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Cromatografa
Gas Lquido
Fase mvil (adsorcin) (particin)
Fase normal
(GC)
Fase reversa
(LC)
No polar Polar
Cromatografa gaseosa-slida (GSC)
Fuente de gas
Sistema de inyeccin
Columna cromatogrfica
Sistema de deteccin
Sistema para recoleccin
de datos e interpretacin
Cromatografa gaseosa-slida (GSC)
Consiste en el acarreo de una muestra a travs de la fase
estacionaria (columna) por la fase mvil (gas).
Hidrgeno/Helio
Nitrgeno
Inyector
El puerto de inyeccin permite la introduccin
de la muestra directamente en la columna.
Existen dos mtodos de inyeccin de la
muestra: split/splitless.
Se utilizan temperaturas elevadas de
inyeccin (~240 C) para la vaporizacin
instantnea de la muestra.
La muestra vaporizada se mezcla con el gas
acarreador para su transporte en la columna.
Horno
Programacin isotrmica.
La temperatura es constante durante toda
la separacin, y la temperatura ptima es
alrededor del punto medio del rango de
ebullicin de la muestra.
Programacin de temperaturas.
La temperatura es incrementada de
manera continua o en pasos con respecto
a la progresin de la separacin.
Columnas
Los principales tipos de columna son: empacadas y capilares.
FSWC: fused-silica wall-coated; WCOT: wall-coated open tubular; SCOT: support-coated open tubular
Columnas
Consideraciones para la seleccin de la columna:
Tipo de analito
Caractersticas de la columna
Espesor
Dimetro interno
Longitud
Vapores y compuestos
Fotoionizacin 0.002 0.2 ppm
gaseosos
Tipos de sistemas de deteccin
Detector de ionizacin de llama (FID)
Los detectores de ionizacin (FID, ECD, PID) interactan con los
solutos eludos de la columna del GC para producir una corriente
que vara en proporcin de la cantidad de soluto presente.
Bomba cuaternaria
Inyeccin
Columna
Detectores
Fotodiodos
Dispersin de luz
Espectrmetro de
masas
Sistema de separacin UPLC
Ventajas
Velocidad
Resolucin
Sensibilidad
Baja dispersin: Columnas de
pequeo dimetro empaquetadas
con partculas < 2 m y distribucin
de fase mvil a 15 000 psi
Bomba cuaternaria
Fase mvil Seleccin de disolventes
Fase mvil Seleccin de disolventes
Fase mvil Variacin de pH del disolvente
Ion molecular
Espectro de masas
La molcula de dixido de carbono est compuesta por tres
tomos, por lo que su espectro de masas es muy sencillo.
Triple cuadrupolo
MS1 - Scan
MS2 - Daughter
MRM (TIC)
Origen de la muestra
Analito(s) de inters
Cromatgrafo de gases/espectrmetro de masas
Mtodo de separacin
Analito(s) de inters
Seleccin de la columna
Eficiencia/especificidad
del mtodo
Cromatgrafo de gases/espectrmetro de masas
Interpretacin de datos
Analito(s) de inters
Base de datos
Resultados de inters
Identificacin de metabolitos
Preparacin e inyeccin de muestras
Interpretacin de datos
Preparacin de muestras
Extraccin de analitos de inters
Derivatizacin de analitos
Sililacin
Acilacin
Alquilacin
Extraccin de analitos de inters
Aquilacin
Reemplazo de un hidrgeno activo con un grupo alquilo o arilo
Sililacin
Reemplazo de un hidrgeno activo con un grupo alquilsililo
Derivatizacin de analitos de inters
Sililacin: BSTFA-TMCS, bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con
trimetilclorosilano (1%)
El BSTFA produce compuestos con grupos trimetilsilil, formando derivados
voltiles y trmicamente estables para su anlisis por GC-MSD.
Desventajas
Incremento del peso molecular de los compuestos
Derivatizacin de analitos de inters
Sililacin: BSTFA-TMCS, bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida con
trimetilclorosilano (1%)
El BSTFA es susceptible a hidrlisis, por lo que se recomienda la eliminacin
de agua de las muestras previo a la derivatizacin.
Evaporar Adicionar 50
Re suspender
muestra con L de BSTFA- Inyectar
muestra
N2 gaseoso TMCS
Seleccin de columnas
Volumen de inyeccin: 2 L
Mtodo base
Columna Columna: HP-5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 m)
Extraccin de resultados
Interpretacin de datos
Sntomas en los cromatogramas
No se observan picos:
La concentracin o el volumen de la muestra es insuficiente.
