Sunteți pe pagina 1din 203

ENZIMELE

OBIECTIVELE:
1. Noiune despre enzime i rolul lor biologic. Asemnrile i deosebirile dintre
aciunea enzimelor i a catalizatorilor nebiologici.
2. Natura chimic a enzimelor. Dovezile naturii proteice a enzimelor. Structura
enzimelor. Centrul activ i centrul alosteric al enzimelor.
3. Enzimele simple i conjugate. Noiune de holoenzim, apoenzim, cofactor,
coenzim i grup prostetic. Funciile de coenzime ale vitaminelor i
microelementelor. Structura vitaminelor B1, B2, B6, PP, acidului pantotenic,
biotinei, acidului folic i rolul lor ca coenzime.
4. Mecanismul de aciune al enzimelor. Centrul activ al enzimelor i rolul lui n
formarea i transformarea complexelor intermediare dintre enzim i substrat.
Rolul modificrilor conformaionale reciproce ale moleculei enzimei i
substratului n procesul de cataliz.
5. Nomenclatura (denumirea) i clasificarea enzimelor. Caracteristica general a
claselor i subclaselor principale de enzime. Numrul de cod al enzimei.
6. Specificitatea enzimelor (tipurile, exemple).
NOIUNE DE ENZIM

ENZIM de la grecescul
EN ZYME- n drojdii
Enzime biocatalizatori de natur
proteic
Mresc V reaciilor chimice,
termodinamic posibile
E- acioneaz strict ntr-o anumit consecutivitate i
cu o anumit specificitate
Enzimologie-
tiina,
ce se ocup
cu studierea E

Enzimodiagnostica Enzimoterapia
- este determinarea - este utilizarea E,
activittii E, extrase i purificate sau
care se pot modifica n sintetizate n laborator,
diverse patologii cu n tratamentul
scop diagnostic. diferitor patologii.
Natura chimic a E
E- sunt proteine i posed toate proprietile
fizico-chimice specifice acestor molecule
(solubilitate, proprieti osmotice, sarcin
electric net, denaturare termic)
Dovezile experimentale:
1. Sunt alctuite din AA
2. Prezint macromolecule
3. n ap formeaz sol. coloidale cu propriet. sale
specifice
4. Prezint electrolii amfolii
5. Se supun denaturrii
6. Au fost sintetizate n condiii de laborator din AA
(ribonucleaza, lizozima)
Asemnrile E cu
catalizatorii neorganici
1. catalizeaz numai reaciile posibile
din punct de vedere energetic
2. nu modific echilibrul reaciilor
reversibile
3. nu modific direcia reaciei
4. nu se consum n procesul reaciilor.
Deosebirile E de
catalizatorii neorganici
1. Viteza catalizei enzimatice este cu
mult mai mare dect a celei
nebiologice (1 mg de Fe n
componena catalazei poate nlocui
o ton de Fe metalic).
2. E posed specificitate nalt.
3. E catalizeaz reaciile chimice n
condiii blnde (presiunea obinuit,
temperatura 37C, pH aproape
neutru).
Deosebirile E de
catalizatorii neorganici
4. E catalizeaz reaciile fr formarea
produselor intermediare
randamentul este de 100%
5. Activitatea E, de aici i reaciile
enzimatice se regleaz.
6. Viteza reaciilor este direct
proporional cu cantitatea E.
Structura enzimelor
Masa molecular a E e de mii de ori mai mare
dect masa molecular a substratului (S)
S sau ligandul, substana asupra creia
acioneaz E
E acioneaz nu cu toat molecula dar cu un
anumit sector denumit centrul activ (CA)
CA - locul care asigur interaciunea E cu S i
transformarea ulterioar a acestuia n P
Particularitile CA
1. este o structur tridimensional unical,
format din radicali ai aminoacizilor
distanai n catena primar proteic;
2. Posed grupri funcionale active (-OH,
-SH, -NH2, -COOH, etc.)
Particularitile CA
3. Are form de adncitur sau cavitate, cptuit
cu AA hidrofobi,unde nu-i acces de ap (ex.
cnd apa este un reagent al reaciei). CA
conine AA polari.
4. Ocup o parte relativ mic din volumul E i
majoritatea resturilor de AA n molecula E nu
contacteaz cu S
5. S relativ slab se leag cu E
6. CA este alctuit din 2 sectoare:
Sectorul de contact (de legare)
Sectorul catalitic
Organizarea funcional a
enzimelor
Centrul alosteric
1. Este centrul reglator
2. Fixeaz modulatorul alosteric
3. Adiionarea modulatorului modific
conformaia enzimei i secundar
activitatea ei
4. Modulatorul pozitiv activator
5. Modulatorul negativ - inhibitor
Reglarea alosteric a
activitii enzimatice
Enzime alosterice
Moleculele enzimelor alosterice sunt mai
mari, mai complexe i sunt oligomere
pare
Au cinetica lor viteza reaciilor n
dependen de c% S are form
sigmoidal, dar nu hiperbolic, cauzat
de urmrile interaciunii ntre protomerii
ce leag S n mod cooperativ
Structura enzimelor
Din punct de vedere structural deosebim:
1. E simple alctuite numai din AA
(proteazele, lipazele, ribonucleaza)
2. E conjugate - formate din:
a. partea proteic apoenzim
b. partea neproteic
HOLOENZIM partea neproteic
+apoenzima cu activitate catalitic
PARTEA NEPROTEIC A E
A:Cnd componenta neproteic
este un ion metalic este
denumit cofactor
n calitate de cofactori apar
frecvent cationii unor metale
(Fe2+, Mg, Mn sau Zn2 i, foarte
rar, unii anioni
PARTEA NEPROTEIC A E
B:Cnd componenta neproteic
este o molecul organic de mici
dimensiuni este denumit
coenzim
Coenzimele
Coenzima strns legat n structura E
grupare prostetic (FMN; FAD,
biotina, acidul lipoic)
Coenzima slab legat, uor disociabil
(se asociaz doar tranzitoriui se
disociaz de E ntr-o form alterat)
cosubstrat (NAD; NADP, coenzima A)
Rolul metalelor in cataliza
enzimatica
- Sunt componente eseniale ale centrului catalitic
(activ);
- Particip la legarea S i formarea complexului
ES;
- Necesare n meninerea structurii 3D a enzimei;
Rolul metalelor in cataliza
enzimatica

