HISTOQUMICA DE LAS

PROTENAS
TIPOS DE ENLACES QUMICOS
FUERZA VIBRACIONAL O ENLACE VIBRATORIO (FLEMMING ET AL,
1989. UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA)

EXPERIMENTO EN UN ACELERADOR NUCLEAR

REACCIN ENTRE BROMO Y MUONIO UN ISTOPO DE HIDRGENO SE DESACELER
CUANDO AUMENTARON LA TEMPERATURA

MEZCLA ENTRE BROMO Y MUONIO FORMA UNA ESTRUCTURA INTERMEDIA UNIDA POR UN
ENLACE VIBRATORIO
PLANTEADO POSIBILIDAD TERICA A PRINCIPIOS DE ESA DCADA

MUONIO (TOMO LIGERO) SE MOVERA RPIDAMENTE ENTRE DOS PESADOS TOMOS DE

BROMO COMO UNA PELOTA DE PING-PONG REBOTANDO ENTRE DOS BOLAS DE BOLICHE

TOMO OSCILANTE SOSTENDRA BREVEMENTE LOS DOS TOMOS DE BROMO JUNTOS EN UN

ENLACE Y REDUCIRA LA ENERGA GLOBAL, Y POR LO TANTO LA VELOCIDAD DE LA
REACCIN.
FUERZA VIBRACIONAL O ENLACE VIBRATORIO (FLEMMING ET AL,
1989. UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA VANCOUVER)

MEJORAMIENTO EN EXPERIMENTOS DE SEGUIMIENTO DE CAMBIOS SUTILES EN LOS NIVELES

DE ENERGA DENTRO DE LAS REACCIONES

MUONIO Y BROMO EFECTIVAMENTE FORMARON UN NUEVO TIPO DE ENLACE TEMPORAL.

CLCULOS DE AMBOS EXPERIMENTOS Y TRABAJO COLABORATIVO DE QUMICOS TERICOS DE LA
UNIVERSIDAD LIBRE DE BERLN Y LA UNIVERSIDAD DE SAITAMA, EN JAPN

NATURALEZA VIBRATORIA BAJ LA ENERGA TOTAL DE LA ESTRUCTURA INTERMEDIA DE

BROMO-MUONIO
DISMINUY LA VELOCIDAD DE LA REACCIN A PESAR DE QUE LA TEMPERATURA SE ELEVABA

AUNQUE FUGACES, LOS ENLACES VIBRACIONALES SE CONSIDERAN ACTUALMENTE ENTRE

LOS ENLACES QUMICOS CONOCIDOS
ESTE FENMENO SE PRODUCIRA TAMBIN EN OTRAS REACCIONES ENTRE TOMOS PESADOS Y LIGEROS
MTODOS DE IDENTIFICACIN
DE PROTENAS
CARACTERIZACI MTODO FAST GREEN FCF
N DE PROTENAS ALCALINO
BSICAS MTODO ESCARLATA BIEBRICH
 SOLUCIN A:
FAST GREEN FCF (C.I. 42053) 0.1 g
AGUA DESTILADA 100
mL
AJUSTAR pH A 8.1 CON ALGUNAS
GOTAS DE NaOH 0.1N

SOLUCIN B NaOH 0.1 N:

NaOH (P.M. 40 g/mol) 0.4 g
AGUA DESTILADA 100 mL

SOLUCIN C:
CIDO TRICLOROACTICO 5 mL
AGUA DESTILADA 95
mL

FIJACIN: FORMOL NEUTRO 6 HRS

FAST GREEN FCF ALCALINO

(Alfert & Geschwind, 1953)
PROTOCOLO
DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
TRATAR EN SOLUCIN ACUOSA DE CIDO TRICLOROACTICO 5% HIRVIENDO
DURANTE 15 MINUTOS
LAVAR EN 3 BAOS DE ALCOHOL 70%, 10 MINUTOS C/U
LAVAR EN AGUA DESTILADA
COLOCAR EN SOLUCIN DE FAST GREEN FCF DURANTE 30 MINUTOS
LAVAR EN AGUA DESTILADA DURANTE 5 MINUTOS
DESHIDRATAR EN ALCOHOLES DE 95% Y ABSOLUTO
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS
PROTENAS BSICAS DEL NCLEO: VERDE
 SOLUCIN TAMPN GLICINA
Glicina
NaOH Agua Destilada
pH 1N
(mL) (mL)
(mL)
8 0.5 20 19.5
9.5 7 20 13
10.5 17 20 3

SOLUCIN BIEBRICH SCARLET

0.72 mM EN BUFFER GLICINA

FIJACIN: CARNOY 24 hrs O

CUALQUIER OTRO FIJADOR
ALCOHLICO SIN FORMALDEHDO

BIEBRICHS SCARLET (SPICER

& LILLIE, 1961 ; SPICER, 1962)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA

TEIR 30 A 90 MINUTOS EN SOLUCIN RECIN PREPARADA DE BIEBRICHS SCARLET (C.I. 26905)

