiene es susceptible
de cambios conformacionales disparados por la
unin del sustrato (glicerol) o del inhibidor
(DHA).
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Resultados y discusin
2. Inhibicin mitigada por ingeniera
enzimtica
Para demostrar la hiptesis, se sintetizaron
5 mutantes diferentes, K22Q, K97Q, E268Q,
H270P, y H271P, con objeto de eliminar
cualquier interaccin entre estos residuos y
el DHA. Resultados de actividad especfica y
la media concentracin inhibitoria mxima
respecto del DHA:

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Resultados y discusin
2. Inhibicin mitigada por ingeniera
enzimtica

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Resultados y discusin
2. Inhibicin mitigada por ingeniera
enzimtica

En el mutante K97Q se observ una actividad

enzimtica con clara reduccin de la inhibicin por
producto, lo cual indica que la GlyDH-K97Q se liga
a la coenzima redox (NAD+) pero evita la unin al
DHA.

El acoplamiento de la GlyDH-K97Q con la NOX y la

CAT en solucin redundaron en una concentracin

final de DHA 100% superior y una productividad
mxima del 180% respecto de los
correspondientes a la enzima wild type. As, se
logr reducir la sensibilidad a DHA de la enzima
por mutagnesis dirigida a los residuos indicados
por los estudios in silico de la superficie proteica.
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Resultados y discusin
2. Inhibicin mitigada por ingeniera
enzimtica

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Resultados y discusin
3. Efecto de la inmovilizacin y cross-linking
A los efectos de comparar los rendimientos y

productividades de las diferentes estrategias, se

realizaron sendas corridas de 9 h tanto de las
enzimas solubilizadas como inmovilizadas, en este
ltimo caso ya sea con las tres enzimas en
soportes separados de agarosa activada o en la
misma matriz, y tanto para la GlyDH wild type
como la variedad mutante K97Q.
Los resultados muestran incrementos debidos a la

inmovilizacin y el cross-linking posterior, dado

que se minimiza la inhibicin por producto y se
evita la disociacin de subunidades (ya que las
tres enzimas son multimricas).
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Resultados y discusin
3. Efecto de la inmovilizacin y cross-linking

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Resultados y discusin
3. Efecto de la inmovilizacin y cross-linking
Para los casos de co-inmovilizacin de la GlyDH-

K97Q, NOX y CAT, la estrategia fue secuencial. En

primer lugar, se realiz la adsorcin innica de la
GlyDH-K97Q a pH 7 por medio de los grupos
aminos presentes en la superficie de la Ag-AG;
luego la CAT fue inmovilizada covalentemente a pH
10 a travs de los grupos aldehdo superficiales, y
finalmente se inmoviliz covalentemente la NOC
bajo las mismas condiciones que a la CAT (y por
ende bajo las mismas reacciones).
Por ltimo, la GlyDH-K97Q adsorbida se uni

covalentemente a la superficie como consecuencia

de una incubacin alcalina.
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Resultados y discusin
3. Efecto de la inmovilizacin y cross-linking
Los autores sugieren que la eliminacin in situ

del H2O2 por la CAT genera O2 dentro de la

microestructura de agarosa, lo cual acelerara
la frecuencia de reciclaje de NAD+ al activar la
NOX, incrementando el TTN (Total Turnover
Number) del sistema.
Del mismo modo, la eliminacin completa de

H2O2 evitara la inactivacin de la GlyDH por

oxidacin y, del mismo modo, la oxidacin
inespecfica de la DHA que reduce
dramticamente bajo otras estrategias el
rendimiento de la biotransformacin.
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Resultados y discusin
3. Efecto de la inmovilizacin y cross-linking

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Discusin
El esquema estudiado constituye una plataforma

libre de clulas basado en un sistema

trienzimtico, en el cual el paso controlante de la
reaccin global se encuentra en la inhibicin del
primer eslabn de la cascada.
El efecto combinado de la ingeniera proteica y el
uso de tcnicas de coinmovilizacin en soporte
activado y sujeto a cross-linking ulterior permiti
mejorar al menos 5 veces el rendimiento. El
biocatalizador heterogneo produjo hasta 9,5 mM
de DHA en las experiencias realizadas, 18 veces
mayor al valor para la GlyDH aislada y en solucin
homognea.
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MUCHAS
GRACIAS!