Microscopie fluorescenta

Principii si consideratii practice

Boiciuc Andreea

Pentru ce este aceasta prezentare?

int: oamenii care folosesc un microscop cu
fluorescen
dar nu tiu cum funcioneaz
Punct de interes:de a oferi informatii generale
Scop: sa imbunatatesti imaginile din laborator
NOT for microscope enthusiasts !

Microscopie fluorescenta
Excitarea si observarea moleculelor fluorescente
Cele mai comune tehnici microscopice
High resolution, sensitive with low background, multi-channel

Cu variatii.
deconvoluie, OMX, deltavision
confocal, disc de filare, doi fotoni
TIRF, FRAP, FRET, Flim, iFRAP, FCS ...
PALM, STED, STORM, SIM, (super-rezoluie)

Ce poti sa faci cu un microscop de fluorescenta?

Exemplu :
Se determina localizarea a unor proteine specifice
Forma unor organe, celule, structuri intracelulare
Se examineaza dinamica proteinelor
Se studiaza interactiunea proteinelor si conformatia acestora
Se examineaza concentratia ionilor

Principiul microscopiei de fluorescenta

cum functioneaza un microscop cu
fluorescenta?

upright microscope light path

upright microscope light path

Camera

Filter cube

Objective lens
sample

Lamp

Arc cu lampa
Lampa cu mercur
gas

Lampa xenon

High voltage

Pentru a obtine o iluminare uniforma

mirror

"Centrarea sau aliniere"

(Ambele lampa si oglinda)
= Koeller illumination
lentila obiectivului functioneaza ca un condensator

Lamp House

(eliminarea obiectelor sa privesti planul focal din spate)

Sample plane
(=plan focal)

illumination plane
(plan focal spate)

Lasers
= Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
Used for confocal microscopy or FRAP etc.
Property of light from lasers
High intensity
uniform wavelength, phase, polarity
can be tightly focused

Gas
HeNe, Argon, Krypton

Pumping energy
Gas or solid

Solid diode
100% mirror

99% mirror

Filtrele
nucleul microscopiei cu fluorescenta

Filtrul cub contine 3 filtre

Filtru excitare

camera

Transmission
(%)

Filtru emisie
Filtru excitare

wave length (nm)

Oglinda dicroica
Oglinda dicroica

lampa
Filtru emisie

proba

Rotile filtrului sunt folosite adesea

pentru viteza
Excitare filtru

camera

Transmission
(%)

Emisie rota filtru

wave length (nm)

Oglinda dicroica
Oglinda dicroica

lampa
Emisie filtru
Excitare roat filtru

proba

1 wheel+ multiband pass filter

Excitare filtru

camera

Transmission
(%)
wave length (nm)

Oglinda dicroica
Oglinda dicroica

lampa
Emisie filtru
Excitare filtru roata

proba

Propietatile filtrului
Long pass (LP) filter

LP500

500nm

Band pass (BP) filter

BP500-530 or BP515/30

Short pass (SP) filter

500 530nm
Multiband pass filter

Obiectiv lentile
Information on the side
Correction
Magnification/NA
Phase contrast or DIC

Plan Apochromat
60X/1.40 Oil
Ph3
Immersion media
/0.17

Tube length / coverslip thickness

grosisment/apertura numerica(NA)

Rezolutie: propotional 1/NA

Luminozitate : propotional (NA)4 / (grosisment)2

Ideal lense

Corectie aberatie optica

Spherical aberration

Aberatie sferica
Aberatie cromatica
Cea mai
buna
corectie

Achromat
Fluorite
Apochromat

Chromatic aberration

Curbarea planului
Curveture of field
Planul apocromat este cel mai bine corectat

Alte consideratii ale corectiei

Proba groasa
Not corrected for this signal
Corrected for this signal
Immersion medium

objective
Utilizati un obiectiv de apa-imersiune (pentru probele vii)
Utilizati ulei de imersie cu diferite indice de refractie
Utilizati un obiectiv cu o lentila interna mobila.

Lipsa de inregistrare
Lumina cu lungimi de unda diferite, din acelasi punct
nu se concentreaza pe acelasi loc

Poate fi cauzata de
filtrul obiectivului
de lentile

Detectori
Ochi
Film
PMT (photo multiplier tube)
fara spatiu de informatie
rezolutie foarte mare de timp
folosit pentru scanare confocala

CCD (charge coupled devise) camera

spatiu de informatie
rezolutie mica de timp
foarte sensibil
(quantum efficiency: >70% vs 25% (PMT), 2% (film))

CCD camera functionare

foton
-

- -

Genereaza si acumuleaza sarcina ca raspuns la foton

sarcina este proportionala cu numarul de fotoni
poate atinge o sensibilitate ridicata la expundere de durata
Citirea prin transferarea sarcinii da la 1 pixel la altul
descarcare lenta

1,000

1,000

Amplifier

Analog-digital
converter
..
0111
1
0
1
001

A
computer

Propietati CCD camera

Resolution

pixel size

Field size

pixel number x size

Time resolution read-out rate (Hz)

Dynamic range bit (12,14 etc), full well capacity
Sensitivity

quantum efficiency (wave-length dependent),

"back-thinned" (QE >90%)

Noise

cooling temperature

Monochrome vs colour
Camera color este in general
Mai putin sensibila,dar mai scumpa

Front illuminated

light
electrode

silicon

Back
elluminated,
Back-thinned

Reducerea zgomotului produs: on-chip

amplification
Zgomot intunecat: semnificativ la expunere indelungata.
poate fi redus prin racirea chipului (-50, -70oC)
Zgomot de citire: semnificativ la semnal slab
poate fi redus prin citire lenta, on-chip amplification
Camera with on-chip amplification: EMCCD, EBCCD, iCCD
(zgomot redus de citire,rata mare de citire)

EMCCD (Electron multiplying CCD)

1,000

1,000
Amplifier

On-chip amplifier

Analog-digital
converter
1..
1011
0
1
1
00

--

---

noisy, slow

A
computer

functii utile CCD camera

Binning

no binning

2x binning

sensitivity
readout rate
resolution

Subarray readout
full readout

subarray readout
500

500

1,000

1,000

readout rate
field size

champagne
adrenalina

Coca-cola

Dry martini

martini

Pina colada

Red wine

tequila

Vodka and tonic

vodka

whiskey