Particip nemijlocit la cataliz


(n reactii de transfer de
electroni)
Particip la reglarea activitii E
Ionii de metale cofactori ai E
Dup modul de legare i rolul ionului metalic E
sunt:
Metaloenzime care conin n calitate de
cofactori ioni de metale, strns legai de apoE
Exemple:
1. Citocromi, peroxidaza, catalaza (Fe)
2. Citocromoxidaza (Cu)
3. alcoolDH; carboxipeptidaza (Zn)
E metaloactive a cror activitate crete n
prezena ionului metalic, care leag metalul
slab. Metalele sunt fixate de apoenzim prin
legturi electrostatice la care particip resturile
de AA acizi (Asp, Glu) sau bazici (Arg, Lyz, His)
EXEMPLE DE
METALOENZIME
- Fe-enzime: hem (citocromi, catalaze,
peroxidaze);
- Cu-enzime: citocromoxidaza, superoxid-
dismutaza, tiroxin-hidroxilaza;
- Mn-enzime: peptidaza, arginaza, izocitrat-
dehidrogenaza;
- Co-enzime: cobalamin-enzime;
- Se-enzime: glutationperoxidaza
Coenzimele (CoE)

1. Sunt parte component a centrului activ


2. Contribuie la stabilizarea conformaiei
enzimei
3. Contribuie la fixarea substratului
4. Particip nemijlocit la actul catalitic
Clasificarea CoE
CoE vitaminice
1. Tiaminice
2. Flavinice
3. Nicotinamidice
4. Piridoxinice
5. Folice
6. Cobamidice
7. Biotinice
8. lipoice
CoE nevitaminice
1. hemurile de divers natur
2. Nucleotidele
3. Fosfaii monozaharidelor
Coenzimele tiaminice
Derivaii vitaminei
B1
TMP, TDP (TPP)-
cocarboxilaza, TTP
Rolul:
1. Decarboxilarea
oxidativ a
piruvatului
2. Decarboxilarea
oxidativ a
cetoglutaratului
3. Reacii de
transcetolare
Vitamin B1: Tiamin

Coenzima - Tiamin pirofosfat TPP


Reacia sumar a
decarboxilrii oxidative a
piruvatului cu participarea
TPP (deriv. Vit. B1)
Coenzimele flavinice
Derivai ai vitaminei B2
FMN i FAD
Rolul:
1. Particip n reaciile de oxido-reducere:
2. Dezaminarea AA
3. Degradarea aldehidelor (aldehidDH)
4. Degradarea purinelor (xantinoxidaza)
5. Ciclul Krebs (succinatDH)
6. Oxidarea AG
7. DOP (dihidrolipoilDH)
Vitamina B2:
riboflavina

Coenzima -
Flavin mononucleotidul (FMN)

Coenzim -
Flavin adenin dinucleotidul (FAD)
Coenzimele flavinice
Reacia de dehidrogenare a
succinatului cu participarea FAD
derivatul vit. B2
Coenzimele
nicotinamidice
Sunt derivai ai vitaminei PP
niacina, niacinamida, B5
se include n structura a 2
Co- NAD i NADP
Rolul
Particip n reaciile de
oxido-reducere
(dehidrogenarea S
transferul unui hibrid ion
(H+ i 2 e). Alt proton
rmne n soluie H+
Vitamina PP:
nicotinamida

Coenzimele -
nicotinamid adenin dinudleotidul (NAD+)
nicotinamid adenin dinudleotid fosfat (NADP+)
Coenzimele nicotinamidice
Coenzimele nicotinamidice
Reacia de dehidrogenare a
malatului cu participarea
NAD derivatul vit. PP
Coenzimele piridoxinice
Derivai a vitaminei
B6 - piridoxol
Co piridoxalfosfat
i piridoxaminfosfat
Rolul:
1. Transaminarea AA
2. Decarboxilarea AA
3. Transsulfurarea
Vitamina
B6 :

Piridoxina Piridoxal Piridoxamina

Coenzimele:

Piridoxal fosfat Piridoxamin fosfatul


Reacia de transaminare a
aminoacizilor cu participarea PALP
i PAMP derivaii vit. B6
ACIDUL PANTOTENIC
(vitamina B5)
Co pantotenice (B3)- HS-
CoA
1. biosinteza AG
2. biosinteza Col
3. sinteza corpilor cetonici
4. Oxidarea AG
5. Ciclul Krebs
6. Sinteza aminolevulinatului
7. DOP
8. DO a alfa cetoglutaratului
Transferul grupelor acil
Co biotinice vitamina H
Gluconeogenez (I cale piruvatdecarboxilaza)
Sinteza AG (formarea lui malonil CoA)
Transformarea propionil-CoA n succinil CoA
(oxidarea AG cu numr impar)
Intervine n catabolismul Leu
Co cobamidice B12
-ciancobalamina
Vitamin antipernicioas pentru om i
factor de cretere pentru microorganisme
n ficat sunt 3 compui cobalaminici: meti-;
hidroxo- i deoxiadenozil-cobalamin
Rolul:
1. Co pentru unele transmetilaze
(homocistein metionin)
2. Co pentru anumite mutaze (izomeraze)-
metilmalonil Co A---- succinil CoA
Co folice sau pteridinice
Bc-acidul folic
Forma activ- acidul tetrahidrofolic
Rol: transferul gruprilor cu un singur atom
de C: metil (CH3), metilen(-CH2), formil
(COH), formimino (CH=NH)
Mecanismul de aciune al E
Pentrudecurgerea unei reacii este
necesar ca molecula de S i E s
contacteze ntre ele, pentru aceasta e
necesar de contientizarea unei noiuni ca:

Energia de activare este energia


necesar tuturor moleculelor unui mol de
S, care la o anumit t pot s ating starea
de tranziie (corespunztoare apixului
barierii energetice) (KJ/mol; kcal/mol)
Mecanismul de aciune al E

E - micoreaz energia de activare ale


reaciilor chimice.
Cu ct mai mult scade energie de activare,
cu att mai eficient acioneaz catalizatorul,
i cu att mai mult se accelereaz reacia.
S + E E-S E + P

Energia de activare a reactiei necatalizate


Energie

S Energia de activare a reactiei catalizate

G P

Progresul reactiei

Enzimele reduc energia de activare fara sa afecteze energia libera a


reactiei (G). Astfel, enzimele cresc viteza de reactie.
Enzymes
Lower a
Reactions
Activation
Energy
Etapele aciunii
enzimatice

E + S <> ES <> ES* <> EP <> E + P


I et. III et.

