Sunteți pe pagina 1din 78

ANTAGONISMUL

MICROBIAN. ANTIBIOTICELE.
BACTERIOCINELE
COMUNITILE MICROBIENE. RELAIILE
DINTRE MICROORGANISME N COMUNITI

n natur microorganismele vieuiesc n cadrul


asociaiilor, care includ bacterii, micete, alge,
protozoare .a. Astfel de asociaii se ntlnesc n
variate habitate naturale: ap, sol, pe plante, pe
suprafaa i n corpul uman i animal.
BIOTOP spaiu cu condiii de via particulare
(sol, lacuri, oceane, paduri, sau conjunctiva,
mucoasa intestinal, orofaringele, vaginul,
tegumentul, etc), populat i transformat de
asociaii de fiine vii, inclusiv microorganisme.
MICROBIOCENOZ (ecosistem, comunitate
microbian) asociaii microbiene ce populeaz
un biotop.
Microorganismele prezente ntr-un biotop
particular constituie microflora acestui habitat
(m/f cutanat, intestinal, etc)
Aceasta joac un rol important n protejarea
gazdei fa de o invazie microbian ulterioar,
actionnd prin urmtoarele mecanisme:
competiie pentru aceiai nutrieni;
competiie pentru aceiai receptori de pe
celulele gazdei;
producere de bacteriocine, vitamine (gr B,
K);
producere de acizi grai volatili sau ali
metabolii;
stimularea continu a sistemului imun;
stimularea producerii unor factori imuni de
protecie (anticorpii naturali).
MICROBIOM totalitatea
microorganismelor, elementelor lor
genetice si a interactiunilor acestora
intrun mediu (ex. in organismul uman si
pe suprafata sa).
Joshua Lederberg 1958 Laureat al
premiului Nobel
Unele studii demonstreaza ca diabetul,
bolile autoimune si chiar schizofrenia pot
fi cauzate de modificari in componenta
microbiomului.
ntre microorganismele unui biotop se
pot stabili relaii:
I. Indiferente (neutralism)
II. Favorabile (comensalism/satelitism,
simbioz/mutualism, sinergism)
III. Defavorabile (parazitism, antagonism)
Antagonism o specie inhib sau omoar
alt specie prin mecanisme specifice
sau nespecifice
Mi/o care manifest activitate inhibitoare
antagonist (A), mi/o care sufer concurent (C).
Antagonism nespecific:
- Antagonistul este mai activ, utiliznd nutrienii,
oxigenul
- Antagonistul produce metabolii toxici (acizi,
indol, H2S, amoniac, peroxid, etc)
Antagonism specific antagonistul produce
substane cu aciune specific (antibiotice,
bacteriocine) asupra unui sau mai multor
concureni.
Efectul aciunii unui antagonist asupra
concurentului poate fi bacteriostatic sau
bactericid (uneori bacteriolitic).
Utilizarea practic a antagonismului microbian:
1. Pentru depistarea mi/o produceni de
antibiotice (micete, actinomicete, bacterii)
2. Pentru obinerea produselor biologice
curative de origine microbian (probiotice,
eubiotice/sinbiotice): Lactobacterina,
Colibacterina, Bifidumbacterina, Bificol, etc
3. Crearea biocenozelor favorabile
organismului
Probioticele sunt preparate ce conin
bacterii vii sau substane de origine
microbian care, ntroduse pe cale natural,
manifest efecte benefice (fiziologice,
biochimice i imune) pentru organismul-
gazd prin stabilizarea i optimizarea
funciilor microflorei normale.
Prebioticele sunt preparate ce conin un
ingredient alimentar nedigerabil care
stimuleaz selectiv creterea i activitatea
unui numr limitat de bacterii rezidente ale
microflorei normale intestinale.
Sinbioticele/eubioticele sunt preparate
obinute n urma combinrii raionale dintre
probiotice i prebiotice.
METODELE DE STUDIU AL ANTAGONISMULUI
1. n mediu solid (metoda traneei)
antagonistul se nsmneaz n centrul cutiei,
concurenii perpendicular. Termostat 24h.
Aprecierea dup dimensiunea zonei de
inhibiie a creterii culturii concurentului.
2. n mediu semisolid I strat antagonistul, II
strat concurentul. Termostat 24h. Aprecierea
zon clar ntre straturi.
3. nsmnarea n mediu lichid (BP) a unui
numr egal de A i C. Dup 24 h de incubaie
se rensmneaz 0,1 ml pe placa cu geloz.
Se compar numrul coloniilor de A i C.
ANTIBIOTICE (AB) produse de origine
natural (microbian, animal sau
vegetal), derivai semi-sintetici sau
produse sintetice care inhib sau omoar
selectiv unele mi/o sau/i celule tumorale,
fr a exercita ca regul efecte toxice
asupra macroorganismului.
1929 Fleming descoper efectul
Penicillium asupra S. aureus
1940 elaborarea primului AB utilizabil in
vivo penicilina
1942 producerea industrial a
penicilinei
Clasificarea AB
I. Dup efectul asupra celulei
- Bacteriostatic (tetraciclina,
cloramfenicol)
- Bactericid (streptomicina, polimixina)
- Bacteriolitic (peniciline, cefalosporine)
II. Dup spectrul de aciune
- AB cu spectru restrns (ngust) de aciune
(AB anti-G+, anti-G-, anti-
tuberculoase, anti-micotice, anti-
tumorale, etc)
- AB cu spectru larg de aciune (G+ i G-)
III. Dup producent (origine)
1. De origine fungic (peniciline, cefalosporine,...)
2. Din actinomicete (aminoglicozide, macrolide,
cloramfenicol, etc)
3. De origine bacterian (bacitracina din Bacillus
subtilis, gramicidina din Bacillus brevis,
polimixina din Bacillus polymyxa)
4. De origine vegetal fitoncidele (alicina,
rafanina, imanina)
5. De origine animal (lizozimul din albu de ou,
ecmolina din oase de pete, eritrina din mas
eritrocitar, splenocitina din splin)
IV. Dup compoziia chimic (beta-lactamine,
macrolide, aminoglicozide, fenicoli, glicopeptide,
polipeptide, poliene, sulfamide, chinolone i
fluorochinolone, nitrofurani, etc)
Mecanismul de aciune al AB
Mecanismul de aciune al AB

