Enzimas en el

anlisis de
alimentos.
 Naturaleza de las
proteinas y enzimas.
Estructur
a
Primaria.

Azul: Interacciones hidrofbicas; Rojo: Interacciones electrostticas;

Gris: enlace hidrgeno; Verde; enlace
Fuente: disulfuro
Paul R. Mathewson, Enzymes Handbo
 Estructuras Proteicas
Secundarias.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Estructuras terciarias y
cuaternarias

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Representacin
de una
reaccin
enzimtico.

Fuente: Paul R.
Mathewson, Enzymes
Handbook
 Reaccin
enzimtica en la
que se observan
las etapas
catalticas y de
unin al
substrato.

Fuente: Paul R.
Mathewson, Enzymes
Handbook
Factores que afectan las
velocidad de las reacciones
enzimticas.
Temperatura
pH
Desnaturalizacin.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Efecto del pH y la
Temperatura

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Desnaturalizacin de estructura
nativa.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Efecto de la concentracin

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Mtodos para medir
actividad enzimtica
Pueden estar basados en:

Espectrofotometra. Cambios en absorbancia.

Reologa. Cambios en viscosidad
Potenciometra. Cambios en pH.

Fuente: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Peroxidasas
Burnette, 2007 revisa la reaccin de la
peroxidasa como sigue:
AH2: Donador de hidrogeno.
ROOH + AH2 H2O + ROH + A
H2 O2 + peroxidasa H 20 + 0

Pertence al grupo de enzimas llamadas

oxidoreductasas.
Contribuye al color y sabor desagradabale
en vegetales no blaqueados como las
raices y tubrculos.
Sobre peroxidasa
Se encuentra tambin en Leche.
En vegetales cataliza de manera no
especfica la oxidacin de un nmero
grande de compuestos fenlicos y anillos
aromticos encontrados en productos
vegetales.
Tambin reacciona con algunos acidos
grasos pero solo de determinado tamao
de cadena. (13 14)
Se ha sugerido rol en detoxificacin del
vegetal.
Indicadores para visualizar
la reaccion de la peroxidasa
Monitoreo actividad de
peroxidasa.
Monitoreo actividad de
peroxidasa.
Tetraguaiacol tiene una absorbancia mxima alrededor de
450 nm.
Para monitorear la actividad de la peroxidase se pueden
medir los incrementos en absorbancia a 450nm. A mayor
absorbancia mayor actividad de la enzima.

Posibilidad de uso de un
Microplate reader en el
monitoreo
De la absorbancia.
Tpica placa de micropozos.
Tcnica Elisa: Lectura

Lector de absorbancia
para placas de
micropozos.
Mtodo fluoromtricos
para peroxidasa.
Reference: Iwai, H. F., Ishihara, F., and Akihama, S. 1983.
Chemical Pharmacology Bulletin 31:3579

Descricion: molecula
reactante o-dianisidine y
homovanillic acid forma
una molecula con bastante
fluorescencia despus de la
oxidacin con la enzima .
La reaccin se sigue a 425
nm.

Citado por: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

 Mtodo enzimtico para
Glucosa
Un mtodo enzimtico usa la enzima
Glucosa oxidasa, la cual cataliza la
oxidacin de la Glucosa hasta perxido de
hidrgeno, el cual reacciona con un tinte
en presencia de una segunda enzima la
peroxidasa, generando un producto
coloreado estable. La absorbancia del
color es medida a 540 nm.
Glucosa oxidasa
Reaccin con glucosa oxidasa

Tinte: o- diansidina

(Nielsen, 2010)
Sobre enzimas utilizadas
para glucosa
Glucosa oxidasa reduce la cantidad de
glucosa produciendo perxido y
gluconato.
El perxido se puede eliminar
posteriormente con la adicin de enzima
catalasa quien lo transforma en agua.
Forma de prevencin pardeamiento de
tipo no enzimtico, ejemplo en claras de
huevo destinadas a deshidratacin.
 Mtodos enzimticos Kits
Existen Kits con todos los reactivos
estandarizados para la reaccin
enzimtica los que se obtienen de
compaas tales como las de:
R-Biopharm.
Megazyme
Sigma-Aldrich
Los protocolos para los mtodos enzimticos
se deben seguir de forma estricta.
Mtodos enzimticos
permiten analisis de otros
azcares
La bibliografa publica un nmero variado
de mtodos enzimticos para en anlisis
de azcares diferentes a la glucosa, tales
como galactosa, glucitol, manitol, xylitol.
Tambin con mtodos enzimticos se
puede analizar: celulosa
galactomananas, almidn y pectina. No
se recomienda para almidn resistente y
de alto contenido de amilosa.
 Muestra Liofilizada, duplicada (1 g) + 50 ml Buffer fosfato + 0.1 ml -amilasa
(ph=6.00.1)
Incubar a 95 C x 15 min

Ajustar ph =7.50.1 con 10 ml NaOH (0.275 N) + 0.1 ml de Proteasa

Incubar a 60 C x 30 min
Ajustar ph =4.50.1 con 10 ml HCl (0.325 N) + 0.1 ml de
Amiloglucosidasa