II et.

I et. formarea complexului enzim-substrat (E-S)


II et. cataliza transformarea S n produsul reaciei
(P) de ctre enzim
III et. - eliberarea P de la E
Mecanismul de aciune al enzimelor
Prima etap:
Difuzia S spre E i legarea cu CA al E -
formarea complexului ES
1. de scurt durat
2. depinde de concentraia substratului i de
viteza lui de difuzie spre centrul activ al
enzimei.
Mecanismul de aciune al
E
2. Transformarea complexului primar ES n unul
sau cteva complexe activate - ES*, ES** (este
cea mai lent). Are loc dereglarea legturilor S,
ruperea lor sau formarea noilor legturi n urma
interaciunii grupelor catalitice ale E.
3. Desprirea produselor reaciei de CA al E i
difuzia lor n mediul ambiant (complexul EP
disociaz n E i P).
Ipoteza lact-cheie (Fischer) i
coincidena forat (Koshland)

Modelul clasic (Emil Fischer) consider c


potrivirea S cu CA al E este analog cu
potrivirea lact-cheie. Acest model
presupune o rigiditate a structurii enzimei n
zona CA.
modelul Koshland, numit centrul activ
indus- potrivire indus , presupune c CA
nu este rigid, c forma acestuia se modific
n momentul legrii S.
Teoria cheie-lact -
Fisher
Concept ul clasic "lact-
cheie

E+S-- ES- E+P


Teoria coincidenei
induse - Koshland
Concept ul
coencidenei inductive

coincidena forat
(Kochland)
Mecanismul de aciune al E
La nivel molecular aciunea E poate fi lmurit prin
urmtoarele efecte:
1. Efectul de orientare a substratelor (CA al E fixeaz S i le
orienteaz ntr-un mod convenabil pentru aciunea gr.
catalitice)
2. Efectul de deformare a S (dup unirea n CA molecula S se
ntinde, se deformeaz favoriznd scindarea ei)
3. Cataliza acido-bazic (n procesul fixrii S n CA asupra lui
acioneaz grupele electrofile ale sectorului catalitic, are loc
redistribuirea densitii electronice n S i ruperea legturilor
din S
4. Cataliza covalent formarea legturilor covalente ntre CA i
S, complexul ES e foarte instabil, uor disociaz elibernd P
reaciei
NOMENCLATURA ENZIMELOR
DENUMIREA COMUN:
Numele substratului (S) + sufixul aza
(glucozidaza, ureaza, lipaza, nucleaza)
sau
denumirea att a S ct i tipului de reacie la care
acestea particip + aza (lactatdehidrogenaza,
alcool dehidrogenaza, piruvatcarboxilaza)
DENUMIREA SISTEMATIC:
Denumirea tuturor S + tipul reactiei chimice+
aza - D gliceraldehid 3 fosfat NAD
oxidoreductaz
Clasificarea actual a
enzimelor.
Toate E se mpart n:
ase clase,
clasele n subclase,
subclasele n subsubclase,
numrul su de ordin.

Ex: LDH - 1.1.1.27


Clasificarea actual a
enzimelor.
Ex: LDH - 1.1.1.27
Clasa reprezint tipul de reacie, catalizat de
enzime
Subclasa precizeaz aciunea E - indic
gruparea sau legtura chimic interesat n
reacie
Subsubclasa precizeaz natura acceptorului
care particip la reacii
Numrul su de ordin - poziia E n
subsubclasa
Clasificarea actual a enzimelor

1. Oxidoreductaze
2. Transferaze
3. Hidrolaze
4. Liaze
5. Izomeraze
6. Ligaze (sintetaze)
Clasificarea enzimelor.

- catalizeaz reaciii de oxido-


reducere;
-catalizeaz transferuri
grupelor funcionale de la un S
la altul (metil, amino, acil,);

-catalizeaz scindri de
legturi covalente cu
adiionarea apei ;

-catalizeaz ruperea leg. C-C,


C-S i C-N; fr adiionarea
apei, adiia la legturi duble
i reaciile inverse.

-catalizeaz toate tipurile de


transformri n cadrul uneia
i aceleai molecul ;
- catalizeaz formarea de legturi
ntre carbon i O, S, N, cuplate cu
hidroliza legturilor macroergice
(utilizarea ATP).
6 clase de Enzime

1. Oxidoreductaze
catalizeaz reaciii de oxido-reducere

SUBCLASELE:
Dehidrogenaze
Reductaze
Oxidaze,
Peroxidaze,
Hidroxilaze,
-
1. Oxidoreductaze
1. Oxidoreductaze
2. Transferaze

catalizeaz transferuri grupelor funcionale de la


un substrat la altul (metil, amino, acil)

SUBCLASELE:

Aciltransferaze
Metiltransferaze
Glicoziltransferaze
aminotransferaze
Kinaze

2. Transferaze
TRANSFERAZE:
TRANSFERAZE:
CH2OH CH2OPO3H2
O O
OH OH
OH OH OH OH
OH ATP ADP OH

Glucoza Glucoza-6-fosfat
3. Hidrolaze
catalizeaz scindri de legturi covalente cu
adiionarea apei

SUBCLASELE:
Esteraze
Glicozidaze
Peptidaze
Fosfataze
Tiolaze
Ribonucleaze

EXEMPLE: lipaza, proteaza, fosfolipaza, esteraza,


glicozidaza, fosfataza
3. Hidrolaze
CH2OPO3H2 CH2OH
O O
OH OH
OH OH OH OH
OH H2O H3PO4 OH
Glucoza -6- fosfat Glucoz
3. Hidrolaze
4. Liaze

catalizeaz ruperea leg. C-C, C-S i C-N; fr


adiionarea apei, adiia la legturi duble i
reaciile inverse.

