Sunteți pe pagina 1din 66

Laboratorul de microbiologie

organizare, funcii. Prezentarea


echipamentelor, dispozitivelor,
materialelor de laborator. Msuri de
protecie a muncii n laboratorul de
microbiologie. Metode de sterilizare i
dezinfecie. Controlul sterilizrii. Tehnici
elementare de lucru n laboratorul de
microbiologie. Diagnosticul de
laborator n microbiologie schema
general. Diagnosticul bacteriologic
(direct).
Prezentarea echipamentelor,
dispozitivelor, materialelor de laborator.
Microscoape, lupe si truse de coloratii
Termostate si bai de apa
Frigidere, centrifugi, balante
Mojare, agitatoare,fotometre, colorimetre
Distribuitoare pt medii de cultura
Aparate pt sterilizare si dezinfectie
Sticlarie, containere pt deseuri
Inventar de material si plastic
Trepiede, site de asbest,
Stelaje, becuri Bunsen, anse bacteriologice,
diferite tampoane
7
E NECESAR MEDIU LICHID DE TRANSP

Inoqula;
WASP
Biomeriux Bact/Alert
BD FX
touch screen technology asemanatoare cu cea
folosita la Ipads, permite vizualizarea coloniilor
in incubatoare!
Microbiology Laboratory
Safety and Rules
Clean up spills and pick up any
dropped items immediately
Record everything in your lab
notebook
Reguli de protecie a muncii n
laboratorul de microbiologie
n laboratorul de microbiologie se lucreaz
cu material infecios
Pentru a preveni rspndirea germenilor din materialul infecios,
precum si pentru a evita suprainfectarea acestor materiale cu
germeni strini, trebuie respectate anumite reguli de ordine
interioar:

Este strict interzis accesul persoanelor strine n


laborator
Intrarea n laborator si participarea la lucrrile practice se va
face numai dup audierea si nsusirea regulilor de
protecie a muncii (dovedit prin semntur pe un proces
verbal)
Intrarea n laboratorul de microbiologie necesit purtarea
obligatorie a echipamentului de protecie (halat cu mneci
lungi). Se recomand ca echipamentul de protecie s fie
pstrat separat de hainele utilizate n exterior.
Toate produsele biologice vor fi considerate ca potenial
infectante
Consumarea de alimente si buturi, ducerea minilor la
fa n timpul lucrului, fumatul n laborator sunt strict
interzise.
Este interzis introducerea n gur a oricrui obiect din laborator
Este interzis aducerea n laborator a obiectelor de uz
personal

hainele, servietele, genile, vor fi lsate pe ultima banca


este permis aducerea n laborator a materialelor de scris si a
lucrurilor de valoare, acestea din urm fiind asezate n laborator n
locuri special amenajate.

Este interzis intrarea n laborator n lipsa unui cadru


didactic
Nu este permis fuga sau mersul rapid prin laborator
Lucrul n laboratorul de microbiologie implic contact cu material
infecios! Pentru a preveni accidentele de lucru, este necesar
urmarea strict a metodelor de lucru si a regulilor de dezinfecie si
antisepsie:
1. nsmnrile se fac la flacr, flambndu-se gtul recipientelor la deschidere
si la nchidere
2. ansa si acul de platin se sterilizeaz nainte si dup folosire prin nclzire la
rosu, iar portansa se va flamba
3. pipetele si lamele de sticl contaminate nu se vor decontamina la flacr, ci
se scufund dup folosire n recipiente cu soluie dezinfectant existente la
mijlocul fiecrei mese. Tot n aceste recipiente se vor introduce lamele si
lamelele de sticl folosite
4. pipetarea cu gura este interzis. n vederea pipetrii se vor folosi dispozitive
de pipetare adecvate
5. cutiile Petri, eprubetele, sau alte recipiente si materialele contaminate se
introduc dup lucru n gleata de infecte care va fi autoclavat
6. atenie la manipularea substanelor caustice si inflamabile

In cazul rspndirii accidentale a materialului infecios, va fi anunat cadrul


didactic care conduce lucrrile si care va indica msurile de dezinfecie
Dup terminarea lucrului minile se spal
cu ap cald si spun.