1. AB CARE INHIB SINTEZA PERETELUI CELULAR


- Beta-lactamine (peniciline, cefalosporine). Inhib etapa final a
sintezei PC, fixndu-se de proteinele de legare a penicilinei
(PLP) din MC, care sunt enzime ce catalizeaz legturile ntre
catenele peptidice din PG (reacie de transpeptidare).
- Vancomicina, teicoplanina (previne incorporarea complexului
dizaharid-pentapeptid in catena de peptidoglican din peretele
celular, fixndu-se de componentul peptidic)
- Bacitracina (impiedic reciclarea moleculelor lipidice de
transport transmembranar bactoprenol )
- Fosfomicina (blocheaz piruviltransferaza, implicat n sinteza
acidului N-acetil muramic)
Efectul acestor AB este bactericid/litic, doar celulele metabolic active
sunt omorte. Nu afecteaz celulele eucariote (lipsa PG).
2. AB CU ACIUNE ASUPRA ME i A MCP
- AB polipeptidice (polimixina, colistina). Se
fixeaz pe fosfolipidele membranelor
bacteriene (n special ME la bacterii G-),
provocnd deformarea lor i devenind
permeabile. Efect bactericid.
- AB polienice (nistatina, levorina, amfotericina
B, ketoconazol, etc). Se fixeaz pe sterolii
MCP a micetelor, perturbnd respiraia i
dezorganiznd MCP (permeabilitate excesiv
i moartea celulei).
Aceste AB acioneaz i asupra celulelor inactive
metabolic. Relativ toxice, n special nefro.
3. AB CU ACIUNE ASUPRA RIBOZOMILOR
(inhibarea sintezei proteice)