-SUBCLASELE:

Decarboxilaze
Aldolaze
Hidrataze
Dehidrataze
4. Liaze
4. Liaze
5. Izomeraze

catalizeaz toate tipurile de transformri n cadrul


uneia i aceleiai molecul

SUBCLASELE:

Racemaze
Epimeraze
Izomeraze
Mutaze
5. Izomeraze
5. Izomeraze
5. Izomeraze
6. Ligaze (sintetaze)
catalizeaz formarea de legturi ntre carbon i O, S,
N, cuplate cu hidroliza legturilor macroergice
(utilizarea ATP).

SUBCLASELE:
Sintetaze
Carboxilaze

6. Ligaze (sintetaze)
6. Ligaze (sintetaze)
COOH COOH
I I
C=O +
CO2
C=
I I
CH3 ATP ADP C2
Piruvat H3PO4 I
C
Oxaloacetat
Specificitatea
-este capacitatea unei enzime de a selecta dintr-un
numr mare de S unul particular,

-este condiionat de complimentaritatea


conformaional i electrostatic ntre CA al E i S.

E S1

S4

S2
Deci fiecare E catalizeaz un anumit tip de
reactii sau transformarea unui anumit S
SPECIFICITATEA
1. De reacie
2. De substrat:
A. Absolut
B. Relativ
C. stereospecificitate
Specificitatea:

1.Specificitatea de reacie:
enzimele catalizeaz un anumit tip de
reacie ce st la baza clasificrii lor: o
reacie redox, un transfer a unei grupe
funcionale, formarea unei legturi, etc.
2. Specificitatea de substrat a
enzimelor
I. Specificitatea absolut de substrat
enzima catalizeaz transformarea
doar a unui singur substrat
(ureaza, arginaza, carbanhidraza)
Specificitatea de substrat
a enzimelor
II. Specificitatea relativ de substrat
enzima catalizeaz transformarea
unei grup numeros de substane cu
diferit structur chimic n acelai
mod
Ex. citocromul P450 hidrolizeaz
cteva mii de substane
Specificitatea de substrat
a enzimelor
specificitate relativa de substrat
- asigura transformarea unui grup de
substante inrudite chimic i se
intlnete n diferite ipostaze:
Specificitatea relativ de
substrat a enzimelor
Specificitatea absolut de grup
E catalizeaz transformarea unui grup de
substrate analogice structural (ADH - unui
grup de alcooli monohidroxilici, recunoscind
gruparea OH
Specificitatea relativ de
substrat a enzimelor
Specificitatea relativ de grup
enzima catalizeaz transformarea unei
anumite grupe sau legturi chimice din
diverse substane chimice
Ex. pepsina hidrolizeaz legturile peptidice
formate de gruprile carboxilice ale
aminoacizilor aromatici Phe, Tir i Trp
Specificitatea relativ de
grup
Specificitate
stereochimic
- E catalizeaz transformarea numai a unuia
din stereoizomerii posibili (D sau L; sau
numai a izomerului cis- sau trans-).
- Ex: Amilaza scindeaz legturile 1-4
glucozidice din amidon sau glicogen i nu
influeneaz asupra legturilor din
celuloz.
Specificitate stereochimic

Hexokinaza specificitate la D- glucoz


Oxidazele specificitate la L-AA
Fumaraza specificitate la izomerii trans-cis
PROPRIETILE
ENZIMELOR
Obiectivele:
1. Cinetica enzimatic. Influena concentraiei enzimei i a substratului, a pH-ului
i a temperaturii asupra activitii enzimatice.
2. Principiul determinrii activitii enzimelor. Unitile de activitate a enzimelor.
3. Inhibiia activitii enzimelor (specific i nespecific, reversibil i ireversibil,
competitiv, necompetitiv i noncompetitiv).
4. Reglarea activitii enzimelor (proteoliz parial, reglarea alosteric,
autostructurarea cuaternar, reglarea covalent).
5. Organizarea enzimelor n celul (ansamblurile enzimatice,
compartimentalizarea). Reglarea activitii enzimelor n celul. Importana
principiului de retroinhibiie.
6. Izoenzimele particularitile structurale i funcionale, valoarea lor
biomedical.
7. Deosebirile n componena enzimatic a organelor i esuturilor. Enzimele
organospecifice. Modificarea activitii enzimatice n diferite afeciuni
(enzimodiagnosticul).
8. Metodele de obinere i purificare a enzimelor. Cromatografia de afinitate.
9. Utilizarea enzimelor n practica medical. ntrebuinarea enzimelor imobilizate
n medicin.
10.
CINETICA ENZIMATIC

Studiaz viteza reaciei


enzimatice, lund n consideraie
factorii fizico-chimici ce o
influeneaz

VITEZA REACIEI ENZIMATICE

reprezintnumrul moleculelor de substrat


transformate n produs final pe unitatea de
timp (de regul - moli de produs format
pe minut)
Factorii care influeniaz viteza
reaciei enzimatice

Concentraia S
Concentraia E
Temperatura
pH
Influena [S] asupta vitezei
reaciei enzimatice
Grafic se reprezint sub form
de o curb de tip hiperbolic.
n perioada iniial a reaciei V
crete pe msur ce crete
[S].
La un moment dat cnd CA al
E se ocup de S V nu mai
crete. Ea rmne constant
i corespunde V max a
reaciei.
n cazul E alosterice curba
reprezint un aspect sigmoid
Influena [S] asupta vitezei
reaciei enzimatice Analiza curbei
arat 3 zone:
Enzime michaeliene
Zona a- v
c creste
proportional cu
b [s]

