Introduccin a la Inmovilizacin de enzimas

FUNDAMENTOS
MTODOS
APLICACIONES
 FUNDAMENTOS
DEFINICIN:
Confinamiento fsico de una enzima o clula en una determinada
regin del espacio, de manera que su actividad cataltica se retenga,
y pueda ser reutilizada
 INTRODUCCIN
La inmovilizacin de enzimas permite una mejora significativa de su
estabilidad, lo que hace posible su empleo en la produccin industrial
de productos qumicos, farmacuticos, alimentos, en el tratamiento de
residuos, en el diagnstico y tratamiento de enfermedades, y otras
muchas aplicaciones.
Existen diferentes mtodos de inmovilizacin de enzimas, y el efecto
sobre las propiedades catalticas y la estabilidad de los
biocatalizadores obtenidos.
 CINTICA ENZIMTICA

Cintica enzimtica estndar Cintica enzimtica con disminucin de actividad especfica (Cataltica)
La inmovilizacin enzimtica permite una mejora significativa de su
estabilidad.
Sirve como medio de produccin industrial de qumicos, farmacuticos,
alimentos etc.
Ventajas frente a los catalizadores convencionales no biolgicos:
Presentan una gran actividad cataltica;
Muestran una gran especificidad de sustrato (incluso
estereoselectividad y regioespecificidad);
Son muy activos a temperatura ambiente y presin atmosfrica.
Por otra parte al ser solubles en agua, su separacin de los sustratos
y productos es difcil, y por tanto, no se pueden reutilizar.
MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA
Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una matriz
slida porosa constituida generalmente por prepolmeros fotoentrecruzables o polmeros
del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de poliuretano.
El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la suspensin de la enzima en una
solucin del monmero, se inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o
mediante la adicin de un reactivo qumico.
El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen ser ms resistentes que los
geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que
en el segundo caso la enzima se encuentra bloqueando una abertura dentro de las
microcavidades de una fibra sinttica.
El atrapamiento requiere poca cantidad de enzima para obtener derivados activos, la
enzima no sufre ninguna alteracin en su estructura y requiere un control riguroso de las
condiciones de polimerizacin, as como la comprobacin de que la naturaleza qumica
del proceso no altera los grupos reactivos de la protena.
MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR RETENCIN FSICA
Por Adsorcin
El desarrollo de reactores o sistemas que contengan enzimas atrapadas ha
despertado gran inters en la industria. Estos reactores emplean membranas
permeables al producto final, permeables o no al sustrato inicial y obviamente
impermeables a la enzima. Mediante una bomba se establece un flujo lquido de
sustrato que atraviesa el reactor.
En general, en esta metodologa, se procede inicialmente a la adsorcin de la
enzima sobre la Inclusin en Membranas membrana que formar el reactor. Esta
adsorcin se puede realizar de dos formas:
1. Mediante el paso de una solucin tamponada de enzima a travs de la
membrana.
2. Por contacto continuo de una solucin de enzima con la membrana.
 MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR INMOVILIZACIN QUMICA

Unin Covalente
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de inmovilizacin
ms interesante desde el punto de vista industrial. La metodologa de la unin
covalente se basa en la activacin de grupos qumicos del soporte para que reaccionen
con nuclefilos de las protenas. De entre los 20 aminocidos diferentes que se
encuentran en la estructura de las enzimas, los ms empleados para la formacin de
enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina,
y en menor medida la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y
glutmico. El resto de aminocidos, debido a su carcter hidrfobo, no se encuentran
expuestos hacia el exterior de la superficie proteica, y no pueden intervenir en la
unin covalente.
Mtodos de Inmovilizacin enzimtica
Este mtodo presenta las siguientes ventajas:
1. La manipulacin de los derivados inmovilizados es sencilla.
2. La carga de enzima permanece constante despus de la inmovilizacin.
3. Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados, de lecho fluidizado o tanque
agitado.
4. Una mayor resistencia a la desactivacin por el efecto de la temperatura, de los disolventes orgnicos o
del pH, al tener estabilizada su estructura terciaria.
En cambio la inmovilizacin por enlace covalente tambin presenta una serie de inconvenientes:
1. Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de superficie, ya que condiciona el nmero
de uniones enzima-soporte y su geometra, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.
2. El proceso de inmovilizacin puede alterar la estructura del centro activo. Para evitar esta posible
alteracin, se realiza la inmovilizacin en presencia de un inhibidor que bloquee el centro activo.
3. La inmovilizacin covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy sensibles a cambios de pH, fuerza
inica, etc.
MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
MTODOS DE INMOVILIZACIN DE ENZIMAS POR INMOVILIZACIN QUMICA
Reticulado
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha sido ampliamente utilizada
en la estabilizacin de muchas enzimas.
El mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares
entre las molculas de enzima.

Como reactivos bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos, sales de

bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida, el resultado del reticulado son enzimas
con enlaces intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de ph y temperatura.

