Replicarea ADN

CE ESTE REPLICAREA ADN?

Biosinteza ADN
Are loc astfel nct s fie asigurat
stabilitatea genetic n organism i n
cadrul speciei (este o modalitate
specific de biosintez care permite
conservarea i transmiterea informaiei
genetice de la o generaie la alta).
 Cand i unde are loc replicarea
ADN?
La eucariote replicare are loc doar n faza S, de sintez, a
ciclului
celular, faza separat de faza mitotic M prin perioadele de
gol
(gap) sintetic G1 i G2.
S
phase

Faza S a ciclului G1 interphase G2

celular Mitosis
Nucleu -prophase
-metaphase
-anaphase
-telophase
REPLICAREA ADN PE SCURT

Dublul helix al ADN se desface i se

construiesc pe fiecare dintre cele dou
catene parentale (numite catene matri
sau template) cte o caten complementar
replica celor parentale.
Replicarea cu ceva mai multe detalii
1. Dublul helix se desface.

2. La jonciunea dintre cele dou

catene parentale desfcute ia
natere bifurcaia de replicare.

3. O nou caten se formeaz prin

mperecherea nucleotidelor libere
cu bazele complementare de pe
catena veche.

4. Rezult dou molecule-fiice

de ADN care conin cte o caten
Parental i o caten nou.
 CARACTERISTICILE REPLICARII ADN

1. semi-conservativ
2. complet
3. bi-direcional (dei are loc ntotdeauna n
direcia 5 3 !!!)
4. semi-discontinu
1. Replicarea ADN este semi-conservativ
(Meselson-Stahl, 1958).
Fiecare molecul
fiic de ADN conine
o caten parental
intact asociat cu o
caten nou
sintetizat.
Meselson & Stahls Famous Experiment (1958)
 2. Replicarea este complet
Replicarea ADN antreneaz ntregul
cromozom, rezultand doi cromozomi
identici.

Cromozom circular
(procariote)
 3. Replicarea ADN este bi-direcional
(Cairns, 1963).

Replicarea ncepe ntr-un punct bine

determinat numit origine de replicare (ori) i
pornind din acest punct se deruleaz simultan
n ambele direcii.

bidirecional
 4. Replicarea este semi-discontinu
Reiji Okazaki a propus i demonstrat n 1968 c n timp ce sinteza
unei catene (catena leading) este continu, sinteza celei de-a doua
catene (catena lagging ) este discontinu (n runde de 150-250 nt).
 ntrebare:
Urmtoarele afirmaii n ceea ce privete
replicarea ADN sunt corecte:
1. Replicarea se realizeaz pe anumite poriuni din
cromozom.
2. Sinteza ADN pe catena lagging este continu.
3. Fiecare moleucl fiic de ADN conine dou
catene nou sintetizate.
4. Fiecare caten a ADNdc acioneaz ca
matri/template pentru o nou caten de ADN.
 Elementele eseniale necesare
replicrii
Sunt necesare cinci elemente esniale :

1. ADN parental- matria (fiecare caten de ADN

servete ca matri)
2. cele 4 dezoxiribonucleozid trifosfai dNTP (dATP,
dGTP, dTTP, dCTP)
3. cele 4 ribonucleozid trifosfai NTP (ATP, GTP, UTP,
CTP); aceasta sugereaz necesitatea sintezei de
ARN n cursul sintezei de ADN!!!
4. Proteine specifice, majoritatea enzime
5. Mg2+
 Proteine specifice implicate n replicare

Proteina Funcia
Helicaza Desface dublul helix ADN
Single-stranding Stabilizeaz ADNmc i previn renaturarea lui (refacerea
binding proteins (SSB) dublu helixului)

Topoisomeraze Elimin torsiunile produse de helicaz printr-un

mecanism de tiere-coasere
ADN primaza Iniiaz sinteza ARN (!!!) primer
ADN polimeraze -ADN Polimerizarea dezoxiribonucleotidelor folosind matria
dependente de ADN
ADN ligaza Leag fragmentele de ADN nou sintetizate
 Enzimele implicate n replicarea ADN