Fiecare student are obligaia de a-si


supraveghea spaiul de lucru, pstrnd
ordinea si curenia:

fiecare student si va alege locul de lucru la


nceputul primei lucrri practice, loc pe care si-l
va pstra pn la ncheierea semestrului/anului
universitar
orice alterare existent a zonei de lucru va fi
consemnat cadrului didactic la nceputul lucrrii
practice
STERILIZAREA SI DEZINFECTIA
Definitii:
DECONTAMINARE: reducerea numrului de germeni
de pe un obiect sau dintr-o substan pn
la 0, poate fi efectuat prin mai multe metode:

1.ANTISEPSIE: decontaminarea tegumentelor si


mucoaselor cu ajutorul unor substane chimice
antiseptice bacteriostatice (netoxice pentru tegument):
alcool etilic 70, tinctur de iod 5%, detergeni cationici.
Distruge doar formele vegetative

2.DEZINFECIE: distrugerea patogenilor (mai puin a


sporilor) de pe suprafee, din aer, cu ajutorul unor
substane chimice dezinfectante bactericide (toxice
pentru esuturi vii): fenoli, formol. mpiedic rspndirea
bolilor infecioase.
Definitii:
STERILIZARE: distrugerea sau ndeprtarea tuturor
formelor vii (inclusiv spori)

ASEPSIE: absena patogenilor meninerea sterilitii


presupune aplicarea tehnicilor aseptice pentru a
mpiedica ptrunderea microbilor ntr-un substrat steril.

SANITIZARE msuri pentru asigurarea sntii


publice

PREZERVARE, CONSERVARE - pstrarea viabilitii


microorganismelor o durat variabil de timp

CURAT lipsit de murdrie organic/anorganic (fr


referire la microorganisme)
Metode de decontaminare

Metodele se aleg n funcie de


situaia practic. (materialele care
urmeaz a fi tratate sunt
termostabile/ termorezistente,
etc. ?)

Nu toate metodele de
decontaminare sunt si metode de
sterilizare!
STERILIZAREA DEZINFECTIA /
ANTISEPSIA

Agenti fizici:
Caldura
Agenti chimici:
Frigul
Desicarea Substante chimice
Radiatiile
elementare
Ultrasunetele
Compusi anorganici
Presiunea
Compusi organici
mecanica
Presiunea
osmotica
STERILIZAREA PRIN CALDURA
I. Cldura

a. Cldura uscat:

-. nclzirea la rosu ansa de platin


(aducere la incandescenta)
nclzirea la rosu
I. Cldura
a. Cldura uscat:

- Flambare completarea sterilizrii trecerea obiectului


prin flacr (gura eprubetelor, flacoanelor, partea
efilata a pipetelor Pasteur etc.).

-. Incinerarea arderea cu reducere la cenus (pentru


materialele infectate care nu se recupereaza)
indicaii: materiale dispozabile din plastic, reziduuri
organice solide, Siringi de unica folosinta, Pansamente,
Animale de experiente, Deseuri biologice rezultate
din laboratoarele de microbiologie
Incinerare
- Sterilizarea prin aer cald mecanismul
distrugerii bacteriilor prin caldura uscata
consta in:
accelerarea fenomenului de oxido reducere
coagulare
carbonizare.

indicaii: sticlrie de laborator, vase din porelan,


instrumentar chirurgical, pulberi termostabile
contraindicaii: soluii apoase, obiecte din cauciuc,
plastic, esturi si vat din bumbac sau fibr sintetic,
materialele contaminate din laborator
se realizeaz n etuv (cuptorul cu aer cald,
ETUVA,PUPINEL)
180C 1h
STERILIZAREA PRIN CALDURA USCATA CUPTOARE CU
AER CALD (ETUVE)

Formele vegetative ale bacteriilor sunt


distruse prin caldura uscata in 10 minute
la 60 80 C.
Sporii cei mai rezistenti de B.
stearotermophilus
in 20 minute la 180 C.
1 ora 180 C
Cuptorul cu
aer cald
(Pupinel)
b. Cldura umed:
- Fierberea mecanism de aciune: denaturare
distruge formele vegetative, nu si sporii
nu este metod de sterilizare eficient
100C, 30 minute