Incubar a 60 C x 30 min
Centrifugacin

METODO 3000 x 15 min

OFICIAL Filtracin
0.5 g. Celite seco a 130 C x 1h.
Sobrenadante
(Adicionar agua hasta 100 g)
Humedecer para filtrar con agua Aadir 400 ml etanol 95% a 60 C
A.O.A.C. 1-6 h

991.42 y Lavado
(10 + 10 ml agua)
Precipitacin

993.19: FIBRA 1h

DIETARIA Secado
(70 C toda la noche
Filtracin
0.5 g. Celite seco a 130 C/1h
Humedecer para filtrar con EtOH 78%
Sobrenadante
(descartar)

METODO 105 C x 5 h)

ENZIMATICO Pesado Lavado

(Etanol 78% 20 ml 3 v., Etanol 95%
10 ml 2v. Acetona 10 ml 2v.)
2 Residuos
GRAVIMETCO Secado y Pesado
(P) Proteinas (Kieldahl) (C) Cenizas

2 residuos
Residuo-P-C-Blanco =
Fibra

Insoluble
(P) Proteina (Kieldahl) (C) Ceniza

Residuo-P-C-Blanco = Fibra Soluble

FIBRA DIETARIA TOTAL = Fibra Insoluble + Fibra Soluble

Determinacin del
grado de
gelatinizacin.
Lipoxigenasas
Enzima muy importante en
monitorear el escaldado de
vegetales, algunos autores la
prefieren a la peroxidasa.

(Mathewson,
1998) Metallo enzima, contiene Fe
Sobre lipoxigenasa
Metaloenzima que contiene hierro, acta
sobre cidos grasos que contienen
estructura cis, cis penta 1, 4 dieno. Ej
acidos linoleico, linolenico, araquidonico.
Dos tipos de lipoxigenasa, las que oxidan
en cidos grasos libres tipo I y las que
oxidan en cidos grasos que estn dentro
de estructuras de triglicridos: tipo II.
Lipoxigenasa tipo II tambin oxida
carotenoides y clorofila resultando en la
prdida de color de estos pigmentos. En
harina de trigo tienen un efecto
blanqueador.
 Mtodos para medir actividad de
lipoxigenasa en extractos de plantas.

Uno de ellos es:

Monitorear la perdida del sustrato (acido

graso)
Monitorear toma de oxgeno. (mtodo
manometrico, electroquimico o de titulacin)
Monitorear la aparicin del dieno conjugado a
234 nm.
Lipoxigenasa mas
mtodos.
Reference: Toyosaki, T. 1992. Journal of
the AOAC International 75(6):1124
Method: Citado por Citado por: Paul R.
Mathewson, Enzymes Handbook
Metodo espectrofotometrico: La actividad
de la Enzyma es medida como el tiempo
que necesit decolorar el azul de
metileno. La reaccin es seguida por la
determinacion de la diminucion de la
abasorbancia a 660 nm.
Polifenoloxidasas

Citado por: Paul R.

Mathewson, Enzymes
Handbook
Sobre Polifenoloxidasa
Son un grupo de enzimas que se
encuentran de manera natural en la
mayora de las plantas. (EC 1.10.3.1,
1.10.3.2 y 1.14.18.1)
Dentro de los tejido estan alejadas del
oxgeno, cuando se produce un corte, ellas
inducen la oxidacin de compuestos
fenlicos tales como el catecol, fenoles
substituidos y aminocidos tirosina.
Producen melanina, un pigmento que puede
reaccionar con proteinas.
Polifenol oxidasa mtodo
Reference: Bernier, A. M., and Howes, N.
K. 1994. Journal of Cereal Science
19(2):157 Method: Spectrophotometric
(colorimetric). Description: Wheat kernels
are incubated in tyrosine solution. The
absorbance of colored pigments formed
is measured in microtitre plate.

Citado por: Paul R. Mathewson, Enzymes Handbook

Almidon
Principales etapas en la conversin enzimtica del almidn.

S u sp e n c i n A lm id o n o sa
-amilasa maltodextrina
L iq u e fa c c i n .
Glucoamilasa/
Pullulanasa S a c a rific a c i n

Jarabe de maltosa
P u rific a c i n
Jarabe de glucosa
Jarabes mixtos.
Glucosa Is o m e riz a c i n
isomerasa

R e fin a m ie n to
Jarabe de fructosa
Almidon
Reference: American Association of Cereal Chemists.
1995. Approved Methods of the AACC, 9th ed. Method 22-
10, Diastatic Activity of Flour, with the Amylograph. The
Association, St. Paul, MN. Method:
Viscometric Description: A flour-buffer
slurry is heated at a constant rate. As the
starch gelatinizes, the viscosity of the hot
starch paste increases. Enzyme activity is
measured as the decrease in optimal
viscosity resulting
Citado por: Paul from
R. Mathewson, hydrolysis
Enzymes Handbook of
starch.
Cambios en el almidn nativo durante el
procesamiento.
Reference: Mathewson, P. R., and
Pomeranz, Y. 1979. Journal of the
Association of Official Analytical Chemists
62(1):198 Method:
Spectrophotometric (colorimetric)
Description: A blue-dyed starch is used as
substrate for the enzymatic reaction. -
Amylase hydrolysis
Citado por: Paul results
R. Mathewson, Enzymesin the release
Handbook
of soluble colored dextrins, which are
measured at 620 nm.