Helicase desface SSB stabilizeaz Primaza sintetizeaz

dublu helix ADNmc un ARN primer pe
matri de ADN

ADN polimeraza III ADN polimeraza I Ligaza leag /coase

leag nucleotidele (exonucleaza) fragmentele de ADN
pt. a forma noul ADN nlocuiete ARN primer (frag. Okazaki).
cu ADN
 Helicaza desface dublul helix
Proteina DnaB
Hexamer
Catalizeaz un fel de denaturare in vivo a
ADN (catenele dezrsucite pot fi citite de
ctre enzimele replicrii)
necesit energie; consum 2 molecule de
ATP per 2 legturi de hidrogen desfcute.
Single stranded proteins (SSBs)

Tetramer
Se leag de cele dou catene ADN i le
menine separate prevenind renaturarea lor
Trebuie s fie ndepartate nainte ca noua
caten de ADN s poat fi sintetizat
 Topoisomerazele

enzime care rezolv tensiunile sterice

(torsiuni +, de dreapta) aprute n
cursul dezrsucirii (cu o vitez de 100
revoluii/sec !!!) duplexului ADN, i
care ar putea bloca replicarea
 Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I
acioneaz ca o endonucleaz reversibil, printr-un mecanism
de tiere-coasere care permite rotaia liber a ADNmc (aciune
de suveic) .
economic (nu necesit aport energetic): hidrolizeaz o
legtur fosfat diesteric a crei energie o conserv ntr-o legtur
fosfat esteric implicnd Tyr din centrul activ al enzimei i
ulterior o folosete la refacerea catenei incizate

Enzima Enzima

tiere coasere
ADN
relaxare
Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II

ADN-giraza
Dimer
Introduce n molecula de ADN supertorsiuni
(-), spre stnga, n sens contrar celor create de
naintarea bifurcaiei de replicare; astfel
compeseaz n avans constrngerile impuse de
desrsucirea duplexului de ADN
Necesit energie (consum de ATP)
 ADN polimerazele-ADN dependente:
Copiaz catena matri n direcia 3 5

Sintetizeaz catena nou n direcia 5 3: formeaz legturi

fosfat diesterice ntre dou dNTP vecine dictate de template, prin atacul
nucleofil realizat de ctre gruparea 3-OH al primului nucleotid asupra gruprii
fosfat din dNTP urmtor)

Necesit un primer deoerece nu poate initia sinteza unei catene noi (ARN-
ul sintetizat de primaz servete drept primer)

AUTO-CONTROL: Au activitate 3' -> 5' exonucleazic, care st la baza

capacitii de autocontrol sau de PROOF-READING: desface nucleotidele
greit mperecheiate de la captul 3 al catenei n cretere.

PROCESIVITATE (Procesivitatea este capacitatea polimerazei de a se menine

legat de matri; este o expresie a numrului de nucleotide adugate la lanul
ADN n cretere nainte ca polimeraza s se disocieze de matir)
 REACTIA CATALIZAT DE ADN POLIMERAZ
Cap 5'
P P

CH2 Base CH2 Base

O O

P P

CH2 Base CH2 Base

O O

H20
+
P 3'
P P
P OH P Piro-
fosfat
P CH2 Base
O
5' CH2 Base
O

OH
3'
Cap 3 (n cretere)
OH
 Clase ADN polimeraze -ADN
dependente:

procariote:
ADN pol I, II, III, IV, V

eucariote:
- ADN pol , , , ,
 Proprietile ADN polimerazelor la procariote

ADN polimeraza I II III

Gena Pol A Pol B Pol C

Nr. subuniti 1 >4 >10

Activitate exonucleazic (3' -> 5') da da da
sau proofreading?
Activitate exonucleazic 5' -> 3'? da nu nu
Viteza polimerizrii (nucleotide 16-20 5-10 250-1000
adugate/sec)
Procesivitatea (nucleotide mic mare foarte mare
adugate nainte de disociere) (3-200) (10,000) (500,000)
Este ADN polimeraza I polimeraza
replicativ principal?
 DNA polimeraza I nu este
polimeraza replicativ principal!
Enzima este prea lent!
ADN polimeraza I catalieaz ncorporarea dNTP cu o vitez maxim de 20
nt/sec: ar avea nevoie de 53 zile pentru a replica integral cromozomul E.coli,
care n realitate se divide la fiecare 20 min.

