Sunteți pe pagina 1din 141

GC - introducere

Clasificarea tehnicilor cromatografice

c.p. c.a.
c.p. c.a. c.p. c.a.

c.a. - cromatografie de adsorbie


c.p. - cromatografie de partiie p.2 - Bazele teoretice ale cromatografiei
Absorbia i adsorbia ...

ABsorbie ADsorbie

p.3 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Distribuia concentraiei solutului n
faza mobil i faza staionar
direcia de curgere

Faza mobil
profilul concentraiei
transfer din faza staionar solutului n faza mobil
n faza mobil

profilul concentraiei
solutului n faza
staionar
transfer din faza mobil
n faza staionar

Faza staionar p.4 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Ti m p d e r e t e n i e i o r d i n e d e e l u i e
intensitate

octan nonan
Injecie pic 1

timp

p.5 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Forma picului cromatografic

Concentraie
distan

tr

punct de inflexiune
Rspunsul detectorului

injecie timp sau volum


p.6 - Bazele teoretice ale cromatografiei
Schema procesului cromatografic
direcia de curgere a f.m. detector cromatogram
timp

coloana cromatografic p.7 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Lrgirea zonei cu prob

coloan

start

p.8 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Factori ce duc la lrgirea zonei cu prob
- echilibrul interfazic -
faza mobil direcie de eluie

faza staionar

zona cu prob la intrare n coloan

faza mobil

faza staionar

zona cu prob n coloan, la un timp oarecare de eluie


p.9 - Bazele teoretice ale cromatografiei
Factori ce duc la lrgirea zonei cu prob
- difuziune longitudinal -

zona cu prob la scurt timp dup intrarea n coloan

difuziune longitudinal

zona cu prob dup un timp mai ndelungat de eluie

direcie de eluie

p.10 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Factori ce duc la lrgirea zonei cu prob
- difuziune structural -

timp

p.11 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Factori ce duc la lrgirea zonei cu prob
- difuziune transversal -
zona cu prob la intrare n coloan

direcie de eluie

zona cu prob n coloan, la un timp oarecare de eluie

p.12 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Factor de separare i factor de capacitate

retenia relativ sau factorul de separare (pentru compuii 1 i 2)

= (tr2/tr1) = k2/k1 = K2/K1

factorul de capacitate

k = (tr tm)/tm= CsVs / CmVm= K (Vs/Vm)


(raportul ntre timpul petrecut de un component n f.m. respectiv f.s.)

coeficientul de partiie
K = Cs/Cm

p.13 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Numrul de talere teoretice i
nlimea echivalent a talerului

Numrul de talere teoretice (N)

tR timpul de retenie
wh limea picului la din nlime

nlimea echivalent a talerului teoretic (H)

L lungimea coloanei

p.14 - Bazele teoretice ale cromatografiei


2((tR)y - (tR)x)
Rezoluia Rs = -----------------
Wx + Wy

rezoluie rezoluie
0.5 0.75

intensitate
intensitate

rezoluie
1.0 rezoluie
1.5
intensitate
intensitate

timp timp

p.15 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Compararea rezoluiei
la diverse concentraii

p.16 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Izoterma de adsorbie

p.17 - Bazele teoretice ale cromatografiei


Picuri cromatografice asimetrice

2
41.7(t r / w0 .1 )
N
A / B 1.25

p.18 - Bazele teoretice ale cromatografiei


E c u a i a Va n D e e m t e r

B
H A C x
x

Unde A, B, C sunt contribuii din:

A difuziune structural
B difuziune longitudinal
C timp de echilibrare

ux debitul liniar

p.19 - Bazele teoretice ale cromatografiei


E c u a i a Va n D e e m t e r

B
H A C x
x

Unde A, B, C sunt contribuii din:

A difuziune structural
B difuziune longitudinal
C timp de echilibrare

ux debitul liniar

p.20 - Bazele teoretice ale cromatografiei


C u r b e l e Va n D e e m t e r

p.21 - Condiii de analiz GC-MS


F a z a m o b i l - c u r b e l e Va n D e e m t e r
p e n t r u H 2, H e i N 2

Debite recomandate (ml / min):