Zona b
cresterea v cu [s]
nu este
a proportionala

Zona c este
atins Vmax la [s]
infinita
Aceast curb este numit curba lui Michaelis-
Menten i se exprim prin ecuaia:
[S]
V0=Vmax x _________
Km +[S]

unde:
V0 - V reaciei iniiale
Vmax- viteza max
Km-constanta lui Michaelis Menten
[S] C% S
Aceast ecuaie descrie modul n care viteza
reaciei variaz in funcie de [S]
Semnificaia lui Km i
V max

Km-constanta lui Michaelis Menten


- este acea concentraie de S pentru care
V de reacie este jumtate din Vmax.
Km reflect afinitatea E pentru S i anume
cu ct Km este mai mic cu att afinitatea
este mai mare i invers.
V max- reflect capacitatea catalitic
maxim a E
Ecuaia lui Lineweawer-

Din
Burk:
curba lui
Michaelis Menten nu
poate fi determinat V
max (deoarece nu se
pot atinge c% infinite
ale substratului).
Se procedeaz la
linearizarea ecuaiei,
obinndu-se ecuaia
lui Lineweawer-
Burk:

1
VK
0ax[
S1
]V
mm
ax
Diagrama lui Lineweawer- Burk:

Reciproca ecuatiei
Michaelis-Menten
Influena [E] asupta vitezei reaciei
n condiii standard 2 mol de E ntr-o anumit
perioad de timp vor transforma de 2 ori mai
multe molecule de S dect 1 mol de E (relaie
direct proporional).
Influena t asupta vitezei
reaciei
Termolabilitatea (t)

Unele Ea
microorganismelor
termofile sunt active la t
de 80C
La t joase E se
inactiveaz (excepii:
catalaza: activitate max la
t=0 C)
Influena pH asupta vitezei
reaciei

Fiecare E are pH
optim propriu
(manifest activitate
max).
Majoritatea E celulare
au pH-ul optim- 6-8
(7,4)
excepii: hidrolazele
acide lizozomale pH=
5;
MAO din membrana
MC externa pH= 10.
Aciunea pH asupra activitii
enzimatice
La E digestive pH
optim este cel al
sediului lor de
aciune:
1. Pepsina pH 1,5
2,
2. Amilaza
pancreatic - pH
7,2,
3. Tripsina - pH 7,8-
8,0
Aciunea pH asupra
activitii enzimatice
Aciunea pH asupra
activitii enzimatice
pH optim e dependent
de:
1. gradul de ionizare a
grupelor funcionale,
2. afinitii E fa de S,
3. stabilitii E.
Aciunea pH asupra
activitii enzimatice
Centrul activ al
enzimelor contine
grupe ionizabile, acide
sau bazice, deci
modificarea pH-ului
are ca efect
modificarea gradului
de disociere si,
implicit, modificarea
vitezei de reactie.
Influenta efectorilor enzimatici

Efectorii enzimatici sunt substante cu structuri


chimice variate care aduse in mediul de reactie
pot influenta activitatea enzimei care catalizeaza
reactia

Efectorii enzimatici pot fi activatori sau


inhibitori.
Inhibitorii enzimatici
Inhibitorii enzimatici sunt compusi care influenteaza
negativ activitatea enzimelor pe care o pot anula definitiv
sau temporar

Ei pot afecta situsul catalitic al enzimei sau orice alta


regiune a moleculei, astfel influentand legarea
substratului de enzima

Actiunea inhibitorilor enzimatici este importanta pentru


controlul proceselor biochimice, pentru a intelege
mecanismele de actiune a unor medicamente, droguri,
otravuri, pentru a urmari etape dintr-un proces metabolic.
Inhibiia enzimatic
Deosebim:

1. inhibiie nespecific (T, pH, agenii


denaturrii )
2. inhibiie specific
Inhibiia poate fi reversibil i ireversibil.
Inhibiiie reversibil - inhibitori se fixeaza
slab, necovalent de E
Inhibiiie ireversibil - I covalent se fixeaz
de E cu formarea EI nedisociabil.
EXEMPLE DE INHIBITORI
IREVERSIBILI

Diizopropilfluorfosfatul (toxina neuroparalitica) se


fixeaz de OH-Ser n CA a acetilholinesterazei
(scindeaz acetilcolina) cu formarea E neactive.
n rezultat se menine efectul acetilcolinei n
permanen ce duce la paralici muscular i
moarte.

- ionii metalelor grele (Hg, Pb) inhib gruparea SH


a multor E;

- acidul iodacetic- inhib ribonucleaza


Inhibiie ireversibil
INHIBIIE IREVERSIBIL

Exemple:
Diizopropilfluorfosfatul se fixeaz de OH-serinei n CA a proteinazelor
INHIBIIE IREVERSIBIL
Tipuri de inhibitie
revesibil
Deosebim:

1. Inhibiie competitiv
2. Inhibiie necompetitiv
3. Inhibiie uncompetetiv
4. Inhibiie alosteric
Inhibiia competitiv
I se aseamn dup structur cu S.
Apare o competiie dintre I i S pentru CA.
Nu e posibil simultan fixarea S i a I.
E va fixa pe acel competitor care se afl intr-
o concentraie mai mare.
E+I ---- EI
Este o inhibiie reversibil- I poate fi nlturat
cu adugarea n exes a S.
Inhibiia competitiv
Inhibiia competitiv
Viteza de reactie atinge Vmax ca si cum I nu ar fi
prezent, daca se mareste suficient de mult [S]
nu modific V max,
dar crete mult Km, micornd afinitatea E pentru
S.
Exemple de I competitivi:

inhibiia
SDH cu malonat (SDH -oxideaza
succinatul in fumarat). Malonatul inhib
aceasta E datorit asemnrii cu S.
Sulfamidele substituie acidul p-amino-
benzoic din a. folic, indispensabil pentru
creterea microorganismelor, mpedicnd
dezvoltarea lor (antibacterian)
Exemple de I competitivi:

Sulfamidelesubstituie acidul p-amino-


benzoic din a. folic, indispensabil pentru
creterea microorganismelor, mpedicnd
dezvoltarea lor (antibacterian)
Exemple de I competitivi:

Sulfamidelesubstituie acidul p-amino-


benzoic din a. folic, indispensabil pentru
creterea microorganismelor, mpedicnd
dezvoltarea lor (antibacterian)
Exemple de I competitivi:

Alopurinol administrat n
tratamentul gutei
analog structural al
hipoxantinei inhib
xantinoxidaza i mpedic
transformarea hipoxantinei n
xantin i n acid uric.
Hipoxantina i xantina (sunt
mai solubile) nu se depun n
esuturi i sunt excretate ca
produi finali ai purinelor.
Exemple de I competitivi:

5 fluoruracilul -
Inhibitorul timidilat
sintazei
Metotrexatul - inhibitorul
dihidrofolatreductazei
Astfel se inhib sinteza
ADN (utilizate pentru a
diminua rata de
cretere a celulelor
canceroase)
Inhibiia necompetitiv
Inhibitorul nu se aseamn ca structur cu S
I i S se leag simultan cu E dar locusurile sint
diferite (I nu se leag n CA)
E+S+I--------- ESI
Acest tip de inhibiie nu se nltur prin exces
de substrat.
I necompetitivi scad V max dar nu afecteaz
Km
Inhibiie necompetitiva
Inhibiie necompetitiva
Deoarece I se leag n alt loc dect CA este
posibil formarea att a complexului ES ct i a
complexului ESI.
In cazul inhibitiei necompetitive, I chiar daca nu
se leaga la centru activ al E actioneaza asupra
acesteia deformand-o incat nu mai poate forma
cES la viteza normala,

iar cES format nu se mai descompune cu viteza


normala pt a forma P
Inhibiia necompetitiv
Tipuri de inhibitori necompetitivi:

cianurile, CO se fixeaz cu Fe 3+ din


citocromoxidaz ---se ntrerupe LR
inhibitori ai grupelor -SH libere ale enzimei: acid
iod acetic, p-clormercuribenzoat;
metale grele: argint, mercur, plumb, ce
actioneaza la nivelul grupelor -SH ale enzimei;
agenti de chelatare: EDTA.
Inhibiia necompetitiv
I poate fi nlturat de substane care l
leag numite reactivatori
!
TABEL COMPARATIV
INHIBITORI REVERSIBILI
Inhibitor competitiv Inhibitor necompetitiv
-are analogie structural cu susbtratul -nu are analogie structural cu substratul

-se leag n acelai loc cu substratul -se leag n alt loc decat substratul (nu
(competiioneaz pentru centrul activ) competiioneaz pentru centrul activ)

- scade afinitatea substratului pentru enzim - nu modific afinitatea substratului pentru


(crete KM) enzim (KM = constant)

- la concentraii mari ale substratului se - la concentraii mari ale substratului nu se


nltur inhibiia (Vmax = constant) nltur inhibiia (Vmax scade)

Ex. Acizi dicarboxilici pentru SDH Ex. Ioni ai metalelor grele (Ag+, Hg+)
(acidul malonic inhib CK) (se leag de gruprile SH din afara
Sulfonamida pentru FH2-sintetaza centrului activ al enzimelor- otrvire)
(Ab -blocheaz sinteza de acid folic necesar
bacterii)
Metotrexat pentru FH2 reductaza
(citostatic- inhib sinteza de ADN)
Efectul inhibitorilor asupra
vitezei de reactie
Inhibiia uncompetetiv

E+S----ES +I-----ESI
I se combina cu complexul ES
formand un complex ESI ce nu
poate genera P dorit
Reducerea [ES] creste afinitatea
aparenta e E pt S
Inhibitorii uncompetitivi scad
Km si Vmax
Inhibiia uncompetetiv
Inhibiia uncompetitiv
Lineweawer- Burk
Alte tipuri de inhuibiie
inhibiia prin modificarea covalent a
moleculei E - prin fosforilare pe baza
ATP-ului.
Unele E fosforilate pierd activitatea de
exemplu enzima glicogensintaza
Inhibiia prin exces de S n CA se
fixeaz simultan surplus de S ce nu
poate fi transformat. Este o inhibiie
reversibil nlturarea S
REGLAREA ACTIVITATII
ENZIMELOR
Mecanismele de activare
aE
Sunt : 1. nespecifice: temperatura , iradierea
2. specifice
- Se activeaz la:
1. majorarea concentraiei S cnd este
insuficient
2. majorarea cantitii E
3. introducerea Co cnd sunt insuficiente
4. Introducerea ionilor metalelor Fe, Cu
I. REGLAREA CANTITATIVA

Functie de dinamica SINTEZA/DEGRADARE

Enzime inductibile Ks > Kd


Enzime represibile Kd > Ks
Enzime constitutive Ks = Kd
II. REGLAREA CALITATIVA

Mecanismele de activare a E
- Deosebim urmtoarele tipuri de reglare a
activitii enzimatice:
1. Reglare covalent - proteoliza limitata
2. Reglare covalent fosforilare/
defosforilare
3. Autostructurarea cuaternar
4. Alosteric
II. REGLAREA CALITATIVA

II.1.Reglarea alosterica
(necovalenta)
Enzime alosterice. Efectori
alosterici
Sunt proteine oligomere alcatuite din mai multe subunitati
identice sau diferite, in numar par

Reactiile catalizate sunt endergonice si ireversibile;


imprima sensul unic al cailor metabolice din care fac
parte

Intervin in prima etapa a unui lant de reactii, asigurand


controlul intensitatii procesului si ireversibilitatea lui

Fiecare monomer poseda un centru activ; fixarea S pe


una din subunitati influienteaza legarea lui pe celelalte
prin fenomenul de cooperativitate
Enzime alosterice. Efectori
alosterici
Pe langa centri activi, monomerii prezinta si centri alosterici
de care se vor lega efectorii alosterici

Efectorii alosterici sunt compusi cu masa moleculara mica,


fara analogie cu S si care activeaza reactiile enzimatice
(efectori pozitivi) sau le inhiba (efectori negativi)