Enzima nu este suficient de procesiv.

Enzima este prea abundent.
Exist aproxiamtiv 400 molecule de ADN polimeraza I per celul E.coli i
doar 2 bifurcaii de replicare per celul.

Celulele prezentnd mutaii polA1 sunt viabile.

 DNA polimeraza III este
polimeraza replicativ

Proprietile ADN pol III sunt potrivite pentru o

enzim care deine un rol central n replicarea
ADN: are o procesivitate foarte mare i
catalizeaz polimerizarea la o vitez foarte
nalt (250-1000 nt/sec).
Sinteza catenei leading.
 Care este rolul ADN polimerazei I ?
La ce folosete activitatea 5-
3exonucleozic, specific
acestei polimeraze?
La ce folosete activitatea
polimerazic a ADN pol I ?
ndeprtarea primerului de la
captul 5 al lanului n
cretere
Sinteza catenei lagging,
nlocuirea cu dNTP a locului
lsat liber de primer i
repararea leziunilor ADN (ex.
leag dNTP pe locul liber
aprut dup ndeprtarea baze
greit mperechiate)
 ADN polimerazele la procariote
(continuare)
ADN pol II este implicat n reparea leziunilor ADN (are activitate
3' -> 5 exonucleazic.

ADN pol IV
- Pol IV este o ADN polimeraz predispus la erori de mperechere
(nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II i pol I)
- Pol IV este responsibil de 50% din mutaiile adaptative.

ADN pol V
- Pol V aparine unei ci speciale de reparare (un fel de ultima
barier) denumit calea SOS de reparare a ADN.
- Pol V este sintetizat cnd celula este expus la doze mari de
radiaii sau de mutageni, cnd pot s apar lez. majore ADN.
 Proprietile ADN polimerazelor la eucariote

ADN pol

localizare nucleu nucleu mitocondrie nucleu nucleu

funcie nlocuire reparare sinteza ADN Replicaza reparare

primer mitocondrial

Sinteza Sinteza
catena caten
lagging leading
similaritate Pol I Pol II Pol II Pol III Pol II
cu enzime
de la
procariote
Primaza:
- Sintetizeaz
oligoribonucleotidul
(ARN primer) iniial
pe care se ataeaz
ADN polimeraza.

- ARN primer este

format din 4-12
ribonucleotide.

- Noua caten de ADN

se constuiete prin
adugarea de
nucelotide la captul 3
al ARN primer.

- ARN primer e nlocuit

n final cu ADN.
 ntrebare:
ADN polimeraza:
A. Initiaz sinteza lanului polinucleotidic
B. Sintetizeaz un lan polinucleotidic n diercia 3- 5
C. Citete matria de ADN n direcia 5- 3
D. Produce cte o molecul de pirofosfat la adugarea
fiecrei nucleotide la catena n cretere.
 ETAPELE REPLICRII ADN
(i elementele-cheie ale fiecrei etape)

Iniierea: primozomul- un complex de proteine

i originea replicrii ori

Elongarea: replizomul- un complex de proteine,

asociate cu ADN cu rol n sinteza
catenelor noi de ADN

Terminarea: proteina Tus- situsul de

terminare ter
REPLICAREA ADN LA
PROCARIOTE
 1. INIIEREA

controleaz ntregul proces de

replicare!
 Origineareplicrii
Iniierea replicrii 5 3

Identificarea originii de 3 5
replicare

Dezrsucirea mediat de 5 3
ctre helicaz (denaturarea) 3 5
duplexului ADN cu fomarea
ADNmc i a bifurcaiilor de
replicare
5 3
3 5
Legarea SSB la ADNmc