AL 0.72 mM EN TAMPN GLICINA A pH 8.0; pH 9.5 Y pH 10.5

SIN LAVAR, TRATAR DIRECTAMENTE EN ALCOHOLES DE 95%, ABSOLUTO, ALCOHOL-XILOL

ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS
PROTENAS BSICAS DEL NCLEO: COLOR ESCARLATA INTENSO A pH 9.5

MENOR INTENSIDAD DE TINCIN A pH < 9.5

MENOR INTENSIDAD DE TINCIN A pH > 9.5

 ACIDOFILIA TOTAL
(DETERMINACIN MTODO DE AMARILLO NAFTOL
GRUPOS
ELECTROPOSITIVOS DE S
LAS PROTENAS)
 SOLUCIN CIDO ACTICO 1%
CIDO ACTICO GLACIAL 1 mL
AGUA DESTILADA 100 mL

SOLUCIN AMARILLO NAFTOL-S

AMARILLO NAFTOL-
0.1 g
S
CIDO ACTICO
1 mL
GLACIAL
AGUA DESTILADA 100 mL
pH SOLUCIN 2.8

FIJACIN: FORMOL NEUTRO 6 HRS O ETANOL-

ACTICO GLACIAL 3:1

AMARILLO NAFTOL S
(DIETCH, 1955)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
TEIR 30 MINUTOS CON AMARILLO NAFTOL-S
TRATAR LOS CORTES POR 5 MINUTOS EN SOLUCIN DE CIDO ACTICO GLACIAL
1%
DESHIDRATAR EN 3 CAMBIOS DE ALCOHOL BUTLICO TERCIARIO (TERBUTANOL)
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS:
PROTENAS CON GRUPOS ELECTROPOSITIVOS: AMARILLO
MEDICIN COLOR MEDIANTE HISTOFOTOMETRA
ABSORCIN MXIMA 435 nm
 DETERMINACIN DE TINCIN A pH REGULADO CON
PUNTO ISOELCTRICO AZUL DE METILENO Y FAST
APARENTE DE LAS
PROTENAS GREEN
 SOLUCIN TAMPN VERONAL ACETATO

SOLUCIONES TAMPONADAS DE COLORANTES

COLORANT
pH
E
AZUL DE
2.6 3.6 4.6 5.3 7.0 9.1
METILENO
FAST
2.6 3.6 4.6 5.3 7.0 9.1
GREEN FCF

FIJACIN: FIJADORES DE PROTENAS

TINCIN A pH REGULADO CON AZUL

DE METILENO (C.I.52015) Y
FAST GREEN FCF(C.I. 42053).
(DEMPSEY & SINGER, 1946)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
COLOCAR CORTES EN SOLUCIONES TAMPONADAS CON AZUL DE METILENO Y FAST GREEN
FCF DURANTE 48 HRS A TEMPERATURA AMBIENTE
LAVAR RPIDAMENTE EN AGUA DESTILADA
DESHIDRATAR EN ALCOHOL BUTLICO TERCIARIO (TERBUTANOL)
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS:
DIFERENTES TENDENCIAS EXTRACTIVAS Y DISTINTOS EFECTOS SOBRE AFINIDADES
TINTORIALES DE SOLUCIONES TAMPONES

UTILIZAR TAMPN VERONAL (BARBITAL) ACETATODE MICHAELIS (1931)

EL COLORANTE SE DISUELVE EN CADA SOLUCIN TAMPN PARA DAR UNA CONCENTRACIN 0.0005 M
 IDENTIFICACIN MTODO DE NINIHIDRINA-
DEL GRUPO AMINO SCHIFF
 SOLUCIN NINHIDRINA
NINHIDRINA 1g
ALCOHOL ABSOLUTO 100 mL

REACTIVO DE SCHIFF (Tomasi, 1936)

FUCSINA BSICA C.I. 42510 1 g
AGUA DESTILADA 200 mL
CIDO CLORHDRICO 1N 20 mL
METABISULFITO DE SODIO O POTASIO 1 g
CARBN VEGETAL ACTIVADO 0.1 g

AGUA SULFUROSA
AGUA DESTILADA 100 mL
CIDO CLORHDRICO 1N 5 mL
METABISULFITO DE SODIO O POTASIO 10% 5 mL

FIJACIN: ALFAC, ALCOHOL-ACTICO 3:1, BOUIN,

ZENKER, ETC

MTODO DE NINIHIDRINA-SCHIFF
(YASUMA & ETICHIKAWA, 1953)
PROCEDIMIENTO DE PREPARACIN
DISOLVER CUIDADOSAMENTE LA FUCSINA BSICA EN AGUA DESTILADA HIRVIENDO
ENFRIAR A 50 C
FILTRAR Y AGREGAR CIDO CLORHDRICO
ENFRIAR A 25 C Y AGREGAR METABISULFITO DE SODIO O POTASIO
DEJAR REPOSAR EN OSCURIDAD DURANTE 24 HRS
AGREGAR FINALMENTE CARBONO ACTIVADO
AGITAR Y FILTRAR

