Mtodos Fenotpicos para

Deteco dos Mecanismos

de Resistncia
Antimicrobiana em Bacilos
Gram-Negativos

Prof. Dr. Rodrigo Elisandro Mendes

Ps-doutorando da Disciplina de Infectologia
Universidade Federal de So Paulo - EPM
Principais Problemas
Parede celular bacteriana
Resistncia Bacteriana a Antimicrobianos
Principais Problemas em Enterobactrias
Principais Problemas em Bacilos Gram-Negativos No-Fermentadores

Deteco de

ESBL no Brasil
Infeces por amostras produtoras de ESBL SURTO
Mtodos fenotpicos para deteco das amostras produtoras de ESBL
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Testes para Deteco de Cepas Produtoras de ESBL

Resistncia aos carbapenens Enterobactrias

Deteco de Metalo-
Deteco de amostras produtoras de MBL
Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant
Metalo-

ndice
 Principais Problemas

Enterobactrias
Resistncia s cefalosporinas de amplo espectro
Resistncia aos carbapenens (rara)

Bacilos Gram-negativos no fermentadores

Resistncia aos carbapenens
Resistncia s polimixinas (rara)
Parede celular bacteriana

Pelcza, Microbiology, 1999.

Bactria Gram-positiva Bactria Gram-negativa

Bactria Gram-positiva
Bactria Gram-negativa
Resistncia Bacteriana a
Antimicrobianos
Principais Problemas em Enterobactrias

Resistncia s cefalosporinas de amplo espectro e

monobactmicos

Produo de -lactamases de espectro ampliado (ESBL)
Produo de -lactamases AmpC

Resistncia aos carbapenens (rara)

Falsa resistncia
Produo de ESBL/AmpC + alt. da membrana externa
Produo de Metalo- -lactamases (MBL)
 Principais Problemas em Bacilos Gram-
Negativos No-Fermentadores

Resistncia aos carbapenens

Produo de AmpC + alt. da membrana externa
Produo de Metalo- -lactamases (MBL)
Efluxo ativo

Resistncia s polimixinas (rara)

Alterao da composio lpidica do LPS e/ou
Hiperexpresso da porina OmprH
 -lactamases

So enzimas que catalisam a hidrlise do anel

beta-lactmico

Principal mecanismo de resistncia entre gram-

negativos

Grande diversidade

Produo mediada pelo DNA cromossmico ou

extra-cromossmico (plasmdios e transposons)
 Localizao dos genes bla

Transmisso e disseminao

Diviso binria
DNA Cromossomal Cl. Me para cl.
filha

Conjugao entre
bactrias de
espcies diferentes
DNA
Extra-Cromossomal

Conjugao entre
bactrias da
mesma espcie
Deteco de -lactamases

+ -

Disco de Nitrocefin
+ -
 -lactamases de espectro ampliado
(extended-spectrum beta-lactamase)

Bush et al., AAC 39:1211, 1995

-lactamases de espectro ampliado

(extended-spectrum beta-
lactamase)
Enterobactrias: E. coli e K. pneumoniae
Mediadas por genes plasmidiais no induzveis

Vrios genes: tem, shv, per, ges, ctx, oxa

Degradam todos os monobactmicos e beta-lactmicos com
exceo dos carbapenens e das cefamicinas

Geralmente, inibidas pelos inibidores de -lactamases (cido

clavulnico, sulbactam e tazobactam)
 -lactamases de espectro ampliado
Importncia Clnica

Posso utilizar cefalosporinas de amplo espectro para o

tratamento de Infeces causadas por bactrias
produtoras de ESBL?
-lactamases de espectro ampliado
Importncia Clnica

Paterson et al., J Clin Microbiol 39:2206, 2001.

MIC ( g /ml) Falncia teraputica Morte at 14 dias

aps bacteremia

% (N) N(%)
8 100 (6/6) 33 (2/6)
4 67 (2/3) 0 (0/3)
2 33 (1/3) 0 (0/3)
1 27 (3/11) 18 (2/11)
Total 54 (15/28)
 ESBL no Brasil

CTX-M-8 - Rio de Janeiro - C. amalonaticus e E. cloacae

Bonnet et al., J Clin Microbiol 44:1936, 2000.

BES-1 - Rio de Janeiro - Serratia marcescens

Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother 44:3061, 2000.