Formarea primozomului 5 3
(conine i primaza) 3 5

Sinteza ARN primer

5 3 5 3
3 5
5 3
 Originea replicrii
Originea replicrii
(oriC) este o regiune de
245 perechi baze bogat
n AT
OriC este recunoscut
oriC
de ctre proteina dnaA
care se leag la oriC, i
care mpreun cu
proteina dnaB (helicaza)
desface ADNdc
(folosind ATP).
 Primozomul
- elementul cheie al iniierii-
Primozomul este un complex de proteine care este
format din:
- dnaB (helicaz)
- dnaC (aperon al dnaB: asist plicaturarea dnaB)
- primaza
- alte proteine
Primozomul se deplaseaz mpreun cu bifurcauia
de replicare, consumnd ATP
Primozomul este responsabil pentru sinteza ARN
primer.
2. ETAPA DE ELONGARE
 Etapa de elongare
-Sinteza de ADN prin adugarea de dezoxiribonucleotide (una cte
una) iniial la captul 3 al ARN primer, ulterior la captul 3 end
al catenei n cretere.

3 5
5 3
3 5
5 3

3 5
5 3
3 5
5 3
 Etapa de elongare
-Catena parental 3- 5 (care este citit n aceei direcie cu
deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat continu.
-Catena nou astfel sintetizat este catena leading.
 Etapa de elongare
-Catena parental 5- 3 (care este citit n direcie opus fa de
deplasarea bifurcaiei de replicare) este copiat discontinu.
Catena nou astfel sintetizat este catena lagging i este sintetizat
n fragmente mici (1fragment per rund sintez)-fragmentele Okazaki
 Etapa de elongare
Replicarea ADN la E. coli are viteza ~1000 nt/s
Polimeraza III (subunitatea ) formeaz un inel care
alunec pe ADN matri i care crete procesivitatea
miezului Pol III de la 10-15 la>5000 perechi baz
35 diametru; (+) interior, (-) exterior
 Replicarea bidirectionala
a cromozomului circular la
procariote produce un
intermediar n forma literei
Theta.
ori

ter

Replication
Forks
 Replizomul
- elementul cheie al elongarii-
complex de proteins care cuprinde toate
enzimele i factorii necesari replicrii ADN.
Probabil ataat de membrana nuclear, iar
ADN ar strbate replizomul.
este responsibil pentru sinteza a dou catene
noi de ADN.
 Schema etapelor de iniiere i elongare
3 5
5 3
3 3 5
5 Primase
Singlestrand
LagingStrand binding
5 proteins
Okazaki 5
fragment 3
5
RNA
Primers
DNA
Polymerase
5
3
Helicase

LeadingStrand
5
3
3. ETAPA DE TERMINARE
 Terminarea replicrii
Regiunea de terminare :
- situat la 180 grade fa de ori;
conine capcane pentru bifurcatia
de replicare
- la acest nivel bifurcaiile de TerD
replicare se ntlnesc i dezleag
catenele de ADN nc asociate. TerA

Situsurile de terminare oriC TerC

- sunt pori care permit trecerea TerB
bifurcaiei de replicare ntr-un
singur sens;
- conin 23 perechi de baze
 Terminarea Replicarii
Un set de situsuri Ter opresc bifurcaia de replicare
care progreseaz n sensul acelor de ceasornic, al 2-lea
set blocheaz bifurcaia de replicare care avanseaz n
Invers acelor de ceasornic:

Situsurile Ter
foreaz cele dou
bifurcaii de
Cromozom replicare s se
ntlneasc ntr-un
punct specific.

TerB TerA
ELEMENTELE CHEIE ALE TERMINRII REPLICRII:
SITUSURILE TER I PROTEINA TUS

Situsurile Ter sites sunt locurile de legare ale proteinei Tus.