DESPUS DE FILTRAR EL REACTIVO DE SCHIFF, DEBE SER UNA SOLUCIN

INCOLORA.
CONSERVAR EN OSCURIDAD 4 C EN FRASCO MBAR BIEN CERRADO Y
COMPLETAMENTE LLENO
DURACIN: 1 MES
PROTOCOLO
DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
TRATAR LOS CORTES CON SOLUCIN DE NINHIDRIDA
POR 16-20 HRS A 37 C
LAVAR EN 4 CAMBIOS DE ALCOHOL ABSOLUTO Y EN
SEGUIDA AGUA DESTILADA
COLOCAR EN REACTIVO DE SCHIFF POR 30 MINUTOS
3 CAMBIOS DE AGUA SULFUROSA 5 MINUTOS CADA
UNO
LAVAR EN AGUA CORRIENTE 10 MINUTOS
PROTOCOLO
DESHIDRATAR EN ALCOHOL
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA
HACER CONTROL NEGATIVO:
COLOCAR PREPARADO EN AGUA DESTILADA A 37 C EN LUGAR
DE NINHIDRINA

RESULTADOS:
PROTENAS CON GRUPOS AMINO REACTIVOS: FUCSIA
 IDENTIFICACIN REACCIN DE MILLN
DEL GRUPO MTODO DE DIAZOTACIN-
FENOL (TIROSINA) COPULACIN PARA TIROSINA
 SOLUCIN 1
ACETATO DE MERCURIO 5g
CIDO TRICLOROACTICO 30% 100 mL

SOLUCIN 2
ACETATO DE MERCURIO 5 g
CIDO TRICLOROACTICO 30% 100 mL
NITRITO DE SODIO 1% 0.005 g

PREPARAR LAS SOLUCIONES AL MOMENTO DE

USAR

FIJACIN: FORMOL-ALCOHOL O FORMOL NEUTRO

MTODO DE MILLN
(RASCH Y SWIFT, 1960)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
TRATAR LOS CORTES CON LA SOLUCIN 1 DURANTE 10 MINUTOS A 40 C
TRASLADAR INMEDIATAMENTE LOS CORTES A LA SOLUCIN 2 DURANTE 1
HR A 30 C
3 CAMBIOS DE ALCOHOL 70, 10 MINUTOS CADA UNO
DESHIDRATAR
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN ACEITE DE INMERSIN

RESULTADOS:
PROTENAS CON TIROSINA: NARANJA
 SOLUCIN FIJADOR
AGUA DESTILADA 90 mL
CLORURO DE Hg 6 g
ACETATO DE SODIO (ANHIDRO) 1.25 g
FORMALDEHDO 40% 10 mL

AGREGAR FORMALDEHDO AL MOMENTO DE USAR EL FIJADOR

SOLUCIN CIDO ACTICO-NITRITO DE SODIO

CIDO ACTICO 2N 4 C 50 mL
NITRITO DE SODIO 2N 4 C 50 mL

MEZCLAR AL MOMENTO DE USAR

SOLUCIN CIDO S (1-amino-8 naftol-4-cido

sulfnico)
CIDO S 1g
SULFAMATO DE AMONIO 1g
ALCOHOL 70% 100 mL

FIJACIN: CUALQUIER FIJADOR, AUNQUE ES PREFERIBLE

ACETATO DE SODIO-CLORURO DE MERCURIO-FORMALINA

DIAZOTIZACIN-COPULACIN PARA
TIROSINA (GLENNER
& LILLIE, 1959)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
PONER CORTES EN COPLIN ENVUELTO EN PAPEL NEGRO
PARA MANTENER PREPARADOS EN COMPLETA
OSCURIDAD EN LOS PASOS SIGUIENTES
TRATAR LOS CORTES CON SOLUCIN DE CIDO ACTICO
Y NITRITO DE SODIO POR 18 HRS A 4 C
LAVAR 4 VECES EN AGUA DESTILADA A 4 C
COLOCAR CORTES EN CIDO S POR 1 HR A 4 C
 LAVAR 3 VECES EN HCl 0.1 N 5 MINUTOS CADA VEZ
LAVAR EN AGUA CORRIENTE 10 MINUTOS
DESHIDRATAR EN ALCOHOL
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS:
PROTENAS CON TIROSINA: VIOLETA INTENSO
 IDENTIFICACIN MTODO DMAB NITRITO
DEL GRUPO INDOL
REACCIN DE ROSINDOL
(TRIPTOFANO)
 SOLUCIN DMAB
DMAB (P-DIMETIL-AMINOBENZALDEHDO) 5G
HCL CONCENTRADO 100 ML

SOLUCIN NITRITO DE SODIO CIDO

NITRITO DE SODIO 1G
TRIPTFA HCL CONCENTRADO 100 ML
NO

SOLUCIN ALCOHOL CLORHDRICO

ALCOHOL 70% 99 ML
HCL CONCENTRADO 1 ML

FIJACIN: FORMALINA 10% POR 6 HRS

PRODUCTO CIDO TRICLOROACTICO 1% EN ETANOL 80%, 24
FORMADO HRS
CIDO SULFOSALICLICO 10%, 24 HRS
p- GROSOR DE CORTES : 15 M
DIMETILAMINOBENZALDEH
DO

MTODO DMAB NITRITO

(ADAMS, 1957)
 SOLUCIN DMAB
TRIPTFA DMAB (p-DIMETIL-AMINOBENZALDEHDO) 5g
HCl CONCENTRADO 100 mL
NO
SOLUCIN NITRITO DE SODIO CIDO
NITRITO DE SODIO 1g
HCl CONCENTRADO 100 mL