Efectorii alosterici sunt prezenti la locul de actiune al E


variind doar concentratia lor

E alosterice sunt inhibate de produsul de reactie prin


retroinhibitie sau inhibitie feedback
II. REGLAREA CALITATIVA
II.1.Reglarea alosterica de tip
heterotrop
Cinetica enzimelor alosterice ( ne-Michaeliene")
Dependena sigmoidal a V0 n funcie de [S]

Enzimele alosterice, spre deosebire


de enzimele Michaeliene au multiple
subuniti i multiple centre active

Legarea substratului poate f cooperativ


Tipuri de reglare alosteric
n funcie de poziia relativ a efectorului fa
de E n calea metabolic:

-feedback i feedforward-
-pozitiv (activare) i negativ (inhibiie)-
feedforward
Reglarea activitatii enzimatice
Retroinhibiie
Reglarea activitatii enzimatice
Reglarea covalent -
Proteoliz limitat
Unele enzime (proteine) se sintetizeaz n forma
neactiv de precursor proenzime (zimogeni)
Exemplu:
1) enzimele digestiei: pepsinogenul,
chimotripsinogenul, tripsinogenul, proelastaza,
procarboxipeptidaza - scindeaza proteinele in
stomac i duoden.
2) coagularea singelui e determinat de cascada de
reacii cu activitate proteolitic;
Proteoliz limitat
-estescindarea unui sector al catenei
n rezultatul creia E se
restructureaz i se formeaz CA.
H+
Pepsinogen ------pepsin
-42AA
Importana biologic a
prezenei formelor neactive
Zimogenii sunt produse la locurile de sintez
(mucoasa gastric pentru pepsinogen,
pancreasul pentru toate celelalte), activrile se
produc la locul de aciune (stomac, intestin
subire)
1. Protejaz de proteoliz proteinele celulelor
productoare de E.
2. Este o forma de rezerv a E, care rapid pot fi
activate i intervin n reacie.
Reglarea covalent - fosforilare-
defosforilare
unele E sunt active n forma fosforilat, iar
altele n forma defosforilat.
Ex.:
glicogen fosforilaza activ n forma
fosforilat;
glicogen sintaza este activ n forma
defosforilat
Reglarea covalent -
fosforilare-defosforilare
Reaciile de fosforilare sunt catalizate de kinaze
specifice.
E-OH + ATP -------- E-O-P +ADP
Defosforilarea are loc sub aciunea fosfotazei specifice
E-OP +H2O------- E-OH +H3PO4
Autostructurarea cuaternar
Este caracteristic E ce posed structur
cuaternar
Fiecare protomer n parte nu e activ
La asamblarea lor se modific conformaia
fiecrui protomer i corespunztor se modific i
conformaia CA, devenind astfel favorabil pentru
fixarea i transformarea S
Ex: proteinkinaza A
EE
S AlloM
s
CA
Izoenzimele- izoE
forme moleculare multiple ale E, ce catalizeaz
aceeai reacie chimic, dar difer prin structur,
proprieti fizice, chimice i cinetice
Diferite forme de izoE se pot gsi:
1. mpreun (LDH din ficat);
2. n esuturi diferite (fosfotaza acid n prostat i
hematii);
3. sau n diferite compartimente ale aceleiai celule
(MDH MC i Cit)
IzoE difer ntre ele prin:

1. sarcina electric (ce permite separarea


lor prin electroforez);
2. V max de cataliz,
3. sensibilitatea fa de modulatorii allos;
4. pH-optim de aciune;
5. termolabilitate, au afinitate diferit fa
de S.
STRUCTURA IZOE
Sunt E oligomere, cu structur cuaternar,
alctuite din cel puin 2 protomeri diferii
Ex. LDH (lactat piruvat)
Prezint un tetramer, alctuit din 2 tipuri de
subuniti (H inim; M- muchi) n
diferite raporturi; codificate de gene
diferite.
HHHH inim; HHHM;HHMM; HMMM;
MMMM muchi
Izoformele lactat dehidrogenazei (LDH)

LDH-1 (4H) - in inima


LDH-2 (3H1M) - in sistemul reticuloendotelial
LDH-3 (2H2M) - in plamani
LDH-4 (1H3M) - in rinichi
LDH-5 (4M) - in ficat si muschiul striat

(H este tipul de monomer intalnit in inima, iar M este monomerul caracteristic


izoenzimei hepatice si musculare)

Rol in diagnosticul medical


indicand distrugeri celulare
ROLUL izoenzimelor
1. n controlul metabolic ( faciliteaza adaptarea
metabolismului in diferite esuturi.)
Ex: in miocard predomina H4 (inhibat de piruvat) -
orienteaz oxidarea piruvatului pe cale aeroba.
M4 este activat de catre piruvat i orienteaz
transformarea piruvatului pe cale anaerob spre lactat.
2. n diagnosticul unelor stri patologice (variaia diferitor
forme de izoE)
LDH
Norma- 100-190U/L
Creterea de LDH 1 i LDH2:
1. infarctul miocardic
2. anemia hemolitic/ megaloblastic
LDH5 crescut - afeciuni hepatice,
necroza hepatic
Exemple de izoenzime:
1. Creatinfosfokinaza -2 tipuri de monomeri:
M-Muscle i B brain
2. LDH
3. MDH
4. Aldolaza
5. Fosfataza alcalin
6. Fosfataza acid
Creatinfosfokinaza (CPK)

