REZISTENTA

FENOTPICA LA
BACTERII
Introducere

Prin toleranta fenotipica se intelege modul de rezistenta pe care

bacteriile il dezvolta la cateva minute de la privarea de un
nutrient esential. .
Termenul a fost ales pentru a sublinia faptul c fenomenul se
dezvolt n toate bacteriile ca raspuns la schimbrile de mediu i
conduce la supravieuirea bacterian (distinct de cre terea
bacterian care caracterizeaz rezistenta).
De asemenea toleranta fenotipica protejeaza bacteriile impotriva
antibioticelor, indiferent de mecanismul lor de actiune.
Cel mai bine studiat mecanism de respuns al bacteriilor este
declanarea de autoliza, dar i alte procese de deces, care au loc
i sunt condiionate de rspunsuri stricte.
 Astfel, bacteriile coopereaz n mod activ, folosind
propriile lor maini de moartea enzimatic
pentru a obine ca rezultat final liza.
Faptul ca penicilina nu produce intotdeauna liza
celulelor bacteriene nongrowing ar putea fi
explicat prin urmatoarele trei evenimente:
1) O pierdere progresiv a autolizei celulelor
bacteriene,
2)schimbare compoziiei peretelui celular fcnd
peptidoglicanilor mai puin sensibili la hidroliz,
3) activarea unui proces ce reglementeaza
scderea activitaii enzimelor ce produc liza celulelor
bacteriene.
Cu toate ca autoliza se pierde ncet la bacteriile
nongrowing, rolul minor al acestui eveniment este
indicat de faptul c aceste bacterii nu lizeaz
dup adugarea enzimelor autolitice exogene .
Modul de actiune al penicilinei asupra celulei bacteriene
 n ceea ce privete compoziia peretelui celular,
studii cu privire la mecanismul de toleran
fenotipica pe Escherichia coli au artat c dup
30-60 de minute de foame, structurile peretelui
celular sufera modificri care fac peptidoglicanii
mai rezistenti la antibiotice.
Imediat dup oprirea creterii, rata sintezei
peptidoglicanului scade la 30% fata de rata
normala la E. coli. Sinteza acestui perete celular
modificat pare sa necesit activitatea proteinei de
legare a penicilinei 7 (PBP7).
Cu toate acestea, dei este importanta pentru
fenomenul de toleran fenotipice, alterarea
compoziiei peretelui celular pe toat suprafaa
celulei nu se produce suficient de rapid pentru a
explica debutul extraordinar de rapid al toleranei
fenotipice ce apare la cateva minute de la debutul
foamei. Debutul toleranei fenotipice se crede
c apare prin reglementarea enzimei hidrolitice,
Activitatea enzimelor
autolitice
Se gasesc in periplasma bacteriilor gram-negative si pe
suprafata celulara la bacteriile gram-pozitive.
Efectele antibacteriene ale antibioticelor beta-lactamice sunt
iniiate prin legarea antibioticelor la un grup specific situat pe
membrane similare PBPs. Aceasta legare inhib
transglicozilarea i actiunea transpeptidazei n sinteza peretelui
celular executata de PBPs i conduce la ncetarea creterii
bacteriene.
Rolul crucial al enzimelor autolitice n medierea morii
celulare a fost descris pentru prima dat la Streptococcus
pneumoniae, pe baza analizelor biochimice i fiziologice ale
unui mutant antibiotic tolerant creat prin mutagenez chimic.
 Studii suplimentare au demonstrat c tolerana la
antibiotice apare dac enzima autolitica nu se
declanata sau nu este activa. De exemplu, la E.
coli, care are mai multe enzime autolitice, gradul
de toleran i, n paralel, gradul de liz este
proporional cu numrul de defecte mutagene ale
enzimei. Activitatea specific sczut a unei
hidrolize a peretelui celular , N-acetilmuramoil-L-
alanina amidaza, a dus la scaderea activitatii
penicilinei si a altor antibiotice asupra peretelui
celulelor.
Liza celulei bacteriene
Raspunsul celulei
bacteriene
Cel mai izbitor exemplu de reglare fiziologic
negativa a autolizei este rspunsul strict care
apare n timpul privrii de un nutrient esenial.
Din moment ce privarea de nutrieni duce la
aparitia bacterilor nongrowing sau n cretere
lent, sistemul experimental cel mai frecvent
utilizat pentru studiul toleranei fenotipice implic
transferul de bacterii dintr-un mediu complet din
punct de vedere nutritional ntr-un mediu din care
lipsete un aminoacid esenial.
n cateva minute de la debutul foamei, bacteriile
se opresc din crestere, ca parte a unui raspuns ce
coordoneaza reducerea tuturor ratelor de sinteza
a macromoleculelor.