SOLUCIN ALCOHOL CLORHDRICO

ALCOHOL 70% 99 mL
HCl CONCENTRADO 1 mL
PRODUCTO
FORMADO
FIJACIN: FORMALINA 10% POR 6 HRS
p-
DIMETILAMINOBENZALDEH
DO

MTODO DMAB NITRITO

(ADAMS, 1957). ALTERNATIVA
 MTODO HISTOQUMICO DMAB-NITRITO SIMPLE Y MUY
SELECTIVO, CASI ESPECFICO, PARA EL AMINOCIDO TRIPTFANO
PRODUCTO AZUL OBTENIDO CON ESTA TCNICA ES
INVARIABLEMENTE ACEPTADO COMO PRUEBA DE QUE EL
MATERIAL TEIDO DE AZUL CONTIENE TRIPTFANO.

DMAB: p-DIMETILAMINOBENZALDEHDO
4-DIMETILAMINOBENZALDEHDO
4-FORMIL-N,N-DIMETILANILINA
N,N-DIMETIL-4-FORMILANILINA.
 FUNDAMENTOS
FRMULA ESTRUCTURAL
MS A LA IZQUIERDA TRIPTFANO
CENTRAL DMAB
DERECHA PRODUCTO DE REACCIN INICIAL
PRODUCIDO POR ELLOS

PRODUCTO DE REACCIN SE OXIDA LUEGO CON

NITRITO DE POTASIO
FORMA UN COMPUESTO DE COLOR AZUL,
FCILMENTE VISIBLE, DE ESTRUCTURA NO
ESPECIFICADA.

FORMALDEHDO Y GLICERALDEHDO TAMBIN

PUEDEN PARTICIPAR EN REACCIONES SIMILARES
FIJACIN CON FORMALINA DEBE SER BREVE

FIJACIN COMN DURANTE LA NOCHE EN

VARIANTES DE FORMALINA AL 10% TODAVA
PERMITE QUE LA TCNICA D UN RESULTADO
POSITIVO.
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA ALCOHOL ABSOLUTO
DEJAR SECAR AL AIRE (LA PREPARACIN NO SE DEBE RESECAR)
COLOCAR LOS CORTES EN SOLUCIN DMAB DURANTE 1 MINUTO
LLEVAR EN SEGUIDA A UNA SOLUCIN DE NITRITO DE SODIO CIDO DURANTE 1
MINUTO
LAVAR EN AGUA DESTILADA 30 SEGUNDOS
LAVAR EN ALCOHOL CLORHDRICO
DESHIDRATAR EN 3 CAMBIOS DE ALCOHOL ABSOLUTO
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS:
PROTENAS CON TRIPTOFANO: AZUL
 RESULTADOS POSITIVOS EN FIBRINA Y FIBRINOIDE, AMILOIDE, GRNULOS
DE CLULAS DE PANETH, GRNULOS DE CLULAS PPTICAS, GRNULOS DE
ZIMGENO, MSCULO, NEUROQUERATINA Y VAINA DE RAZ DEL CABELLO.

FIBRINA, FIBRINOIDE, Y AMILOIDE SON MATERIALES EXTRACELULARES QUE

PODRAN SER CONFUNDIDOS.

CONFIRMACIN DE MATERIAL AMILOIDE:

DIFERENCIACIN MATERIAL POSITIVO RESPECTO DE FIBRINA CON OTROS MTODOS:
ROJO CONGO
ALTO GRADO DE CERTIDUMBRE
FIBRINA NO SE TIE CON ROJO CONGO
 SOLUCIN CONDENSANTE
p-DIMETILAMINOBENZALDEHDO 1g
CIDO ACTICO GLACIAL 30 mL
CIDO CLORHDRICO 10 mL

