CROMATOGRAFA

Fase estacionaria: slido o lquido fijado a un slido

Fase mvil: fludo (lquido o gas) que arrastra la muestra a travs de la

fase estacionaria

Los distintos componentes de la mezcla interaccionan de

manera diferente con las dos fases establecindose un reparto
entre ambas

Se establece un equilibrio entre partculas adsorbidas y desorbidas

= [molculas adsorbidas]
[mol. adsorbidas] + [mol. desorbidas]
coeficiente de reparto
 FASE MVIL

FASE
ESTACIONARIA
Clasificaciones de cromatografa

1. Segn como se encuentre la fase estacionaria

a. columna

b. batch

c. plana cromatografa en papel y en capa fina

2. Segn el tipo de fase estacionaria y fase mvil

Fase estacionaria Fase mvil

Slida Lquida o gaseosa

Lquido adsorbido Lquida o gaseosa

3. Segn el tipo de flujo empleado

a. Gravedad

b. Capilaridad (papel, capa fina)

c. Fludo a presin (HPLC)

HPLC (high performance liquid chromatography)

Se basa en los mismos principios que la cromatografa a baja presin

Tiene mejor resolucin, tiempos menores, mejor reproducibilidad

El material empacado en las columnas est formado por pequeas

partculas de tamao muy uniforme y gran rigidez

Permite trabajar con flujos altos para lo que se requiere aplicar presin

Se requiere de columnas especiales construidas en acero inoxidable

o vidrio grueso
FPLC (fast protein liquid chromatography)

Es una variante del HPLC con columnas y

equipamiento especialmente diseado para
separar o purificar protenas

Las columnas de FPLC soportan menos

presin que las de HPLC
4. Segn la finalidad del experimento

Separacin y purificacin Preparativa

Separacin, cuantificacin y Analtica

caracterizacin
4. Segn la interaccin entre la fase mvil y el soluto

a. Cromatografa de intercambio inico carga-carga

b. Cromatografa de interaccin hidrofbica efecto hidrofbico

c. Cromatografa de afinidad variada pero especfica

d. Cromatografa de afinidad por metales enlaces covalentes

inmovilizados (IMAC)

e. Cromatografa de fase normal y reversa dipolos

Cromatografa de intercambio inico

La separacin se basa en diferencias de carga a un pH dado

Las interacciones son electrostticas

Dos tipos

Intercambio aninico: matriz cargada

positivamente (DEAE, TEA, QAE)

Intercambio catinico: matriz cargada

negativamente (carboximetilos,
sulfonatos, fosfatos)

Elucin: puede llevarse a cabo mediante cambios de pH, fuerza inica o

ambos
 Condiciones iniciales Aplicacin de la muestra
- -
+ + - -
+ + + - + + + -
+ +
-
-
-
- + + + - + + + -
- -
- -
-
+ -
+ + + -
+
- + + + -
- -
-
- -
+ + - -
+ + + - + + + -
+ +
- - + + + - + + + -
- - - -
- -
-
+ -
+ + + -
+
- + + + -
- -
-
- -
+ - -
+ + + - +
+ + + - +
- - + + + - +
- - - + + + -
- -
-
Aumento en la concentracin de sales Elucin de la protena de inters
- - - -
+ + + +
+ + + - + + + - + + + - + + + -
- - -
- - - -

- -
+ - +
+ + + + + + -
- -
- -

- - -
+ + + +
+ + - + ++ + - + + + - + + + -
- - -
- - - -

- -
+ +
+ + + - + + + -
- -
- -
- - -
-
+ +
+ + + - + + + + - +
+ + + -
- + + + - - -
- - - -
-
Cromatografa de afinidad

Se basa en una interaccin biolgica especfica:

Enzima-sustrato

Anticuerpo-antgeno

Enzima-coenzima

Protena-ligando especfico

La elucin se puede lograr agregando el ligando (el que est unido a la

columna) en solucin o mediante cambios en el buffer que sean
capaces de debilitar la interaccin
IMAC (immobilized metal affinity chromatography)

Se basa en la formacin de enlaces de coordinacin entre iones

metlicos inmovilizados y grupos bsicos en protenas (histidinas)

Principalmente a los iones divalentes de metales de transicin

como Fe, Co, Ni, Cu y Zn

La elucin se lleva a cabo adicionando quelantes ms fuertes como el

imidazol a distintas concentraciones o cambios en el pH
Es muy utilizada para la purificacin de protenas recombinantes

Generalmente se adicionan 6 histidinas en el extremo N t o en el Ct

Cola de (Histidina)6

Ni2+
Cromatografa de interaccin hidrofbica

El soporte est sustitudo con cadenas alifticas de 2 a 10 carbonos u otros

grupos hidrofbicos

La interaccin es de tipo hidrofbica

La fase mvil debe tener una alta concentracin de sales

((NH4)2SO3 2 4 M)

Salting out

Para la elucin se disminuye la concentracin de sales en la fase mvil

 Cromatografa de fase reversa

Est muy relacionada con la cromatografa de interaccin hidrofbica

pero son diferentes

El soporte est sustitudo por alifticas pero ms largas (8 -18 carbonos) y

la densidad de sustituyentes es mayor

La unin es ms fuerte y por eso requiere mezclas con solventes no

polares para la elucin

Desnaturaliza protenas

Se utiliza en HPLC
Gel filtracin (cromatografa de exclusin molecular)

No es una cromatografa

La separacin se da por tamao

El gel debe ser inerte, de tamao de poro definido y sin carga

Mltiples aplicaciones:

Cambios de buffer

Separacin de molculas de bajo peso molecular de otras de mayor

tamao

Determinacin del peso molecular

Resultado final: cromatograma

y y

Velucin (mL) Velucin (mL)

y = unidades de absorbancia, unidades de fluorescencia relativa, intensidad

del pico (espectrometra de masa), entre otras
Concluyendo.

La pregunta ms importante

En qu son distintas las sustancias que deseo separar?