No hay analitos en la muestra.
La jeringa no est correctamente instalada.
La entrada del GC est sucia.
La rosca de la entrada de la columna est suelta.
Le
dice al amplificador el rango de voltaje con en el
que va a trabajar
Control de la ganancia
Lo que hace una ganancia es establecer un parmetro para
que la unidad principal est sincronizado con la potencia
que puede desarrollar el amplificador
Adsorcin:
Es la retencin de una especie qumica en los sitios activos de la superficie de un slido,
quedando limitado el fenmeno a la superficie que separa las fases o superficie interfacial, esta
retencin superficial puede ser fsica o qumica.
C. en fase inversa: C. con una fase estacionaria no polar y una fase mvil polar.
C. en fase normal: C. con una fase estacionaria polar y una fase mvil no polar.
101
Terminologa
Disolvente : Cualquier fase mvil.
Fase estacionaria:
Material que permanece dentro de la columna cromatogrfica
durante la cromatografa y que retiene algn componente de la
muestra, posee una gran rea superficial y puede ser un slido o
un lquido dispuesto sobre un slido que acta como soporte.
102
Terminologa
Fase mvil:
Es un fluido que puede ser lquido, gas o fluido supercrtico que se usa como
portador de la mezcla y que se hace pasar a travs de la columna cromatogrfica y
la fase estacionaria.
Soporte:
El material slido inerte que en la C. de reparto sirve para sostener la fase
estacionaria lquida en su sitio.
103
Parmetros cromatograficos
Pico de aire
Lnea base
106
Volumen y tiempo de retencin
107
Volumen y tiempo de retencin
VR = tR flujo
tRb
tRa
seal
A B
108
Terminologa
Tiempo muerto tM:
109
Terminologa
110
Terminologa
La velocidad lineal promedio de migracin del soluto es:
111
Terminologa
Velocidad lineal promedio u del movimiento de las molculas de la fase mvil
es:
112
Plato terico
Sistema ESTATICO en equilibrio
A mvil A estacionaria
La constante de equilibrio para este proceso se denomina:
Constante de distribucin
Razn de distribucin o
Coeficiente de distribucin
Mide la distribucin del analito entre la fase estacionaria y la fase mvil.
114
Coeficiente de reparto
115
Factores que influyen en la separacin
Valores de K suficientemente diferentes.
Eficiencia en la columna:
tR mas cortos
Picos mas angostos
116
Coeficiente de reparto
L
v tR t0 nsolutoM
f
u L tR nsolutoT
t0
C M VM
v u
C M VM C E VE
Dividiendo entre: CMVM
1
v u
1 C E VE
C M VM
118
Coeficiente de reparto
Como:
K
C solutoE
1
C solutoM v u
V
1 K E
VM
VM u
K 1
VE v
Coeficiente de reparto
VM u
K 1
VE v
Cuando se incrementa:
VE: Se incrementa la retencin.
VM: Disminuye la retencin.
Coeficiente de reparto
VM u
K 1
VE v
VE y VM, pueden alterarse cambiando el dimetro y la
longitud de la columna
122
Factor de capacidad
nE
k
nM
123
Terminologa
Factor de retencin o factor de capacidad:
Describe la velocidad de migracin de los solutos en la columna. Para una especie A,
el factor de capacidad kA se define como:
124
Terminologa
Factor de retencin o factor de capacidad:
Medida de tiempo transcurrido en la f. estacionaria en relacin con el tiempo
transcurrido en f. mvil.
Es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, dividido entre el
tiempo de elucin de una banda no retenida (k=0)
Cuando el factor de capacidad es menor que la unidad, la elucin es tan rpida que es
difcil determinar con exactitud los tiempos de retencin.
Cuando el factor es del orden de 10 o mayor, los tiempos de retencin son
excesivamente largos.
125
Factor de capacidad
k K
VE 1
VM v u
1 k
1
v u
1 K VE
VM
L L
u v
t0 tR
Factor de capacidad
L L 1
tR t 0 1 k
tR t0
k
t0
Magnitudes corregidas
Tiempo de retencin ajustado
t B
t A
tB
t
tA k R
t0
t0
0.0
tiempo
1 k' 3 128
Factor de selectividad
Medida de separacin relativa entre dos picos
129
Terminologa
Factor de selectividad:
El factor de selectividad de una columna para dos especies:
130
Factor de selectividad
Se puede evaluar la selectividad en base a los
tiempos de retencin para cada soluto.
t RA t 0
k
t0 t RA t 0 t RA
A
K t RB t 0
B t RB t 0 t
RB
t0
1 2
Terminologa
Resolucin cromatogrfica:
La resolucin cromatogrfica RS de una columna es una medida cuantitativa de su capacidad para separar
dos analitos.