Diametru interior Hidrogen Heliu


0.10 mm 1.0 0.5
0.25 mm 2.5 1.3
0.32 mm 3.2 1.9
0.53 mm 5.3 4.2

p.22 - Descrierea prilor componente ale GC


C u r b e l e Va n D e e m t e r

p.23 - Condiii de analiz GC-MS


Efectul vitezei fazei mobile

Vitez mare >> scderea R

p.24 - Condiii de analiz GC-MS


Separarea gaz - cromatografic
Injector

Detector
Cromatograf

Coloan cromatografic

Calculator sau nregistrator


Gaz purttor Cuptor
Proba: amestec A+B+C+D+E

E A
Cromatogram

B E
D
A C

B
Intensitate

??? - volatilitate
D
??? - punct de fierbere
0 5 10 15 20
??? - mas molecular Timp (minute)
??? - polaritate
??? - matrice, solvent, stabilitate termic, ali factori.
p.25 - Principiul determinrii gaz-cromatografice
Faza mobil cerine de puritate

p.26 - Descrierea prilor componente ale GC


Faza mobil cerine de puritate

p.27 - Descrierea prilor componente ale GC


Dispozitive de msurare i reglare a debitului

p.28 - Descrierea prilor componente ale GC


Coloane cromatografice

solut adsorbit la
suprafaa fazei
Convenionale staionare

peretele coloanei
capilare
Capilare

solut dizolvat
n faza staionar
depus pe peretele
capilarei

p.29 - Descrierea prilor componente ale GC


Polaritatea coloanelor cromatografice
Me
Si O 100 % metil (HP-1, DB-1 etc.) Nepolar
Me n

Ph Me
5% fenil (HP-5, DB-5, etc.) Nepolar
O Si O Si O 35% fenil (HP-35, DB-35, etc.) Polaritate medie
Ph m Me n 50% fenil (HP-50+, DB-17, etc.) Polaritate medie

R Me
6% cianopropilfenil (HP-1301, DB-1301, etc.) Polaritate medie
O Si O Si O
14% cianopropilfenil (HP-1701, DB-1701etc.) Polaritate medie
R' m Me 50% cianopropilfenil (HP-225, DB-225, etc.)
n Polaritate mare

H H
HO - - C-C-O- -H 100% PEG (HP-WAX) Polar

H H
p.31 - Descrierea prilor componente ale GC
Polaritatea coloanelor cromatografice

HP-17: 50% fenil i 50% metil siloxan


comparativ cu
HP-50+ : (50%)-Difenil (50%)-Dimetilpolisiloxan

CH3

Si O Si O Si O
CH3 m CH3
n n

! coloanele sunt diferite !

p.32 - Descrierea prilor componente ale GC


Polaritatea coloanelor cromatografice
C10 C12
Hexanol
100% Metil
(nepolar)

0 2 4 6 8
condiii identice la GC
C10 coloane de dimensiuni identice
C12 faz staionar diferit
Hexanol 100% PEG
(polar)

0 2 4 6 8

p.33 - Descrierea prilor componente ale GC


Ordinea de eluie i punctele de fierbere

p.34 - Descrierea prilor componente ale GC


Caracteristicile coloanelor cromatografice

faza staionar
diametrul interior
lungimea
grosimea filmului
p.35 - Descrierea prilor componente ale GC
Caracteristicile coloanelor cromatografice
- diametrul interior -

80C izoterm
21.81
0.25 mm
0 5 10 15 20

16.06 0.32 mm
0 2 4 6 8 10 12 14 16

Timpul de retenie este invers proporional cu diametrul interior

p.36 - Descrierea prilor componente ale GC


Caracteristicile coloanelor cromatografice
- diametrul interior -

n =58,700 n =107,250

0.53 mm 0.32 mm
capacitate pentru prob : < 2 ug < 500 ng

p.37 - Descrierea prilor componente ale GC


Caracteristicile coloanelor cromatografice
- lungimea coloanei -

Lungime (m) N
15 71,430
30 142,860
60 285,720

0.25 mm ID
N/m = 4762

p.38 - Descrierea prilor componente ale GC


Caracteristicile coloanelor cromatografice
- lungimea coloanei -

R=0.84 R=1.16 R=1.68


2.29 min 4.82 min 8.73 min

15 m 30 m 60 m

p.39 - Descrierea prilor componente ale GC


Caracteristicile coloanelor cromatografice
- grosimea filmului -
7.00
grosimea mai mare 0.25 m
a filmului conduce la0 2 4 6 8
timpi de retenie
mai mari
25.00
1.00 m
0 5 10 15 20 25

grosimea mai mare a filmului


conduce la pierderi de f.s. mai mari

p.40 - Descrierea prilor componente ale GC


Caracteristicile coloanelor cromatografice
- grosimea filmului -

formarea produilor siloxanici de degradare H3C CH3


Si
HO O
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3
Si O Si O Si O Si O Si Si
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH O
3 CH3 CH3
Si O Si O Si O Si O Si O Si O Si OH
CH3
CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3 CH3