El co-reticulado permite eliminar las prdidas de actividad enzimtica debidas a efectos difusionales,
mediante el entrecruzamiento de las enzimas con una protena sin actividad enzimtica y rica en residuos
de lisina (por ejemplo, la albmina bovina). un procedimiento mixto de inmovilizacin muy comn consiste
en inmovilizar la enzima por adsorcin sobre una resina de intercambio inico o un soporte polimrico (con
lo que se consigue una elevada carga enzimtica) y posteriormente aadir el reactivo bifuncional.
MTODOS DE INMOVILIZACIN ENZIMTICA
Actualmente el mtodo ms novedoso de cross-linking consiste en la cristalizacin de enzimas y
su posterior reticulado con glutaraldehdo (cross-linked enzyme crystals o clecs). el aumento de
estabilidad se basa en la obtencin de un entramado cristalino, donde las molculas de enzima
estn rodeadas exclusivamente por otras molculas de protena. de esta manera la propia
enzima acta como soporte, y su estructura terciaria est estabilizada por las uniones
covalentes intermoleculares.

La estructura cristalina posee canales microscpicos (20-50 ) que permiten el paso de

sustratos hasta el centro activo de la enzima donde se cataliza la reaccin. estos cristales
pueden soportar temperaturas elevadas y ph extremos, as como la accin de las proteasas.
Esta tecnologa se ha aplicado a enzimas, las cuales se han utilizado en la obtencin de
compuestos enatiomricamente puros y en la sntesis de pptidos.
*Enantimero: Del griego '', enntios, "opuesto", y '', mros, "parte" o "porcin"), tambin llamados ismeros pticos, son una
clase de estereoismeros tales que en la pareja de compuestos la molcula de uno es imagen especular de la molcula del otro y no son
superponibles
VENTAJAS DEL EMPLEO DE ENZIMAS INMOVILIZADAS

1. El aumento de la estabilidad de la enzima;

2. La posible reutilizacin del derivado, por lo que disminuyen los costes del proceso.
3. La posibilidad de disear un reactor enzimtico de fcil manejo y control, adaptado a la aplicacin de la
enzima inmovilizada.
PRINCIPALES INCONVENIENTES DEL PROCESO DE INMOVILIZACIN

1. La alteracin de la conformacin de la enzima respecto de su estado

nativo.
2. Pueden existir distintas fracciones de protenas inmovilizadas con un
diferente nmero de uniones al soporte.
3. Siempre suele haber una prdida de actividad de la enzima durante la
movilizacin.
4. El biocatalizador es ms caro que la enzima nativa
APLICACIONES EN BOSENSORES
En bosensores:

Los bosensores son de gran utilidad en el campo del diagnstico clnico. Los
niveles sricos de glucosa, lactato y cido rico se pueden detectar mediante
electrodos enzimticos disponibles comercialmente. Actualmente, el desarrollo de
nuevos bosensores va dirigido a la deteccin de frmacos, clulas y virus
patgenos.
En el caso del control de calidad en las industrias alimentarias, los bosensores
pueden determinar el grado de contaminacin microbiana, o por ejemplo,
cuantificar el azcar presente en bebidas.

Medidor de grados Brix Bx

*Los grados brix cuantifican la cantidad de solidos
Medidor de Alcohol (% o Gay-Lussac GL) (Azcares) que estn disueltos en un lquido
 APLICACIONES EN BOSENSORES
Finalmente, los bosensores pueden ser muy tiles en el control de la polucin del
medioambiente. Los analizadores de contaminantes en el agua se basan en el empleo de
bosensores capaces de detectar la presencia de residuos txicos, pesticidas, herbicidas o
microorganismos.
 APLICACIONES MDICAS
Existen muchas enfermedades causadas por una alteracin o
carencia de una determinada enzima. Tambin hay enzimas con
actividad antitumoral, cicatrizante y con otras acciones
teraputicas. El tratamiento con estas enzimas inmovilizadas
permitira una accin ms prolongada, ya que seran ms
resistente a la accin de las proteasas. Por ejemplo, la L-
asparaginasa se utiliza en el tratamiento de leucemias y cnceres
diseminados que requieren asparragina para desarrollarse. En la
actualidad se ha diseado un hemodializador de fibra hueca que
contiene asparaginasa inmovilizada

L-Asparaginasa
 APLICACIONES EN LA INDUSTRIA FARMACUTICA
La Industria Farmacutica trabaja con molculas lbiles, y en muchos casos con
molculas quirales*. El empleo de enzimas inmovilizadas es una alternativa seria a
la sntesis qumica en pasos clave, donde no conviene trabajar a temperaturas
altas o se requiere una elevada especificidad de sustrato. Los enzimas son unos
reactivos quirales estrictos, es decir, biocatalizadores con una estructura
tridimensional asimtrica definida que permiten la obtencin de productos de
gran pureza ptica. Se trata de una ventaja fundamental cuando las
reglamentaciones exigen la sntesis de compuestos pticamente puros, ya sean
frmacos, hormonas o antibiticos.
*Quiralidad:
Quiralidad Molecular:

La palabra quiral fue introducida por William Thomson (Lord Kelvin) en 1894 para designar objetos que no son superponibles con
su imagen especular. Aplicado a la qumica orgnica, podemos decir que una molcula es quiral cuando ella y su imagen en un
espejo no son superponibles.

La quiralidad est a menudo asociada a la presencia de carbonos asimtricos. Un carbono asimtrico es aquel que se une a cuatro
sustituyentes diferentes.