CTX-9 e -16 - Rio de Janeiro - E. coli e E. cloacae

Bonnet et al., Antimicrob Agents Chemother. 45:2269, 2001.

SHV-27 - Aracaj - Klebsiella pneumoniae

Corkill et al., J Antimicrob Chemother 47:463, 2001.

CTX-M - So Paulo - Klebsiella pneumoniae

Carmo Filho. Doutorado UNIFESP/EPM, 2003.
 Infeces por amostras produtoras de ESBL
SURTO

Amostras de P. mirabilis produtoras de ESBL isoladas pelo

Programa SENTRY 1997 -1998
1 2 3 4 5 6 7 No. Ribogrupo PFGE pI
1 1019-4 W2 5.4, 7.6, 7.9
2 1019-4 W3 5.4, 7.6, 7.9
3 637-8 Z1 5.4, 7.6, 7.9
4 637-8 Z3 5.4, 7.6, 7.9
5 637-8 Z2 5.4, 7.6, 7.9
6 637-8 C 5.4, 7.6, 7.9
7 637-8 C 5.4, 7.6, 7.9
 Mtodos fenotpicos para deteco das
amostras produtoras de ESBL

Todos os mtodos fenotpicos se baseiam na

inibio da atividade da enzima pelos
inibidores de -lactamases (IBL)
 Mtodos fenotpicos para deteco das
amostras produtoras de ESBL

Limites de triagem do CLSI (antigo NCCLS)

Teste de Adio de IBL aos discos de cefalosp.
Discos combinados
Teste de dupla-difuso em disco
Etest
Mtodos automatizados
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Limites de Triagem do CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis*

Disco Difuso MIC

Aztreonam < 27 mm > 2 g/mL

Ceftazidima* < 22 mm > 2 g/mL

Ceftriaxona < 25 mm > 2 g/mL

Cefotaxima* < 27 mm > 2 g/mL

Cefpodoxima* < 17 mm > 2 * / > 8 g/mL

CLSI, 2005
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatrio recomendado pelo CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis

Disco difuso
Meio de Mller-Hinton
Utilizar discos de ceftazidima e cefotaxima sozinhos e os
associados ao cido clavulnico

POSITIVO
Aumento do halo 5 mm da associao
CAZ/AC ou CTX/AC vs. halo de CAZ ou CTX
 Deteco de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatrio recomendado pelo CLSI
Teste de adio de IBL

Disco difuso

cido Clavulnico
Preparar soluo estoque 1000 l fresca ou congelada a
70C
Adicionar 10 l desta soluo sobre os discos de CAZ e
CTX uma hora antes do teste

Controle de Qualidade
- Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603
- Negativo: E. coli ATCC 25922
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Teste de adio de IBL

Jacoby & Han, 1996

Carter et al., J Clin Microbiol. 38:4228, 2000.
 Deteco de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatrio recomendado pelo CLSI
E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca, P. mirabilis

CLSI, 2005

Mtodos dilucionais
Meio de Mller-Hinton com a concentrao de ctions
ajustada
Concentraes dos antimicrobianos:
ceftazidima: 0.25-128 g/ml
ceftazidima/cido clav.: 0.25/4-128/4g/ml E
cefotaxima: 0.25-64 g/ml
cefotaxima/cido clav.: 0.25/4-128/4g/ml

POSITIVO
Reduo 3.0 diluies
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Teste confirmatrio recomendado pelo CLSI
Teste de adio de IBL

CLSI, 2005

Mtodos dilucionais

Controle de Qualidade
Positivo: K. pneumoniae ATCC 700603
Negativo: E. coli ATCC 25922
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Teste de adio de IBL

Vantagens
Teste simples;
Fcil interpretao;
Custo

Limitaes
Preparo e armazenamento da
soluo estoque de cido
clavulnico;
Caracterizao errnea
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados

2
3

1 4 1.Cefpodoxima,
2. Cefpodoxina + c. Clavulnico,

3. Ceftazidima,
6 4. Ceftazidima + c. Clavulnico,
5
5. Cefotaxima
6. Cefotaxima + c. Clavulnico
 2
3

1
4

6
5
1. Cefpodoxima, 2. Cefpodoxina + c. Clavulnico,
3. Ceftazidima, 4. Ceftazidima + c. Clavulnico,
5. Cefotaxima 6. Cefotaxima + c. Clavulnico
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados

Vantagens
Teste simples;
Fcil interpretao;
Custo

Limitaes
Substrato (novo disco com
cefpiroma);
No deteco de amostras
produtoras de SHV-6
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados

M'Zali et al. J Antimicrob Chemother45:881-5 , 2000.