CH3 CH3 CH3 CH3


Si O Si O Si O Si OH H3C CH3
CH3 CH3 CH3 CH3 + O
Si
O
H3C Si Si CH3
O CH
H3C 3

Reacia se repet

p.41 - Descrierea prilor componente ale GC


Efectul grosimii filmului

p.42 - Condiii de analiz GC-MS


p.43 - Condiii de analiz GC-MS
Operarea n regim programat de
temperatur
i) Injectoare fr divizarea fluxului de faz mobil (splitless);
ii) Injectoare cu injecie direct n coloan, la rece (cool-on-column);
iii) Injectoare de tip valv rotativ pentru gaze sau lichide;
iv) Injectoare de tip diafragm pentru probe lichide.

i) Injectoare cu divizarea fluxului de faz mobil (split);


ii) Injectoare cu i fr divizarea fluxului de faz mobil (split / splitless);
iii) Injectoare de tip head space;
iv) Injecie de tip purge and trap;
v) Injecie cu piroliz (pirolizoare);
vi) Injectoare cu programare de temperatur (program temperature vaporizer - PTV).
INJECTOARE Sisteme de introducere a probei
clasice
cu splitare
split-splitless
on column
P T V, a l t e t i p u r i

PTV

On column Split-splitless
p.46 - Descrierea prilor componente ale GC
Sisteme de introducere a probei
specifice analizei gazelor

p.47 - Descrierea prilor componente ale GC


are - avantajele injeciei split-splitless

p.48 - Descrierea prilor componente ale GC


Sisteme automate de introducere a probei

p.49 - Descrierea prilor componente ale GC


Sistemul headspace

Sistem static

Sistem dinamic

p.50 - Descrierea prilor componente ale GC


Sistemul headspace cu compensare de presiune

p.51 - Descrierea prilor componente ale GC


Sistemul headspace cu compensare de presiune

p.52 - Descrierea prilor componente ale GC


Sistemul headspace

inj.lichid

Headspace

p.53 - Descrierea prilor componente ale GC


Sistemul headspace

1 ml 5 ml 5 ml + NaCl
sol.apoas ciclohexan + dioxan

Influena volumului de prob i a adaosului


de NaCl asupra senzitivitii
Influena temperaturii asupra senzitivitii
p.54 - Descrierea prilor componente ale GC
Detectori

Distructivi
Spectrometru de mas (CI/EI)
Ionizare n flacr (FID)
Pentru azot i fosfor (NPD)
Flame - fotometric (FPD)
Emisie atomic (AED)
ICP, ICP-MS

p.55 - Descrierea prilor componente ale GC


Detectori distructivi

FPD
FID

NPD AED

p.56 - Descrierea prilor componente ale GC


Detectori

Nedistructivi
Conductivitate termic (TCD)
Captur de electroni (ECD)
Fotoionizare (PID)
Infrarou (FT-IR)
RMN

p.57 - Descrierea prilor componente ale GC


Detectori nedistructivi

TCD

PID

ECD

p.58 - Descrierea prilor componente ale GC


Cromatograme cu detectori diferii

p.59 - Descrierea prilor componente ale GC


Nivel de zgomot, drift i bleeding
n cromatogram
Picuri incomplet separate prin GC

p.61 - Condiii de analiz GC-MS


Identificarea
componenilor
pentru picuri
incomplet separate
prin GC

p.62 - Condiii de analiz GC-MS


Soluii hardware pentru separare incomplet

p.63 - Condiii de analiz GC-MS


Stabilirea condiiilor de analiz pentru GC
Stabilirea condiiilor
Condiii la injector

de analiz
Debitul de gaz purttor

debit mare vitez de eluie mare >> pierdere de rezoluie

debit mic creterea rezoluiei >> creterea timpului de retenie

Volumul de injecie volum mare >> poate duce la depirea capacitii

coloanei pentru prob, volum mic >> senzitivitate sczut


Temperatura

temperatur mare mobilitate mare, vaporizare rapid

>> potenial de degradare a compuilor n injector


temperatur mic depunerea compuilor grei >> contaminare

Condiii la coloan prin optimizare n funcie de natura probei

Condiii la detector temperatur acoperitoare pentru evitarea condensrii compuilor grei