Dezvoltarea acestui rspuns este sub controlul
locusului relA, o gen prezenta n toate bacteriile.
Toleranta fenotipica la
bacterii
Toleran fenotipice poate fi produs prin diferite schimbari ale mediul
bacterian; de exemplu, prin scderea pH-ul mediului sau prin adugarea de
enzime proteolitice sau inhibitori ai enzimelor autolitice.
Este cunoscut faptul c bacteriile care cresc sinteza anumittor fosfolipide
ce rezult din membranele plasmatice la schimari de pH, au un nivel
crescut de rezisten la stres. Schimbarea compozi iei de fosfolipide se
coreleaz cu toleran fa de antibiotice active asupra peretelui celular.
De asemenea, adugarea de acid lipoteicoic la mediul de cre tere a
pneumococilor determin formarea de culturi sub forma de lan , care au o
mai buna rezistena la liza in faz staionar i de asemenea cres toleran a
la penicilin, ceea ce sugereaz c acizii lipoteicoici ar putea fi implicati n
controlul declansarii autolizei in vivo. Aceast presupunere este sus inut
de observaia c acizii lipoteicoici au rol in inhibarea activitatii enzimelor
autolitice la mai multe specii de bacterii, inclusiv streptococi i Bacillus
subtilis.
Rata de crestere/rata de moarte la
bacterii
Rata de crestere este invers proportionala cu rata de de moarte
(liza) la celulele bacteriene. Prin urmare, toleran nu apore
numai la bacterile nongrowing complet latente, dar, de
asemenea, apare si la celulele bacteriene care se multiplic
lent.
Relaia complex dintre creterea i moartea bacteriilor poate
fi vzut si prin alte doua constante. Toleranta fenotipica la
bacteriile nongrowing, nu prezint o ntrziere n reluarea
creterii atunci cnd concentraia antibioticului scade sub
valoarea normale. Acest lucru st n contrast cu fenomenul
efectului postantibiotic care ntrzie regenerarea dup
expunerea la antibiotice a celulelor n cretere.
Toleranta fenotipica in
vivo
Importana toleranei fenotipice care influeneaz
uciderea bacteriilor in vivo a fost subestimata.
Interferena agenilor bacteriostatici, ca sulfadiazina,
cloramfenicol, acid helvonic cu activitatea bactericida
a antibioticelor, inclusiv penicilina, streptomicina i
izoniazida, reprezint unul dintre cele mai timpurii
exemple clinice de toleran fenotipice.
Cerinele complexe si multiple din punct de vedere
nutritiv ale importantilor ageni patogeni umani, cum
ar fi neisseriae, S. pneumoniae, i stafilococi face ca
acesti agenti patogeni sa se confrunt adesea cu
nivele suboptimale de nutrieni la om. Bacteriile
observate n medii ecologice natural s-au dovedit a
crete lent, ca urmare a epuizrii nutrieni.
 Sursele de infectare, cum ar fi lichid
cefalorahidian, lichid articular, vegetaii cardiace
sau abcese sunt susceptibile de a avea deficit de
nutrieni eseniali pentru multe specii de bacterii.
Limitarea nutrientului d natere la schimbri
fiziologice importante, inclusive scderea
permeabilitii membranele exterioare sau
citoplasmatice pentru medicamente, modificri n
structura peptidoglicanului astfel nct s reziste
la actiunea enzimelor degradative, sau pierderii
de PBPs.
Aceast tranziie este nsoite de schimbri
majore ale metabolismului celular, inclusiv
modificrile in compoziia peretelui celular.
Identificarea fazelor stationare induse i
caracterizarea rpoS, o gen care codific un factor
sigma alternativ n E. coli, care controleaza multe
gene induse la debutul fazei staionare, este doar
un exemplu care ilustreaz adaptri dinamice ale
 ncepnd cu anii 1980, date fiabile au devenit disponibile care
demonstreaza n mod clar c bacteriile cresc mai lent n multe
animale fata de cultrile in vitro. n special, meningita la iepure
este un model ce ofera perspective interesante in
comportamentul in vivo de cretere a bacteriilor.
S-a demonstrat c, dup inoculare n LCR, pneumococii au
demonstrat o perioad de laten lung nainte de debutul
creterii bacteriene i ratele de cretere maxim a fost
semnificativ mai lent dect cele realizate in vitro.
Studiile utiliznd meningita la iepure a demonstrat
importana terapiei antimicrobiene bactericide pentru a realiza
un tratament.
S-a descoperit o rata de vindecare de 79% la pacienii care au
primit penicilina G (Bactericida), n monoterapie, si numai
30% la pacienii care au primit penicilina si chlortetracicline
(bacteriostatic).