Carter et al. J Clin Microbiol 38:4228-32, 2000.

Sensibilidade
Ceftazidima = 86% Cefotaxima = 65.5%
Combinados = 93%

100% das amostras produtoras de ESBL

apresentaram aumento no halo > 5 mm, enquanto
as produtoras de AmpC e K1 apresentaram
aumento < 1 mm.
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados

De Gheldre et al. J Antimicrob Chemother. 52:591-7, 2003

Sensibilidade/Especificidade (%)

Escherichia coli e Klebsiella spp.

CAZ/clav: 88% e 92%
CTX/clav: 90% e 92%
CPR/clav: 95% e 84%
CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 82%

Enterobacter aerogenes
CAZ/clav: 94% e 100%
CTX/clav: 94% e 100%
CPR/clav: 94% e 100%
CAZ/clav + CPR/Clav: 100% e 100%
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Discos combinados

Pereira et al. J Bras Patol Med Lab 39:301-308, 2003.

134 amostras de K. pneumoniae do Hospital So Paulo 1996/2001

Discos da Oxoid
Cefotaxima e cefpodoxima: S e E = 100%

Etest ESBL
S = 96% e E = 100%
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Disco-difuso dupla ou teste de aproximao

Jarlier, 1988

CPM

AMX/AC

CAZ CRO/
CTX
Distncia
de 30 mm
ATM
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Disco-difuso dupla ou teste de aproximao

Jarlier, 1988

Teste Positivo
Teste Positivo
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Disco-difuso dupla ou teste de aproximao

Vantagens
Teste simples;
No necessita de reagentes
especiais

Limitaes
Distncia entre os discos;
Armazenamento dos discos
com cido clavulnico;
Interpretao
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Etest

Cormican & Jones, 1996

Fitas disponveis
Ceftazidima, cefotaxima e cefepima

Critrio de positividade
Reduo 3.0 diluies
Razo TZ/TZL > 8
Razo CT/CTL > 8

TZ = 32 TZL =2
32 16 8 4 2
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Etest

Cormican & Jones, 1996

Deteco de amostras produtoras de ESBL
Etest

Cormican & Jones, 1996

Zona Fantasma
Zona Fantasma
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Etest

Vantagens
Teste simples;

Limitaes
Substrato especfico;
No deteco de amostras,
cuja as MICs situem acima das
diluies testadas;
Custo
Deteco de amostras produtoras de ESBL
Mtodos Automatizados

MicroScan Painis de Gram-negativos

Triagem para ESL

Poos que contm cefpodoxima 4 g/mL e ceftazidima 1 g/mL
associados ao clavulanato

ESL plus Confirmation Panel

Antimicrobiano (conecntao testada em g/ml)

Aztreonam 0.5 64 Cefpodoxima 0.5 64

Cefepima 1 32 Ceftazidima 0.5 128
Cefoxitina 2 32 Ceftazidima/Clav4 0.12/4 16/4
Cefotaxima 0.5 128 Ceftriaxona 1 64
Cefotaxima/Clav4 0.12/4 16/4 Meropenem 0.5 16
Cefotetan 1 32 Piperacillina 16 64
Imipenem 0.5 16
 Deteco de amostras produtoras de ESBL
Mtodos Automatizados

Vitek Painis de Gram-negativos

Triagem para ESL

Poos que contm cefotaxima e ceftazidima

0,5 g/mL associados ao clavulanato
 Deteco de amostras produtoras de ESBL
Mtodos Automatizados

Vantagens
Padronizao intra- e inter-
laboratorial;

Limitaes
Substrato especfico;
No deteco de amostras,
cuja as MICs situem acima das
diluies testadas;
Custo
Deteco de amostras produtoras de ESBL
K. pneumoniae ATCC 700603 CQ ESBL +

CLSI, 2005
Avaliao da Sensibilidade e Especificidade
de Diferentes Testes para Deteco de
Cepas Produtoras de ESBL
Reis et al., J Bras Patol Clin 37:43, 2001.

Teste Sens. Espec.