SOLUCIN OXIDANTE
CIDO ACTICO GLACIAL 40 mL
CIDO CLORHDRICO 1N 0.3 mL
NITRITO DE SODIO 1% 0.7 mL

SOLUCIN CIDO PCRICO A SATURACIN

CIDO PCRICO 1.1 g
AGUA DESTILADA 100 mL

FIJACIN: FORMOL NEUTRO 6 HRS O ETANOL-ACTICO GLACIAL

3:1

REACCIN DEL ROSINDOL

(GLENNER, 1957, MODIFICADO)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
COLOCAR EN SOLUCIN DE CIDO PCRICO SATURADA ACUOSA POR 2 A
24 HRS
LLEVAR CORTES A BATERA DE ALCOHOLES ASCENDENTES HASTA
ALCOHOL 100%
REALIZAR 3 CAMBIOS EN ETANOL ABSOLUTO
LAVAR EN CIDO ACTICO GLACIAL CONCENTRADO POR 30 SEGUNDOS
COLOCAR EN SOLUCIN CONDENSANTE POR 20 MINUTOS A
TEMPERATURA AMBIENTE
3 LAVADOS EN CIDO ACTICO GLACIAL CONCENTRADO 30 SEGUNDOS, 1
MINUTO Y 1 MINUTO RESPECTIVAMENTE
COLOCAR EN SOLUCIN OXIDANTE 5 MINUTOS
 3 LAVADOS EN CIDO ACTICO GLACIAL CONCENTRADO
1 MINUTO CADA UNO
ACLARAR EN VARIAS MEZCLAS DE CIDO ACTICO-XILOL
DE PROPORCIONES: 4:1 ; 1:1 ; 1:4
ACLARAR EN XILOL REALIZANDO 2 CAMBIOS
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS:
PROTENAS CON TRIPTOFANO: AZUL
 MTODO DDD
MTODO DE AMARILLO
MERCURIAL
IDENTIFICACIN MTODO DE SAL DE
TETRAZOLIO
DEL GRUPO SH BLOQUEO DE GRUPOS SH CON
N-ETIL-MALEIMIDA
IDENTIFICACIN DE GRUPO SH Y
S-S (CISTENA Y CISTINA)
 SOLUCIN DDD
DDD (2,2 DIHIDROXI-6,6 DINAFTIL-DISULFIDO 25 mg
BUFFER VERONAL (BARBITAL)-ACETATO (MICHAELIS, 1931)
0.1 M pH 8.5
35 mL
ALCOHOL ABSOLUTO 15
mL

SOLUCIN CIDO ACTICO 0.01% (pH 4.0-4.5)

CIDO ACTICO GLACIAL 0.01 mL
AGUA DESTILADA 100 mL

SOLUCIN DIAZO BLUE B

DIAZO BLUE B (C.I. 37235) 50 mg
TAMPN FOSFATO 0.1 M pH 7.6 50 Ml
ENFRIAR A 4C TAMPN FOSFATO ANTES DE USAR

FIJACIN: ALFAC, CIDO TRICLOROACTICO 1% EN

ALCOHOL 80%

MTODO DDD
(BARNETT & SELIGMAN, 1952)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
INCUBAR 1HR 50 C EN SOLUCIN DDD
DEJAR ENFRIAR DURANTE 10 MINUTOS A TEMPERATURA
AMBIENTE
LAVAR BREVEMENTE EN AGUA DESTILADA
LAVAR POR 10 MINUTOS EN 2 CAMBIOS DE CIDO
ACTICO GLACIAL 0.01% (pH 4.0-4.5)
DESHIDRATAR EN ALCOHOL ES ASCENDENTES HASTA
ALCOHOL 100%
 REALIZAR 2 LAVADOS EN TER DE 5 MINUTOS CADA UNO
REHIDRATAR LOS CORTES PASANDO POR ALCOHOLES DECRECIENTES
LAVAR EN AGUA DESTILADA
COLOCAR LOS CORTES 2 MINUTOS EN SOLUCIN RECIN PREPARADA DE DIAZO BLUE
B
LAVAR EN AGUA DESTILADA
DESHIDRATAR EN ALCOHOL 100%
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS:
PROTENAS CON ALTA CONCENTRACIN DE GRUPOS SH: AZUL
PROTENAS CON BAJA CONCENTRACIN DE GRUPOS SH: ROJO
 SOLUCIN AMARILLO MERCURIAL
AMARILLO MERCURIAL EN DIMETIL FORMAMIDA A
SATURACIN

SOLUCIN DIMETIL FORMAMIDA

FIJACIN: FORMOL NEUTRO 6 HRS O ETANOL-

ACTICO GLACIAL 3:1

MTODO DE AMARILLO MERCURIAL

(BENNET, 1942 ; MODIFICADO POR
GLENNER, 1965)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA ALCOHOL ABSOLUTO
COLOCAR EN SOLUCIN DE AMARILLO MERCURIAL POR 18 HRS
LAVAR EN DIMETIL FORMAMIDA 2 VECES Y LUEGO 2 VECES EN
ALCOHOL
ACLARAR EN XILOL
MONTAR EN RESINA SINTTICA

RESULTADOS:
ESTRUCTURAS CON GRUPOS SH: COLOR NARANJA DE
DISTINTAS INTENSIDADES
 SOLUCIN NITRO BLUE TETRAZOLIUM

CIANURO DE
10 mL
POTASIO 5%
CIDO ACTICO
4 mL
GLACIAL 0.2 N
TAMPN BORATO
10 mL
0.2 M pH 8.4
TETRAZ NITRO BLUE
15 mL
TETRAZOLIUM
OL
AJUSTAR CIANURO A pH 8.4 CON CIDO ACTICO GLACIAL.
AGREGAR POSTERIORMENTE LOS DEMS REACTIVOS

FORMAZ
AN

METODO DE SAL DE TETRAZOLIO

(DEGUCHI, 1964)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
COLOCAR EN SOLUCIN DE NITRO BLUE TETRAZOLIUM (NBT)
EN UN COPLIN TAPADO, A 37 C, DURANTE 30-60 MINUTOS
LAVAR EN SOLUCIN DE CIDO ACTICO GLACIAL 1%
LAVAR EN AGUA DESTILADA
MONTAR EN GELATINA GLICERINADA

RESULTADOS:
ESTRUCTURAS CON GRUPOS SH: DESDE AZUL OSCURO A ROJO
 SOLUCIN N-ETIL MALEIMIDA
N-ETIL MALEIMIDA 0.1 M EN TAMPN FOSFATO SRENSEN
0.1 pH 7.4
N-ETIL MALEIMIDA: P.M. 125.3 g