Stabilirea condiiilor de analiz pentru injectorul SSL


Temperatur acoperitoare (20-30 grade peste punctul de fierbere al celui mai greu compus)

Operare split rat de splitare mai mare de 1:20, gas saver pentru economisire He

Operare split - splitless timp de splisless 0.5 1 ml/min, debit de purjare mare (> 50 ml/min)

Parametru
Spectrometria de mas
Importana MS
n analiza
structural
Cuplajul GC-MS - compatibilitate
Faza mobil n stare gazoas, mobilitate mare eliminare uoar prin
sistemul de vid, interfern minim cu proba
Sistem simplu pentru linia de transfer este necesar numai termostatarea
Transfer al probei n faz gazoas, cu puritate avansat
Limitare la capabilitatea de separare a metodei GC
Permite obinerea ionilor moleculari cu energie ridicat (nu este necesar o ionizare
suplimentar cum ar fi la HPLC-MS pentru fragmentarea ionului molecular) viteze
mari de scanare n full scan
Precauii
Limitele de temperatur la linia de transfer minim 20oC sub limita

specificat pentru coloan


Calitatea coloanei impurificare cu siloxani

Exploatarea incorect a coloanei impurificare cu siloxani

Probe cu impuriti nevolatile cu mas mare (ex.trigliceride) impurificare

Debitul incorect al fazei mobile depirea capacitii pompei de vid nalt


p.68 - Compatibilitatea GC-MS
Volumul incorect de injecie contaminarea sursei
Stabilirea condiiilor de analiz pentru GC
Stabilirea condiiilor
Condiii la injector

de analiz
Debitul de gaz purttor

debit mare vitez de eluie mare >> pierdere de rezoluie

debit mic creterea rezoluiei >> creterea timpului de retenie

Volumul de injecie volum mare >> poate duce la depirea capacitii

coloanei pentru prob, volum mic >> senzitivitate sczut


Temperatura

temperatur mare mobilitate mare, vaporizare rapid

>> potenial de degradare a compuilor n injector


temperatur mic depunerea compuilor grei >> contaminare

Condiii la coloan prin optimizare n funcie de natura probei

Condiii la linia de transfer n mod curent o valoare acoperitoare

Stabilirea condiiilor de analiz pentru MS


Domeniul de mas suficient de mare domeniu mare >> vitez mic de achiziie mic

Threshold acoperitor pentru integrarea picurilor mici

Viteza de achiziie acoperitoare pentru forma picului cromatografic

p.69 - Condiii de analiz GC-MS


Schema spectrometrului de mas
Introducerea probei Ieirea datelor

Intrare
Achiziia de
date

Sursa de ioni Separator de


Detector
(camera de ionizare) ioni

Pompe de
vid
Sistemul de vid al spectrometrului MS
Presiune (Torr) Drum liber mijlociu (meters)
760
1
10-3
10-5
10-7
10-9

Pompe de vid preliminar Pomp de difuzie Pomp turbomolecular


ex.rotary-vane
Introducerea probei prin termodesorbie
O C H3
Introducerea probei
H3C
N
C
C
N prin sistem cromatografic
CH
C C
O N
H
N
informaie obinut :
masa molecular
(~1 nanogram) Spectrometru
de mas
compus pur separat
cromatografic distribuia izotopic

fragmentarea ionului mole

194
Mass Spectrum

Cromatograf
GC, HPLC, etc
67 109

55
82
E A
42
Abundance

D 94 136 165

B 40 60 80 100 120 140 160 180 200


C Mass (amu)
Proba: amestec A+B+C+D+E
Linia de transfer GC
Linia de transfer GC

Linia de transfer

Sistemul quick-swap pentru schimbarea coloanei fr vent


Introducerea probei prin ESI, TS, APCI,
p l a s m a s p r a y, n a n o s p r a y
Introducerea probei prin ICP

Exemple de cuplaje posibile:


- GC-ICP-MS
- HPLC-ICP-MS
- LA-ICP-MS
Exemple de metode de ionizare a probei
Schema camerei de ionizare clasice (EI)