Disco difuso (bkpts ESBL - NCCLS) 89 62

Dupla Difuso 41 100
ESBL Etest 89 98
Disco difuso (CTX + AZT - NCCLS) 88 83
Adio de clavulanato 97 47
MICs para 5 substratos (Etest) 100 100
 Deteco de amostras produtoras de ESBL

Sugesto

Limites de triagem estabelecidos pelo CLSI;

+
Teste de dupla-difuso em disco, ou
Discos combinados
 -lactamases do Grupo 1 (AmpC)

Livermore. Scand J Inf Dis 79(Suppl):7-16, 1991

Antimicrobianos hidrolisados: aztreonam,

cefalosporinas de amplo espectro e penicilinas de
amplo espectro
Enterobacter spp., Citrobacter freundii, Morganella
morganii, Providencia stuartii, Providencia rettgeri,
Serratia spp., Pseudomonas aeruginosa -
cromossomal
No so inibidas por inibidores de -lactamases
Produzidas em pequena quantidade a menos que
sejam induzidas
Agente retirado produo volta a nveis basais ou
pode ocorrer mutao e desrepresso
 -lactamases do Grupo 1 (AmpC)
Teste de induo de -lactamases AmpC

D
CRO CFO
CAZ

Distncia em mm = raio do beta-lactmico - 3

2
 Resistncia aos carbapenens
Enterobactrias

Checar resultados das cepas ATCCs

Verificar a validade e a estocagem dos discos;

Verificar a identificao;

Repetir o teste de sensibilidade tcnica

Confirmada Lab. de referncia

 Resistncia aos carbapenens
Metalo--lactamases
(Page 2002, Rossolini et al 2001; Nordmann & Poirel 2002, Toleman et al 2002)

Hidrolisam penicilinas, cefalosporinas e carbapenens

Genes cromossmicos e plasmidiais (transposons,

integrons)
Zn++ como cofatores enzimticos

Inibidas por EDTA e compostos derivados do thiol

Famlia IMP-1 a -16 (Japo, China, Europa, Canad,

Portugal, Taiwan, Brasil)
Famlia VIM-1 a -11 (Argentina, Colmbia, Europa,
Coria, Taiwan, EUA)
GIM-1 (Alemanha)

SPM-1 (So Paulo Metalo- -lactamase)

 Deteco de Metalo- -lactamases
Importncia Clnica

A maior parte da produo destas enzimas

mediada por genes plasmidiais, que podem se
disseminar entre espcies distintas

Medidas de Controle

Deteco do mecanismos opes teraputicas

Novas drogas como IMBL.
Deteco de amostras produtoras de MBL
Disco- aproximao IMBL

Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.

IMBL

CAZ IMP
Distncia
de 4-5 cm Distncia
de 15-25
IMBL mm
EDTA 5 l 100 mM
2-MPCA puro 2 a 3 l
 Deteco de amostras produtoras de
Metalo--lactamases

Arakawa J Clin Microbiol 38:40-43, 2000.

Disco- aproximao com cido 2-mercaptopropinico

NEGATIVA POSITIVA
Deteco de amostras produtoras de Metalo- -
lactamases - Adio de EDTA

Critrio de
positividade: 5 mm?
IMP/EDTA

IMP
 Deteco de amostras produtoras de
Metalo- -lactamases - Etest

Walsh et al., J Clin Microbiol 40:2755-9, 2002.

Critrio de positividade : Reduo 3.0 diluies

 Deteco de amostras produtoras de
Metalo- -lactamases

Controles de Qualidade

CQ -: P. aeruginosa ATCC 27853

CQ +: P. aeruginosa 48-1997A (produtora de SPM)

P. putida 48 1234 (produtora de IMP -1)
Dissemination of an Epidemic Carbapenem-Resistant
Pseudomonas aeruginosa Producer of SPM Metallo-
-Lactamase in Distinct Brazilian Regions

Gales et al. J Antimicrob Chemother 52:699, 2003.

 Metalo--lactamases em
Enterobactrias no Brasil

First Isolation of a Metallo--lactamase-

Producing-multiresistant Klebsiella pneumoniae
from a Patient in Brazil
Lincopan et al. J Clin Microbiol 43:516, 2005.

Outbreak caused by a Carbapenem-Resistant

Klebsiella pneumoniae Producer of IMP-1
Metallo--Lactamase in a Brazilian Teaching
Hospital
Grimbaun et al. 44th ICAAC, Washington, DC. 2004.