BLOQUEO GRUPOS SH CON

N-ETIL MALEIMIDA
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA AGUA DESTILADA
INCUBAR 4 HRS A 37 C EN SOLUCIN DE N-ETIL
MALEIMIDA
REALIZAR MTODO HISTOQUMICO PARA DEMOSTRAR
GRUPOS SH
 SOLUCIN TIOGLICOLATO DE SODIO
CIDO TIOGLICLICO 0.2 M
HIDRXIDO DE SODIO 0.1 N

CIDO TIOGLICLICO 0.2 M

HIDRXIDO DE SODIO 0.1 N

TITULAR HASTA QUE ALCANCE pH 8.0

SOLUCIN CIDO ACTICO 1%

CIDO ACTICO GLACIAL 1 mL
AGUA DESTILADA 100 mL

IDENTIFICACIN DE GRUPO SH
Y S-S (CISTENA Y CISTINA)
 DESPARAFINAR E HIDRATAR HASTA ALCOHOL ABSOLUTO
COLOCAR CORTES EN SOLUCIN RECIN PREPARADA DE
TIOGLICOLATO DE SODIO DURANTE 1 O 2 HORAS A 50-60 C
LAVAR REPETIDAMENTE CON AGUA DESTILADA DURANTE 5-
10 MINUTOS (EVITAR USO DE AGUA CORRIENTE,
ESPECIALMENTE SI CONTIENE CLORO)
LAVAR EN CIDO ACTICO GLACIAL 1% Y EN AGUA
DESTILADA
CONTINUAR CON REACCIN DE DETERMINACIN DE
GRUPOS SH
IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE
PROTENAS
AZUL DE COOMASIE
 ESTUDIOS DEMOSTRATIVOS DE LA PRESENCIA DE PROTENAS EN
INCLUSIONES INTRACELULARES O MATERIAL EXTRACELULAR

EXISTEN TINCIONES PARA PROTENAS QUE NO DEPENDEN DE AMINOCIDOS

INDIVIDUALES PRESENTES EN STAS

TINCIN CON COLORANTES ANINICOS (MOLCULAS PEQUEAS) MEDIANTE

CARGAS ELECTROSTTICAS A CADENAS LATERALES DE LISINA Y ARGININA
COLORANTES ANINICOS DE CADENA GRANDE (ESPECIALMENTE LOS UTILIZADOS EN
LA INDUSTRIA TEXTIL DEL ALGODN) SE UNEN POR FUERZAS NO INICAS
UTILIDAD COLORANTES ANINICOS: IDENTIFICACIN DE PROTENAS SLO SI
LA INTENSIDAD DEL COLOR PRODUCIDO EN ALGN SITIO DEL TEJIDO ES
PROPORCIONAL A CONCENTRACIN LOCAL DE PROTENAS DEL SITIO.
AZUL DE COOMASIE
AZUL DE COOMASIE
AZUL DE COOMASIE R250 (AZUL BRILLANTE R,
INDOCIANINA BRILLANTE 6B): COLORANTE
TRIFENILMETNICO, DE UNIN ESTEQUIMTRICA A
PROTENAS BAJO CONDICIONES HISTOQUMICAS

UTILIDAD: UNIN A PROTENAS EN GELES DE ACRILAMIDA

(ELECTROFORESIS, WESTERN BLOT)

COLORANTE CASI INSOLUBLE EN AGUA FRA

 TINCIN DE CORTES EN MEZCLA DE ETANOL Y CIDO ACTICO,
ENJUAGADO EN MEZCLA ETANOL-ACTICA PARA REMOVER
COLORANTE NO UNIDO

FRMULA ESTRUCTURAL PRESENTA ZWITTERION GRANDE NO

PLANAR CON COMPONENTES HIDROFLICOS E HIDROFBICOS
PODRA UNIRSE A CUALQUIER TIPO DE MOLCULA

TINCIN DE CORTES INCLUIDOS EN RESINAS PLSTICAS SE EVITA

MEDIANTE TRATAMIENTO CON ENZIMAS PROTEOLTICAS (CAWOOD ET
AL, 1978)
TCNICA DE AZUL DE COOMASIE
R250 PROCEDIMIENTO
SOLUCIN A
ETANOL-ACTICO
CIDO ACTICO GLACIAL 100 mL
ETANOL ABSOLUTO 300 mL

PUEDE MANTENERSE POR MESES, SE UTILIZA PARA

DISOLVER Y REMOVER COLORANTE NO UNIDO DE
CORTES TEIDOS
 SOLUCIN B
AZUL DE COOMASIE R250 (C.I.42660) 40 mg
ETANOL-ACTICO (SOLUCIN A) 200 mL

EL COLORANTE SE DISUELVE COMPLETAMENTE

NO ES NECESARIO FILTRAR
LA SOLUCIN ES ESTABLE POR AL MENOS 5 AOS
PROCEDIMIENTO
DESPARAFINAR Y REHIDRATAR CORTES EN PARAFINA HASTA ALCOHOL ABSOLUTO

