VALORACIN

MICROBIOLGICA DE
VITAMINA B12 (MGA 965)
BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
CONTROL DE FORMAS FARMACUTICAS
PROFESOR: CESAR TECOZAUTLA
ALUMNO: ARTURO DE LA ROSA BARRALES

GENERALIDADES DEL MTODO:

Este mtodo se basa en la cuantificacin de cianocobalamina utilizando

Lactobacillus leichmannii ATCC 7830, microorganismo que no puede sintetizar esta
vitamina, relacionado directamente el crecimiento celular con la concentracin de
vitamina presente en la muestra.

SOLUCIN DE REFERENCIA DE
CIANOCOBALAMINA
Solucin de referencia
concentrada de cianocobalamina
Diluir con EtOH al 25% hasta
obtener 1g de vitamina B12/mL
(se coloca en envase protegido
de la luz con tolueno que cubra
la superficie y en refrigeracin)

Solucin de referencia
de trabajo
El da de la prueba, con
agua destilada preparar la
solucin que contenga una
concentracin entre 0.01 y
0.04ng/mL de
cianocobalamina
(lo recomendable son 0.02ng/mL)

MEDIOS Y SOLUCIONES
Pueden utilizarse mezclas deshidratadas que contengan los ingredientes
mencionados, siempre que al reconstituirse siguiendo las instrucciones del
fabricante se obtengan resultados comparables con los de las formulas que aqu se
indican.
1.- kits
2.- Preparacin de medio en el laboratorio
Medio base concentrado
Medio de cultivo
Medio para suspensin
Medio de cultivo para Lactobacillus leichmannii

MEDIO BASE
CONCENTRADO

L-cistina

0.1 g

L-triptfano

0.05 g

Solucin de acido clordrico 1 N 10mL

Solucin de adenina-guanina-uracilo
Solucin de xantina

5mL

5mL

Solucin de vitaminas I 10 mL
Solucin de vitaminas II10mL
Solucin salina A

5mL

Solucin salina B

5mL

Solucion de L-asparagina

5mL

Solucion de hidrolizado acido de casena

Agua

100mL

Glucosa anhidra

10 g

Acetato de sodio anhidro

5g

Acido ascrbico 1 g
Solucin de polisorbato 80
Aforar 250mL

5mL

Solucin salina B.
Solucin de Xantina.
Solucion
de
LSuspender
0.20 g de xantina
Solucin de vitaminas
I.
Disolver
Solucin
de
vitaminas
II.
en
30
a
40
mL
de
agua,
Solucin
de
hidrolizado
acido
de
asparagina.
Solucin de adeninacasena.
calentar
a no
mas dede
70C,
-4.0 g de
sulfato

guanina-uracilo.
-10 mg
de riboflavina
Solucin
salina A.
magnesio
-10 mg de clorhidrato de tiamina
Disolver
-0.20 g de cloruro de sodio
-100 g de biotina
-0.20 g de su1fato ferroso
-20 mg de niacina
enfriar
y
llevar
al
aforo
a
200
-0.20
g
de
sulfato
de
-Sulfato
de
adenina
-40
mg
de
cloridrato
de piridoxal
-2.0
de
L-asparagina
en
-Solucin
de
acido
actico
glacial
Disolver
la
pasta
en
agua,
ajustar
la solucin
con
-10
ggde
fosfato
de
potasio
monobsico
mL.
manganeso
hidrxido
de
sodio 1.0 N ade
pH
de
3.5 0.1 y llevar al
mg
de
clorhidrato
de
piridoxamina
-Clorhidrato
guanina
25 mL -8
-10
g
de
fosfato
de
potasio
dibsico
0.02
N
aforo a 1 000
mL con agua. bajo tolueno en
agua
Almacenar
-En
agua
yuracilo
llevar
al mL.
aforo
a
dihidratada
Anadir
20-Clorhidrato
gy
de llevar
carbn activado,
agitar
1hy
-En
agua
aldeaforo
a durante
200
refrigerador.
filtrar.
Repetir
el tratamiento
con
carbn
activado.
-2-Aadir
mg
de
acido
flico
en
etano1
(1 :4)
200
mL.
llevar
al
aforo
a
200
Enfriar
y
llevar
al
aforo
amL
200
mL, y
dos
gotas
de
cido
clorhdrico
Aforar a 400 mL con a misma solucin.
Mezclar adicionar 6.0 mL de una
Disolver
-100 g deCon
casena
libre de
ayuda
devitamina
calor disolver en 10
solucin
de
hidrxido
-500mg
mL mL
de
solucin
de paraminobenzoico
acido
clorhdrico
6.0de
NY
-200
de
acido
de
una
solucin
de acido
Se pone aamonio
reflujo durante
8 aN
12yh.agitar hasta
6.0
-10
mg
de
pantotenato
de
calcio
clorhdrico
4.0
N
en 200
mg
cada
Separar por rotavapor el acido clorhdrico
de
la de
mezcla
Disolver
que
elpasta
solido
disuelva,
una
de
las
siguientes
sustancias:
una
espesa.
-40hasta
mgobtener
de
cloridrato
desepiridoxina

Adicionar unos mililitros de tolueno y guardar en

Agregar
dos
gotas
acido
almacenar
bajo
tolueno
en
un
refrigeracion
a bajo
una temperatura
node
mayor
de
almacenar
Almacenar
bajo
tolueno
tolueno.
protegida
de10C.
Ia luz,
Llevar
al
aforo
a
400
mL.
clorhdrico
y almacenar se
bajo
refrigerador.
Si
durante
el
tiempo de almacenamiento
forma un
refrigerador.
Almacenar
protegida
de la luz en refrigerador.
precipitado,
filtrar.
tolueno.

Almacenar bajo tolueno en un

en

MEDIO DE CULTIVO
Disolver
60 a 70 mL de agua
0.75 g de extracto de levadura soluble en agua destilada.
0.75 g de peptona desecada
1.0 g de glucosa anhidra
0.20 g de fosfato dibsico de potasio.
Adicionar 10 mL de la preparacin de jugo de jitomate
1.0 mL de solucin de polisorbato 80.
Ajustar el pH a 6.8 con solucin de hidrxido de sodio 1.0 N
Aforar a 100 mL con agua.
Envasar en tubos de ensayo I 0 mL y tapar con algodn.
Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Enfriar tan rpido como sea posible para evitar
formacion de color debido al sobrecalentamiento del medio.

MEDIO PARA SUSPENSIN

Diluir un volumen conocido del Medio base concentrado con igual volumen de agua
destilada.
Envasar 10 mL en tubos de ensayo. Esterilizar y enfriar como se indica en medio de
cultivo.

MEDIO DE CULTIVO PARA LACTOBACILLUS

LEICHMANNII

A 100 mL de Medio de cultivo agregar de 1.0 a 1.5 g de agar, calentar en un BV con

agitacin hasta que se disuelva el agar.
Colocar 10 mL de la solucin caliente en tubos de ensayo y tapar los tubos.
Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min y enfriar en posicin vertical.