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Salvia Bogotensis
Organizaci
Se organizaron cuatro grupos de tres animales cada uno, de los cuales el n
primero correspondi al grupo control.
1 ml de emulsin se aplic en dos sitios distintos del msculo pectoral de Inmunizaci
n
gallinas de raza High-Line en edad de postura (20 semanas) mantenidas en
jaulas individuales con agua y alimento ad Libitum.
Preparaci
A 1mL de adyuvante de Freund se le agreg gota a gota 1 ml de estas n de la
emulsin
soluciones con agitacin vigorosa para obtener buena emulsificacin.
Lectina de
S.
Se prepararon soluciones de 100, 400, y 1000 g/ml en PBS (Fostatos 20mM, Bogotensis
NaCl 150 mM) a Ph 7,2.
Inmunizacin
Esquema de inmunizacin
Dosis de LSB en Das en los que Dosis Total en
g/ml se realiz la g/ml
inoculacin.
50 0, 10, 20, 29 200
200 0, 10, 20, 29 800
500 0, 20 1000
El volumen final
Se escogieron
obtenido fue de 43
yemas de huevos
ml con una
correspondientes a
concentracin de
las dosis de 200 g
(1,28 mg/ml de
en la inmunizacin.
proteina)
Se utiliz la
Se utilizaron 8
metodologa de
yemas (13ml/yema)
extraccin con agua
y se llevaron a un
destilada
volumen final de
acidificada y se
1040 ml con 936 ml
precipit con
de agua destilada.
sulfato de amonio.
Se utiliz el mtodo
Se obtuvo un
de extraccin que
volumen de 40 ml
no requiere
con una
acidificacin del
concentracin de
agua y
0,9mg/ml de
precipitacin con
proteina.
sulfato de sodio.
Otras metodologas
estudiadas.
Se ensayaron los mtodos de
Polson et al. y Jensenius y Koch
(22), que utilizan dilucin con
buffer y precipitacin con PEG
8000 al 3,5% o 4,4%,
respectivamente;
El mtodo de Jensenius et al.
precipitando con sulfato de
dextrano y CaCl2;
DETERMINACIN DE PROTEINA
POR EL MTODO DE BRADFORD
A partir de la curva de
Se incub durante 15 Se ley a 595 nm en un calibracin se
minutos a temperatura lector de microplaca determin la cantidad
ambiente. BioRad Model 550. de protena por
interpolacin.
Cuantificacin de la IgY purificada por el
mtodo del cido bicinconnico BCA.
Se dej incubar
durante 30 minutos a
37C y se ley a 540
nm.
Ensayo ELISA
Fenil-sefarosa-4B
Sephacryl S-200
Sephacryil S-500
Cromatografa
tioflica
DEAE-Sephacel
Se sembraron 9ml Se equilibr con
del extracto sin tampn fosfatos
acidificar (8,2 mg) 70mM ph 6,3
La fraccin no La fraccin
retenida se eluy retenida se eluy
con tampn de con tampn fosfato
equilibrio ph 6,3-NaCl 1M
La fraccin
retenida y no
retenida se
dializaron contra
bicarbonato de
amonio 20mM y
se congelaron
Fenil sefarosa 4B
Se sembr
Se tomaron
sobre una
4ml (3,6 mg) Se equilibr
columna de
del extracto con NaCl 1%
fenil sefarosa
sin acidificar
4B (1X 50 CM)
Se lav la
La fraccin La fraccin no
columna con
retenida se retenida se
50 ml de
eluy con agua eluy con NaCl
acetonitrilo al
desionizada al 1%
70% (v/v)
Sephacril S-200
Sobre una
columna de
sephacril S-200 se
Se eluy con NaCl
sembraron 3ml
al 1%
(2,7mg) de
extracto sin
acidificar.
Sephacril S-500
Sobre una
columna de
sephacril S-200 se
Se eluy con NaCl
sembraron 1ml
al 1%
(0,9mg) de
extracto sin
acidificar.
Cromatografa tioflica
Se adicionaron 400 l
Se utiliz un soporte de Se elimin el carbonato
de B-MESH al 99% y se
sefarosa 4B activado de sodio en un embudo
dej en agitacin
con divinil sulfona y se resuspendi en 2ml
permanente durante 18
(DVS). de esta misma solucin.
horas.
Se sembraron 3 ml
El gel fue resuspendido Se agregaron 200l (2,7mg) de extracto sin
en 4ml de carbonato de gota a gota en acidificar y se
sodio 0,5 M y ph 11,0 y constante agitacin agregaron 71 mg de
se dej en agitacin durante 15 minutos y sulfato de sodio por
suave. se dej ocho horas. mililitro de extracto.
Finalmente
La elucin del no
retenido se realiz
con tampn de
equilibrio y la del
retenido con buffer
fosfatos 50mM ph 7,3.
Las fracciones
provenientes de las
diferentes
cromatografas se
recolectaron y
algunas se
concentraron en
Microsep Omega de
10 kd a 7000 rpm.
Las fracciones de
anticuerpo puro se
cuantificaron por BCA.
Electroforesis en poliacrilamida
(PAGE-SDS)
En cada pozo se
sembraron 20g de Como tampn de
proteina ms 5 l Se utilizaron geles corrido se utiliz
de tampn de al 12% y 8% tris 25mM-Glicina
muestra con 192mM ph 8,8
reductor (B-MESH)
Sobre membranas de
Se incubaron las
nitrocelulosa se
Se bloque agregando membranas con
colocaron 5 ml de
20 ml de PBS-SFB diluciones de las IgY en
lectina pura (0,608
(10%) durante una hora PBS-SFB (10%) durante
mg/ml) en PBS por
a temperatura una hora a temperatura
punto durante una hora
ambiente. ambiente y 12 horas a
a temperatura
4oC.
ambiente.