TEIR EN SOLUCIN COLORANT (B) POR 30 MINUTOS

SECAR LAS PLACAS Y SUMERGIR EN SOLUCIN ETANOL-ACTICO (A) POR 5 MINUTOS

AGITANDO OCASIONALMENTE

ENJUAGAR EN ETANOL 95%, DESHIDRATAR EN ETANOL ABSOLUTO, ACLARAR EN XILOL

Y MONTAR CON MEDIO RESINOSO

RESULTADOS:
PROTENAS: AZUL REAL BRILLANTE
INTENSIDAD DE COLOR PROPORCIONAL A CONCENTRACIN LOCAL DE PROTENA
 FUNDAMENTOS EXPLICACIN
TERICOS DE LOS FRMULAS DE REACCIN
MTODOS DE TEORAS MS ACEPTADAS
IDENTIFICACIN DE
PROTENAS
REACCIN DE COPULACIN TETRAZONIUM
Y MTODOS RELACIONADOS
 SOLUCIONES ALCALINAS DE SALES DE DIAZONIO SE COMBINAN CON
PROTENAS EN AL MENOS 3 FORMAS DIFERENTES

ACOPLAMIENTO ESPERADO CON CADENAS LATERALES FENLICAS DE

TIROSINA

REACCIN SIMILAR DE ACOMPLAMIENTO CON ANILLO IMIDAZOL DE

HISTIDINA (HETEROCCLICO AROMTICO)
TOMOS DE NITRGENO CONFIERE ALGUNAS DE LAS PROPIEDADES DE AMINA
AROMTICA AL ANILLO

ACOPLAMIENTO PROBABLEMENTE EN POSICIN ORTO AL NITRGENO DEL

ANILLO INDOL DEL TRIPTOFANO
 TRIAZENO: PRODUCTO DE REACCIN GRUPO -AMINO DE LISINA
SIMILARMENTE SE OBSERVA EN NITRGENOS DE AMINAS SECUNDARIAS DE PROLINA E
HIDROXIPROLINA Y CON GUANIDINO Y SULFHIDRILO DE ARGININA Y CISTENA

TOMOS DE NITRGENO DE PRINAS Y PIRIMIDINAS DE CIDOS NUCLEICOS NO SE

ACOPLAN CON SALES DE DIAZONIO (LILLIE & FULLMER, 1976)

SALES DE DIAZONIO APLICADAS A CORTES DE TEJIDO SE UNIRN COVALENTEMENTE A

MUCHOS GRUPOS FUNCIONALES ORGNICOS, PRINCIPALMENTE EN PROTENAS

EXCEPCIN: ALGUNOS FENOLES, CATECOLAMINAS DE CLULAS CROMAFINES Y

SEROTONINA EN CLULAS ARGENTAFINES
AUSENTES DE CASI TODOS LOS TEJIDOS, DETECTABLES MEDIANTE OTROS MTODOS
COMPUESTOS FENLICOS VEGETALES (TANINOS) PUEDEN ACOPLARSE A SALES DE DIAZONIO
 REACCIN ORIGINAL DE TETRAZONIO (DANIELLI, 1947): SE UTILIZ
BENZIDINA TETRAAZOTIZADA (SAL DE TETRAZONIO)
PREPARAR EN FRESCO EN LABORATORIO A PARTIR DE BENZIDINA Y CIDO
NITROSO

SAL DE FAST BLUE B: ALTERNATIVA MS CONVENIENTE

DERIVADO DE O-DIANISIDINA
CADA COMPUESTO FORMA 2 GRUPOS DIAZONIO POR MOLCULA
UNO DE ELLOS SE ACOPLA CON UN SITIO REACTIVO EN EL CORTE DE TEJIDO
ES INFRECUENTE QUE SE UNAN 2 EN TEJIDOS FIJADOS

DISTANCIA ADECUADA PERMITE REACCIN CON LA MISMA MOLCULA DE REACTIVO

 COMPUESTOS AZO: FORMADOS POR ACOPLAMIENTO DE SALES SIMPLES DE DIAZONIO CON
PROTENAS

GRUPOS AZO LIBRES DE ENLACES TETRAZONIO PUEDEN UNIRSE A GRUPOS FENOL O AMINAS
AROMTICAS
COLOR INTENSO DEBIDO A PRESENCIA DE 2 ENLACES AZO
CIDO H: ACOPLAMIENTO AZOICO

ALTERNATIVA: SALES DE DIAZONIO (CON UN GRUPO AZO QUE ES A LA VEZ COLORANTE AZO)
ACOPLAMIENTO PROTEICO FORMA COLORANTES DISAZO EN REACCIONES DE UN SOLO PASO
EJEMPLO: SAL DE FAST BLACK K
SAFRANINA DIAZOTIZADA FRESCA (LILLIE ET AL, 1968)
ESPECIFICIDAD DE REACCIN DE ACOPLAMIENTO DE TETRAZONIO A AMINOCIDOS AROMTICOS:
TRATAMIENTO CON HCl DILUDO DESPUS DEL PRIMER ACOPLAMIENTO
DESTRUCCIN TRIAZENOS
EFICACIA EN DUDA
PROCEDIMIENTOS DE
BLOQUEO Y DESBLOQUEO
 REACCIONES DE BLOQUEO Y DESBLOQUEO
PRODUCTO DE REACCIN DE
GRUPO FUNCIONAL REACCIN DE BLOQUEO
BLOQUEO DESBLOQUEO