- Tindalizarea sterilizarea fracionat: evit


nclzirea la temperaturi de peste 100C
nclzire n 3 zile consecutive, ntre nclziri
incubare la temperatura camerei pentru
germinarea sporilor (sporii trec in forma vegetativa
si astfel vor fi distrusi la incalzirea ulterioara)
sterilizarea unor medii de cultur, alimente
-Sterilizare prin vapori sub presiune
autoclavarea; mecanism de aciune:
denaturare

temperatura vaporilor de ap ntr-un spaiu


nchis creste proporional cu presiunea

1 atm 121C

n microbiologie: 121C timp de 15- 30


n blocurile operatorii: 134C timp de 30
STERILIZAREA PRIN CALDURA UMEDA AUTOCLAVAREA

Caldura umeda distruge bacteriile mai


repede decat caldura uscata la aceeasi
temperatura deoarece este mai
penetranta.
Sterilizarea prin caldura umeda utilizeaza
vaporii de apa sub presiune in autoclav.
Majoritatea bacteriilor in forma vegetativa
mor in timp de 10 minute la 50 60 C.
STERILIZAREA PRIN CALDURA
UMEDA AUTOCLAVAREA
Majoritatea sporilor bacterieni sunt distrusi in 10
minute la 100 C.
Sporii de Clostridium botulinum pot rezista 8 ore
la 100C.
Cel mai rezistent sporul de Bacillus
stearotermophilus, acesta necesita pentru
distrugere 15 18 minute la 121C si 40 minute
la 115C.
Sporii de B. stearotermophilus indicator in
aprecierea eficientei sterilizarii prin caldura
umeda.
indicaii:
sterilizarea
materialului
infecios din
laborator, medii
de cultur
termostabile,
instrumente
chirurgicale, halate,
cmpuri operatorii,
etc.
contraindicaii:
material plastic,
piele, blan
- Autoclav
Pasteurizarea
denaturarea proteinelor expunere la
temperaturi de sub 100C. Prin incalziri la 62 -
85C pe perioade de timp variabile este o metoda
de conservare a unor produse alimentare.
Sunt distruse formele vegetative ale bacteriilor si
fungii, dar rezista sporii, micobacteriile si
enterovirusurile.
produse alimentare termolabile
- joas (LTLT low temperature long time); 30 min. la 62
- 65C
- nalt (HTST high temperature short time); 40 45
sec. la 71 74 C
- (UHT ultra high temperature); 8 15 sec. la 85C
Equipment for the high-temperature short-time pasteurization of milk .
STERILIZAREA PRIN
CALDURA
Caldura umeda:
Autoclavarea
Fierberea
Tindalizarea
Pasteurizarea

Caldura uscata:
Cuptoare speciale cu aer cald (pupinele sau
etuve)
Aducerea la incandescenta
Flambarea
Incinerarea
II. Filtrarea
reinerea microorganismelor din medii
lichide sau aer
trecerea prin membrane cu poroziti
diferite
membrane: acetat, nitrat celuloz,
policarbonat, teflon
sterilizarea lichidelor termolabile si
sterilizarea aerului pentru crearea unui
mediu aseptic (boxe cu flux de aer laminar
HEPA filter: High-efficiency Particulate
Air)
filtrarea si
sterilizarea
componentelor
mediului de
crestere
-dupa filtrare este
obligatoriu controlul
sterilitatii solutiei
(filtratul este
insamantat pe medii
de cultura
adecvate ,este
termostatat si poate
ficonsiderat steril
daca in 24-48 de ore
nu se dezvolta nici o
IV. Radiaii
ionizante, Radiatiiile X si gamma
distrug ADN-ul
- penetraie mare
- sterilizarea instrumentelor chirurgicale, stomatologice
- nu este o metod des folosit, se folosesc
indeosebi pentru sterilizarea produselor termolabile
(ex. instrumentar medical din material plastic de unica
folosinta).