Colector pentru electroni Electrod de focalizare

Ioni pozitivi
+
Molecule Inlet _
Repeller
neutre + _
+ + + + + +
+
ioni ctre
separatorul
e- e- e- magnetic
_ Electroni

Filament Electrod
accelerare

+
Specii formate la ionizarea EI
Ionizarea chimic CI
Alura spectrelor n EI respectiv CI pentru efedrin

EI

CI
Ionizarea prin electrospray ESI

Alura spectrelor n EI respectiv ESI


pentru amfetamin
Ionizarea prin desorbie

Spectrul FD pentru polistiren


EI

Alura spectrelor
n EI respectiv FI
(field ionization)

FI
Ionizarea prin bombardament cu
a t o m i r a p i z i ( FA B )

S p e c t r u l p o l i e t i l e n g l i c o l u l u i p r i n FA B
Ionizarea prin desorbie asistat laser
din matrice (MALDI)

Spectrul polistirenului prin MALDI


Schema separatorului de ioni
cu sector magnetic

traiectoria n
domeniu

traiectorie n afara
domeniului
(ioni prea uori)

Detector
Sursa de
ioni
N traiectorie n afara
domeniului
Electromagnet (ioni prea grei)
Schema separatorului de ioni
cu sector magnetic cu dubl focalizare
Geometrii cu focalizare
dubl i tripl
Schema separatorului de ioni
cu filtru quadrupolic
ion resonant

ion nerezonant

_
Detector
+

+
_

Sursa de
ioni

Tensiune continu
i alternativ
Schema separatorului de ioni
cu trap ionic, nanotehnologii
Schema separatorului de ioni
cu timp de zbor (TOF)
Separarea ionilor TOF
Schema separatorului de ioni
orbitrap
Schema separatorului de ioni
cu rezonan ciclotronic

Spectru ESI Q-FT-ICR


Schema cuplajului MS - MS
Va r i a n t e d e c u p l a j M S - M S
Detectorul multiplicator de electroni

microcanal
dinod
Detectorul multiplicator de fotoni
Rezoluia spectral
Rezoluia spectral MS
Mecanismul ionizrii probei
M + e- M+. + 2e-
M+.

unde M+. => ionul molecular

Ioni moleculari formai n EI:


M+.
(M+1)+.
(M+1)+.
(M+2)+.
...
Abundena picurilor izotopice
C10H14
13C 10 * 1.11% = 11.1%
2H 14 * 0.015% = 0.21%
-------
135pic / 34pic 11.31%
Distribuia izotopic natural
Analiza izotopic
Determinarea formulei moleculare
Alura picurilor moleculare pentru
compui cu Cl sau Br
Spectrometrul IR-MS pentru
analiz izotopic
Spectrometrul IR-MS pentru
analiz izotopic
Spectrometrul IR-MS pentru
analiz izotopic (ex.proveniena heroinei)
Evidenierea fragmentrilor specifice pe
baza distribuiei izotopice pentru Cl sau Br
Regula azotului

compuii organici cu numr par de atomi de N


n molecul au masa molecular par, compuii
cu numr impar de atomi de N au masa
molecular impar

ionii OE respect regula azotului

ionii EE respect regula azotului inversat


Picul molecular i picul de baz
- tetrahidrocanabinol -
PB
PM
Dificulti n
atribuirea
spectrelor
Utilizarea bibliotecilor de spectre
Dificulti la cutarea n bibliotec
- spectru MDMA -
Energii relative ale orbitalilor moleculari
n compui organici
Formarea ionului molecular n funcie
de localizarea electronului expulzat
Energii de ionizare pentru
molecule i radicali (n eV)
Ti p u r i d e f r a g m e n t r i
Diagrama energetic a fragmentrii
Diagrama energetic a fragmentrii
exemplificare
Ti p u r i c u r e n t e d e p i e r d e r i d e
fragmente neutre
Pierderi de molecule neutre
Ruperea s
Ruperea s
Ruperea
Ruperea
Reacii de fragmentare
ruperea
Reacii de fragmentare - ruperea
Reacii de fragmentare - ruperea
regula pierderii celui mai
mare fragment alchil
Reacii de fragmentare - ruperea
la distan fa de centrul cu sarcin
Rupere inductiv

rupere i
Rearanjare
Reacii de fragmentare
efectul orto
Reacii de fragmentare
ruperea retro Diels-Alder