ACETILACIN (3HRS) ACETIL ESTER SAPONIFICACIN

HIDROXI (-OH) BENZOILACIN BENZOIL ESTER SAPONIFICACIN
SULFACIN HEMISULFATO ESTER METILACIN (2HRS)

CARBOXILO (-COOH) METILACIN (2HRS) METIL ESTER SAPONIFICACIN

OBSTRUCCIN DE
FOSFATOS POR
FOSFATO (-PO4) METILACIN (24 HRS) SAPONIFICACIN
CERCANA DE
AMINAS METILADAS

SULFATO O
HIDROXILO IRREVERSIBLE
CARBOHIDRATO METILACIN (24 HRS)

ACETILACIN (48 HRS) ACETIL AMIDA SAPONIFICACIN

BENZOILACIN BENZOIL AMIDA SAPONIFICACIN
AMINO (-NH3)
SULFACIN SULFOAMINO METILACIN (2HRS)
DEAMINACIN HIDROXI ETC IRREVERSIBLE
ACETILACIN Y BENZILACIN
ACETILACIN MODERADA BLOQUEA GRUPOS HIDROXILO
ACETILACIN COMPLETA BLOQUEA GRUPOS HIDROXI Y
AMINO

BENZOILACIN TIENE EFECTO SIMILAR A ACETILACIN

COMPLETA

PROCESOS REVERSIBLES MEDIANTE SAPONIFICACIN

SULFACIN ACETILACIN
BLOQUEO GRUPOS AMINO E HIDROXI

EFECTO REVERSIBLE MEDIANTE TRATAMIENTO POR 3 HRS A 60 C CON

REACTIVOS UTILIZADOS EN METILACIN

HAY ALGN GRADO DE ACETILACIN

REACCIN DE ARGININA NO SE VE AFECTADA

N-SULFACIN DE GRUPOS GUANIDINO (EVITA UNIN DE COLORANTES

ANINICOS E INDUCE BASOFILIA)
REVERSIBLE POR HIDRLISIS EN REACTIVOS FUERTEMENTE ALCALINOS UTILIZADOS EN
MTODOS ESPECFICOS PARA ARGININA
METILACIN DESULFACIN
CAMBIOS DEPENDEN DE DURACIN DE LA REACCIN

2 HRS: ESTERIFICACIN GRUPOS CARBOXILO

INTRODUCCIN EXPERIMENTAL DE SULFATOS: LIBERACIN Y
REESTABLECIMIENTO DE GRUPOS NH2 y OH ORIGINALES
HIDRLISIS PARCIAL DE ESTERES SULFATO DE LOS
CARBOHIDRATOS
BLOQUEO PARCIAL DE ESTERES FOSFATO DE NUCLETIDOS
 24 HRS: ESTERIFICACIN GRUPOS CARBOXILO Y BLOQUEO DE FOSFATOS
HIDRLISIS DE SULFATOS ESTERIFICADOS
AMINAS PRIMARIAS CONVERTIDAS EN AMINAS TERCIARIAS
AUMENTO ACIDOFILIA
EVITA REACCIONES QUMICAS PROPIAS DE GRUPO NH 2

METILACIN ES REVERSIBLE POR SAPONIFICACIN

EXCEPCIN: REMOCIN GRUPOS SULFATO
METILACIN BLOQUEA BASOFILIA DE CIDOS NUCLEICOS POR
DIFERENTES MECANISMOS
SAPONIFICACIN
REVIERTE EFECTOS DE ACETILACIN O METILACIN
REACTIVOS ALCALINOS
PUEDEN REMOVER CORTES DE LOS PREPARADOS
CUBRIR CON FILM DE NITROCELULOSA PARA EVITAR
PRDIDA DE CORTES
DEAMINACION CON GRUPO
NITROSO
REMOCIN GRUPOS AMINO PRIMARIOS
GRUPO GUANIDINO DE LA ARGININA POCO AFECTADO
DEAMINACIN SUCEDE EN LAS PRIMERAS 4 HRS
OCASIONALMENTE SE REQUIERE TIEMPO HASTA 48 HRS
BLOQUEO DE ARGININA
EVITA REACCIONES DE ARGININA
DISMINUYE ACIDOFILIA
BLOQUEO PARCIAL DE GRUPOS AMINO
BLOQUEO DE SULFHIDRILO
REDUCCIN DE CISTINA A CISTENA
CONVERSIN DE S-S- A SH
TIOGLICOLATO DE SODIO
DITIOTREITOL
COSTOSO
MENOS MALOLIENTE
UTILIZABLE EN SOLUCIONES MENOS ALCALINAS
PREPARAR SOLUCIN ANTES DE USAR
SE UTILIZA UNA SOLA VEZ RECIPIENTES CERRADOS (MINIMIZA OXIDACIN
ATMOSFRICA) Y SE DESCARTA

DISULFUROS SE REDUCEN A TIOLES

HISTOQUMICA POSITIVA
BLOQUEO DE ALDEHDOS Y
CETONAS