neionizante alterarea ADN-ului


- ex. razele UV lampa germicid
- nu sunt penetrante
- sterilizarea suprafeelor de lucru netede, curate, sanitizarea
saloanelor, slilor de operaie
RADIATIILE U.V. LUMINA SOLARA

Lumina solara, datorita continutului in U.V. are


efect bactericid, efect influentat de
permeabilitatea atmosferei.
Lumina solara constituie factorul principal de
reducere a florei microbiene a aerului, de pe
suprafata solului si in apele limpezi, putin adanci.
Timpul de distrugere este variabil in functie de
specia bacteriana: 1h pentru E.coli, 2 3 h pentru
Salmonella typhi si 5 7 ore pentru
Mycobacterium tuberculosis.
In practica U.V. se folosesc pentru decontaminarea
suprafetelor si a aerului in incaperi de policlinica si
spital, in Sali de operatie si laboratoare.
FRIGUL si CONGELAREA
In general, la 0C efectul temperaturii este
bactericid.
Moartea bacteriilor se produce prin inghetarea
apei cu formarea de pungi cu solutii
hiperconcentrate care au efect toxic si/sau
producerea de cristale de gheata.
La temperaturi mult sub 0C, de -30C pana la -
70C nu se constata un efect bactericid deoarece
la aceste temperaturi nu se formeaza pungi cu
solutii hiperconcentrate sau cristale de gheata.
Efectul bactericid este mai puternic prin
repetarea operatiunilor de inghetare si
dezghetare.
Desicare
Actiunea uscarii difera in functie de forma de viata a
bacteriilor.
Formele vegetative sunt mai sensibile.
Pentru formele vegetative rezistenta la uscare
depinde de continutul in lipide al invelisurilor
celulare: cu cat cantitatea de lipide este mai mare,
cu atat pierderea de apa se produce mai incet.
Ex: - micobacteriile care au in compozitia lor 40%
lipide rezista timp de 6 8 luni in praf,
bacilii Gram (-) cu 20% lipide rezista doar 1 2 saptamani
pneumococul moare in cateva ore in conditii de uscaciune
- gonococul se distruge imediat.
liofilizarea congelare brusc si
desicare: prezervarea pe termen
lung a culturilor bacteriene,
Substante chimice
I. Agenii alkilani:
au aciune sporo- si bactericid (glutaraldehida, oxidul de
etilen); formaldehida are doar efect dezinfectant
sterilizarea instrumentelor medicale, a echipamentelor
endoscopice, a medicamentelor
oxidul de etilen: substan gazoas cu penetrabilitate
mare
glutaraldehida: soluie apoas 2%

Compusi organici:
Detergenti anionici si cationici
Fenoli, alcooli, eteri
Aldehide
Coloranti
Substante chimice
II. Soluii dezinfectante si antiseptice
Halogenii
- Clorul si derivaii de clor, hipocloriii
- Iodoforii
Derivaii fenolici
Detergeni
Alcooli etanol 70-80%
Substane chimice utilizate n microbiologie:
- pentru dezinfecie: cloramin 5%, fenol 3%, etc.
- pentru antisepsia minilor: cloramin 1%, etc.

Substante chimice elementare:


O2, H2,
metale grele: Ag., Hg., Cu.
Compusi anorganici:
acizi: acid boric, acid salicilic, H2SO4, HCl.
baze: NaOH
saruri: AgNO3, clorura de Hg., permanganat de potasiu, bicromat de
potasiu, sulfat de cupru
Schema diagnosticului bacteriologic
1. Recoltarea si transportul produsului patologic
2. Examenul direct al produsului patologic:
a. examen macroscopic
b. examen microscopic
3. Izolarea germenului n cultur pur:
nsmnarea i cultivarea pe medii de cultur
4. Identificarea germenului izolat din cultur pur:
a. Caracterele morfotinctoriale
b. caracterele de cultur
c. caracterele biochimice i de metabolism
d. caractere antigenice
e. sensibilitatea la bacteriofagi (lizotipia)
f. Caractere de patogenitate
5. Determinarea sensibilitii germenului la antibiotice i
chimioterapice
(antibiograma)