CPK M2 Muchi
Miodistrofii
scheltic

Muchi Miocardiop
CPK MB
cardiac atii

CPK B2 Ischemii
Creier
cerebrale
Sistemele
polienzimatice
Fiecare celul a organismului conine
setul su specific de E.
Unele se gsesc n toate celulele, altele
sunt prezente doar n anumite celule
sau anumite compartimente celulare.
Funcia fiecrei E, nu este izolat, ci
strins legat de funcia altor enzime.
Astiel din E aparte se formeaza sisteme
polienzimatice sau conveiere.
Tipurile de organizare a
sistemelor polienzimatice
Se cunosc urmatoarele tipuri de
organizare a sistemelor
polienzimatice:
1. - funcional,
2. - structural-funcional
3. - mixt.
Organizarea funcional
enzimele sunt asociate n sistemul polienzimatic
cu ajutorul metaboliilor, care difuzeaz de la o
enzim la alta.
produsul reaciei primei E servete drept S
pentru E urmtoare etc.
Ex.: glicoliza. Toate enzimele participante la
glicoliza sunt n stare solubil, legtura se face
doar prin intermediarii metabolici.
E1 E2 E3 E4
A---------------- B------------- C---------- D---------- P
Organizarea structural-
funcional
E sunt fixate prin legturi slabe pe o protein
central, care poate fi chiar una din E.
Proteina central dispune de un bra care
fixeaz S i l duce la E1, care l transform n
P1;
P1devine S2 , braul l preia i l duce la E2, care
l transform n P2.
Avantajul este c braul duce de fiecare dat S la
E corespunztoare, potrivindu-l cu mare
exactitate pe CA, ceea ce asigur n ansamblu o
vitez mai mare dect cea corespunztoare
aciunii E neasociate.

Organizarea structural-
funcional
Ex.- complexul polienzimatic
piruvatdehidrogenazic, constituit din 3 E
i 5 Co
sintetaza acizilor grai constituit din 7
E legate structural de PPA, care n
ansamblu ndeplinesc funcia de sinteza a
AG.
E se pot aranja n lan, fixndu-se de MB.
Ex.enzimele LR, care particip la transferul
de H+ i e.
Tipul mixt de organizare
reprezint o mbinare a ambelor tipuri de
organizare, adic o parte din sistemul
polienzimatic are organizare structurala,
iar cealalta parte - organizare funcional.
Ex.- ciclul Krebs, unde o parte din enzime
sunt asociate n complex structural
(complexul 2-oxoglutaratdehidrogenazic),
ar alt parte se leag funcional prin
metaboliii de legtur.
Unitile de msurare a activitii E
1. 1 UI cantitatea de E care catalizeaz
transformarea unui mol de S ntr-un minut n
condiii standard
2. 1 Cat (catal) cantitatea de E care catalizeaz
transformarea unui mol de S ntr-o secund n
condiii standard(1U.I.=16,67 nkat)
Condiiile standard - pHul ~ 7,0; t = 25C;
p = 1 atm;
C substratelor 1 M.
1 cat = 6 107 UI
1 UI = 16.67 10-9 cat
Unitile de msurare a activitii E
Activitateaspecific reprezint
numrul de uniti enzimatice per mg
de protein-enzim
AS= Nr UI/mg protein
Este expresia puritii unei enzime
Metodele de separare i
purificare ale E
1. Dializ
2. Salifiere
3. Cromatografie
4. Gel-filtrare
5. Electroforez
Cea mai eficient
cromatografia de afinitate
Metodele de determinare a
activitii E
Viteza reaciei este proporional
cu
1.Viteza consumului substratului
2.Viteza formrii produsului
3.Viteza transformrii coenzimei
Cantitatea substanei respective
se determin colorimetric.
Deosebirea privind componena
enzimatic a organelor i esuturilor.
Enzimele organospecifice.

Enzimele indicatorii sunt localizate intracelular:


n citoplasm (LDH, aldolaza),
n MC * glutamatdehidrogenaza),
n lizosomi (-glucoronidaza, fosfataza alcalin).
Acestea E n norm n plasm se gsesc n c% foarte
mici.
La afeciunile celulare activitatea acestor E n plasm
este brusc mrit.
Utilizarea E n practica
medical
Preparatele farmaceutice contemporane sunt
asociate i conin ca regul urmtoarele enzime:
tripsin,
chimotripsin,
lipaz,
amilaz,
pancreatin,
bromelain,
papain,
rutin (vit. P).
Utilizarea E n practica medical
Efectele
exercitate de preparatele enzimatice
1.De substituie (E digestive)
2.Fibrinolitic i trombolitic
3.Antiedematic
4.Analgezic
5.Antiinflamatoare
6.Imunomodulatoare
Terapia cu enzime

Enzimele sunt ageni terapeutici unici ce produc


efecte importante i specifice.
Motivele care au limitat folosirea larg a enzimelor ca
medicaie e:
- distribuie redus n organism, dependena de
dimensiuni, sarcina i de fenomenele de glicozilare
(prin glicozilare proteinele sunt recunoscute de
receptori i fixate n anumite locuri
- posibilitate mic de dirijare extrahepatic, ficatul
avnd tendin de a capta i reine proteinele strine;
- inactivarea lor sub aciunea proteazelor digestive n
cazul administrarii orale, iar proteazele tisulare le
scurteaza de asemeni actiunea;
- potentialul lor antigenic, anticorpii formati pot
genera reacii de hipersensibilizare adesea grave i
pot inactiva enzima.
Tehnici propuse pentru optimizarea
proprietilor terapeutice ale
enzimelor.
- prin N-acilare a fost crescut semiviata asparaginazei,
folosit n leucemie
- metode de obinere a enzimelor imobilizate.
De ex. prin reticularea enzimei, ce conduce la agregate
insolubile, prin adsorbie pe polimeri sintetici ori prin
ataare covalent, sau prin incorporare ntr-un gel in
cursul polimerizarii.
Aceste preparate catiga rezistena la enzimele
proteolitice i sunt mai putin imunoactive dar pot fi
alterate proprietile farmacocinetice.
Asemenea avantaje au dovedit conjugatii cu
polietilenglicol (PEG) ai arginazei, ai
glutaminasparaginazei sau ribonucleaza, enzime cu efect
antitumoral.
Tehnici propuse pentru optimizarea
proprietilor terapeutice ale
enzimelor.
- incapsularea enzimelor in lipozomi -
microsfere cu membrana bistratificat
lipido- proteic, in hematii umane sau in alti
transportori celulari.
- Noile forme obinute prezint un potenial
de ntire tisular.
- De ex. in cazul unor boli genetice cauzate
de deficitul unor enzime lizozomale se
impune o terape de substituie, enzima
trebuind intit direct in lizozomi.