132
Resolucin
134
Terminologa
Eficiencia en cromatografa
La eficiencia se define en base a dos trminos
1 La altura del plato H
2 El nmero de platos N.
135
Nmero de plato terico
En extraccin con disolvente, un plato es representado por
cada equilibrio (extraccin).
En una destilacin fraccionada, un plato es representado por
cada destilacin.
En una columna cromatografca se puede aplicar el concepto
de plato terico (cada evento de separacin realizado).
Se puede estimar el nmero de platos tericos en la columna
basado en los tiempos de retencin y ancho de las seales
de cada compuesto.
136
Altura equivalente a un plato terico
Longitud de columna en que se lleva a cabo una
separacin.
L
H
N
137
Equilibrios
138
Terminologa
Nmero de platos N:
139
Terminologa
Las bandas cromatogrficas tienen una forma gaussiana,
Definir eficacia de una columna en trminos de varianza por unidad de longitud.
140
Nmero de plato terico
Mtodo de las tangentes.
2
tR
N 16
W tan
141
Nmero de plato terico
142
Resolucin
144
145
Teora de la separacin
146
Factor de Asimetra
AF = 1 Pico simtrico
AF = b / a AF > 1 Pico coleado
AF < 1 Pico cabeceado
a b
10% 147
Factor de asimetra
Cs
CM
148
Asimetra de la banda
Si k es mayor a concentraciones mas bajas de soluto
La zona de baja concentracin del pico eluye mas lentamente.
Por lo tanto la seal del pico ser coleada
Combinacin equivocada de muestra y empaque de columna
149
Resolucin
Ecuacin fundamental de la resolucin
1
1 1 k L 2
R
4 1 k H
1 1 k
N 2
1
R
4 1 k
Alfa se aumenta:
Sustituyendo la fase estacionaria.
151
Variables cinticas
Variable Smbol Unidade
o s
Factor de retencin k -
H = mm
153
v = cm/s
Variables cinticas
Efecto del caudal de la fase mvil sobre la altura de plato. Gas/Liq (-1)
Columnas
En lquidos 25 a 50 cm (cada de presin)
En gases 50 m o ms
154
Teora Cintica
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y Sjenitzer:
Dinmica de la separacin.
H A Cu A CS CM u
B B
u u
155
Difusin de Eddy
Termino del camino libre
Difusin en remolino
Difusin parasita
B
H A Cu
u 156
Difusin parsita
A 2 d p
H = cm
N
157
Difusin longitudinal
B
H A Cu
u 158
Difusin longitudinal
H =N
cm : Cte. del empaque, factor de obstruccin.
Columnas rellenas = 0.6
Columnas capilares = 1
B/v
v
B 2DM 159
Resistencia a la transferencia de masa
B
H A Cu
u
160
Transferencia de masa
HN
= cm df: Grosor de la fase estacionaria.
Cv
A
B/v
v
8k d 2f
C
1 k DE
2
161
Efecto global
N
H = cm
B
H A Cu
u
Global
H ptimo Cu
A
B/u
v
v = cm/s
Vel. lineal
ptima
162
Teora Cintica
J.J. van Deemter, Zuiderweg, Klinkenberg y
Sjenitzer: Dinmica de la separacin
2DM 8k d 2
H 2 d p u
f
1 k DE
2
u
163
Anlisis cualitativo y cuantitativo
Cualitativo
Parmetros de retencin
Detectores selectivos
EM, FTIR, RMN, UV
Cuantitativo
Altura de pico
rea de pico
Buena resolucin
Respuesta en el rango de linealidad del detector 164
Anlisis cualitativo y cuantitativo
Anlisis cuantitativo
165
Anlisis cuantitativo
Normalizacin de reas
Estndar externo
Estndar interno
166
Anlisis cuantitativo
Normalizacin de rea o altura de pico
Limitacin: todos los componentes deben eluir.
A1
x% 100
A1 A2 A3 An
167
Anlisis cuantitativo
Normalizacin de rea con factor de respuesta
conc
F
area
F1 A1
x% 100
F1 A1 F2 A2 F3 A3 Fn An
168