Mecanismul de actiune al beta-
lactamilor asupra bacteriilor
Efectele nocive ale toleranei fenotipice asupra
activitii bactericide a antibioticelor beta-lactamice a
condus la cutarea de antibiotice, care ar putea rupe
regula de toleran. .
Pentru a identifica ageni antibacterieni capabili de a ucide E. coli
dup nfometare, o E. coli lizina auxotrop a fost crescut ntr-un
mediu definit din punct de vedere chimic i apoi transferata intr-un
mediu care nu contine lizina. La diferite intervale de timp dup aceea,
culturile au fost expuse la o gam larg de antibiotice.
Cele mai multe antibiotice au euat complet, inclusiv, beta-lactame,
aminoglicozide i chinolone. Cu toate acestea, trei excep ii
interesante au fost gsit: penemele, nocardicinele i cicloserine care
au fost capabile de a ucide i lizeaz E. coli dup 10 minute de
foame. Aceast activitate a fost pierdut n cele din urm dupa 30 de
minute de infometare.
 Aceste experimente au furnizat unele mecanisme si
perspective importante asupra toleranei fenotipice:
1) Activitatea bactericid a acestor antibiotice asupra
bacteriilor nongrowing deriv dintr-un mecanism similar
cu al celulele n cretere, n care este necesar o
enzima autolitica activ. 2) Activitatea litic la bacterii
nongrowing este o funcie direct a concentraiei
antibioticului; adic, cu ct este mai mare concentraia
antibioticul, cu atat creste gradul de liz. La
concentraii extrem de ridicate (de 100 de ori), chiar
benzilpenicilina este eficienta n lizare E. coli la scurta
perioada de timp (5 min) de la debutul foamei. 3)
Activitatea litic varieza invers proportional cu durata
de foame, inainte de expunerea la antibiotic, cu cat
creste durata de foame nainte de expunerea la
antibiotice, cu att mai puin are efect antibioticul.
Chiar si un antibiotic eficient, cum ar fi imipenemul,
este inactiv mpotriva bacteriilor infometate pentru mai
mult de 60 min.
 In modelele actuale, efectele antibacteriene ale
antibioticelor beta-lactamice sunt iniiate prin legarea
antibioticului la PBPs. PBPs sunt astfel covalent acilate
i eliminate din fondul metabolic activ al PBPs. Aceste
evenimente explica oprirea creterii celulare.
Printr-un mecanism nc necunoscut, inhibarea sintezei
peretelui celular activeaza enzima autolitica care duce
la degradarea peretelui celular si implicit la liza celulei.
n cazul toleranei fenotipice la bacteriile nongrowing,
enzimele autolitice nu sunt declanate.
Reinitieriea creterii prin completarea lipsei de
aminoacizi duce la restaurarea fenotipului autolitic,
sugernd c nfometarea bacteriilor duce la reglarea
negativa a activitatatii cilor de declanare mai
degrab dect la eliminarea enzimei autolitice n sine.
Aceast ipotez este susinut de faptul c enzima
autolitica din preparatele tulpinilor nongrowing isi
pstreaz activitile hidrolitice atunci cnd este
transferata la celule n cretere.
Toleranta genotipica la
bacterii
Spre deosebire de tolerana fenotipica, tolerana genotipica
apare chiar i n timpul creterii active, ea poate rezulta din
mutatii genetice. Cel mai simplu exemplu de toleran este
pierderea funciei de LytA fr de care un pneumococ lizeaz i
moare.
Intr-un studiul recent, un mutant pneumococic nu a fost lizat
dupa tratarea cu toate antibioticele testate, inclusive beta-
lactame, aminoglicozide i vancomicin. Analiza genei afectate,
vncS, a artat c asasta este un senzor pentru un sistem de
reglementare cu dou componente, VncS si VncR.. Nu este clar
dac acest control se produce la nivelul transcripia, translaia
sau enzimei .
Cu toate acestea, VncS-VncR functioneaza ca staie releu
pentru semnalele extracelulare; De exemplu, densitatea
celular n faza de liza staionara sau legarea de antibiotice la
PBPs. Natura semnalului i efectele sale care au ca rezultat
activarea enzimei autolitice nu sunt cunoscute.
 Toate bacteriile au un program de legare intre
rata de cretere i rata de deces.
Antibioticele care intra in circuitul endogen cu
scopul de a ucide agentii patogeni, nu vor ucide
bacteriile decat daca acestea cresc haotic.
Mecanismele de actiune a acestui circuit care are
rol in liza bacteriilor sunt necunoscute.
Recent s-a descoperit ca semnalul de transductie
are rol in mortea bacteriilor.
Autoliza bacteriilor este critica pentru dezvoltarea
noilor antibiotice, in special cele care nu vor esua
in cazul de crestere in vivo.