Tus: 35.8 kD
activitate de legare la Ter
Monomer
Bifurcaia de replicare
Tus
oprit ntr-o
DNA manier polar

Ter

Tus poate inhiba progresiunea bifurcaiei de replicare

direct prin legarea de DnaB helicaz, inhibnd dezrsucirea
helixului.
Repetiia este mama
nvturii
 Replicarea
3
3 5
5
3

5 3
5

Helicaza se leag la originea de replicare i

dezrsucete dublu helixul ADN.
SSB previn renaturarea ADN.
Primaza sintetizeaz ARN primer.
 Replicarea
Direcia de avansare a 3
bifurcaiei de replicare
3 5
5

5 3
5

DNA pol adaug nucleotide la ARN primer.

 Replicarea
Direcia de avansare a
3
bifurcaiei de replicare
3 5

5
3

5 3
5

DNA pol verific bazele mperecheate i le nlocuiete

pe cele greit mperecheate.
 Replicarea
Direcia de avansare a
3
bifurcaiei de replicare
3 5

5
3

5 3
5

Sinteza catenei leading continu n direcia 5 to 3.

 Replicarea
Direcia de avansare a
3
bifurcaiei de replicare
3 5

5
Fragment Okazaki
3

5 3 5 3
5

Sinteza discontinu produce segmente ADN numite

fragmente Okazaki.
 Replicarea
Direcia de avansare a
3
bifurcaiei de replicare
3 5

5
Okazaki fragment
3

5 3 5 3
5

Alungirea fragmentului Okazaki.

 Replicarea

3
3 5

5
3
5 3 5 35 3
5

Alungirea catenei leading i sinteza de noi fragmente

pe Okazaki msur de bifurcaia mai avanseaz.
 Replicarea

3
3 5

5
3
5 35 35 3
5

Alungirea noului fragment Okazaki, n paralel cu

alungirea catenei leading .
 Replicarea

3
3 5

5
3
5 35 35 3
5

Activitatea exonucleazic a ADN pol I

ndeprteaz ARN primer.
 Replicarea

3
3

5
3
5 35 3
5

Activitatea polimerazic a ADN pol I umple golurile.

Ligaza formeaz legturi fosfatdiesterice ntre
gruparea 3 OH de la captul unui fragment Okazaki cu
gruparea 5 fosfat de la captul altui fragment Okazaki.
.
 REPLICAREA ADN

3 Pol III synthesises leading strand

2 1 Helicase opens helix
Topoisomerase
nicks DNA to 4 Primase synthesises RNA primer
relieve tension
from unwinding 5 Pol I excises RNA primer; fills gap
6
7

Pol III elongates primer; DNA ligase links Okazaki

produces Okazaki fragment fragments to form
continuous strand
 ntrebare:
Fragmentele Okazaky sunt:
Produsul aciunii helicazei
Lanuri ADN sintetizate n cadrul catenei leading
n cursul replicrii
Regiuni ale ADN care nu codific informaie
pentru sinteza de ADN.
Fragmente relativ scurte de
polidezoxiribonucleotide cu cteva ribonucleotide
la captul 5.
Replicarea simultan prin
formarea de bucle ale matriei
catenei lagging.
 Replicarea simultan: molecula ADN pol III este
responsabil de sinteza ambelor catene de ADN.
 Caracteristici ale replicrii la
eucariote
Multiple origini de replicare
Replicarea este bidirectional
Are mai multe origini de replicare
deoarece molecula de ADN este foarte
lung i viteza de aciune a replizomului
este mic
Histonele vechi se asociaz cu duplexul
nou care conine catena leading.
Multiple regiuni ori la eucariote

Bubbles Bubbles
 Tabel comparativ:
Procariote Eucariote
1 ori region Multiple ori regions
2 bifurcaii de replicare per 100 bifurcaii de replicare per
cromozom cromozom
Viteza replicrii Viteza replicrii
1.000 perechi baze/sec 100 perechi baze/sec

Lungime frag. Okazaki Lungime fragmente Okazaki

1000-2000 nucleotide 150-200 nucleotide

1 eoare la 1mil-10mil 1 eroare la 1000 mil

replication.swf