Se leag de receptori specifici de pe subunitile 30S


sau 50S, perturbnd sinteza proteic (inhibiia
transpeptidazei, a translocaiei peptidelor, etc).
Rezult inhibiia sintezei proteice sau sinteza
proteinelor nefuncionale. Efectul este
bacteriostatic (aminozidele bactericid), doar
asupra celulelor active metabolic.
- 30S (aminoglicozide: streptomicina, kanamicina,
gentamicina, tobramicina, amikacina; tetracicline)
- 50S (cloramfenicol, triamfenicol; macrolide -
eritromicina, oleandomicina; lincosamide -
clindamicina, lincomicina).
4. AB CU ACIUNE ASUPRA ACIZILOR
NUCLEICI (inhibarea sintezei AN)

- Rifampicina inhib ARN-polimeraza ADN-


dependent. Rezult stoparea sintezei
ARNm
- Novobiocina, Chinolonele (acidul nalidixic,
ciprofloxacina, ofloxacina) blocheaz
activitatea topo-izomerazelor, intervenind n
conformaia ADN-ului (inhibiia replicrii
ADN). Efect bactericid.
- Sulfamidele i trimetoprimul perturb
sinteza acidului folic i folailor (cofactori
n sinteza AN). Activitate bacteriostatic.
Producerea AB
1. Metoda biologic
2. Metoda sintetic
3. Metoda semi-sintetic
Etapele metodei biologice:
1. Cultivarea tulpinilor-producente de AB (ex.:
Penicillium notatum, Actinomyces griseum,
etc) n mediu lichid adecvat
2. Extragerea AB
3. Purificarea i concentrarea AB
4. Controlul toxicitii
5. Determinarea activitii AB
Teixobactin este un antibiotic nou, activ contra
bacteriilor gram pozitive. Afecteaza bacteriile prin
legarea la niste precursori importanti pentru formarea
peretelui celular (lipidul II si lipidul III). Descoperirea
acestor molecule a fost publicata in ianuarie 2015 in
revista Nature.
Teixobactin a fost descoperit utilizand o metoda noua
de cultivare a bacteriilor in sol (iChip), ce a permis
cresterea unei bacterii necultivabile anterior, Eleftheria
terrae, care produce antibioticul. In studiul publicat a
fost demonstrat, ca teixobactin omoara Staphylococcus
aureus si Mycobacterium tuberculosis fara ca bacteriile
sa dezvolte rezistenta.

In January 2015, a collaboration of four institutes in the US and


Germany together with two pharmaceutical companies, reported
that they had isolated and characterized a new antibiotic, killing
"without detectable resistance. Teixobactin was discovered by
screening previously unculturable bacteria present in a sample
of soil from a grassy field in Maine, using the iChip (isolation
chip).
The multiple independent iChip culture cells in a block of plastic
are inoculated with soil diluted to deposit about one bacterium in
each cell, and then sealed with semi-permeable membranes.
The iChip is then planted in a box of the soil of origin. Nutrients
and growth factors diffusing from the ambient soil into each
culture cell through the membranes nurture growth of the
bacterium into a colony that is then self-sustaining in vitro. This
arrangement allows growth of only one species in some of the
cells.
Teixobactin is an inhibitor of cell wall synthesis that acts primarily by
binding to lipid II, a fatty molecule which is a precursor
to peptidoglycan. Lipid II is also targeted by the antibiotic vancomycin.
Binding of teixobactin to lipid precursors inhibits production of the
peptidoglycan layer, leading to lysis of vulnerable bacteria.
Activity
Teixobactin was reported to be potent in vitro against all gram-positive
bacteria tested, including Staphylococcus aureus and difficult-to-
treat enterococci, with Clostridium difficile and Bacillus anthracis being
exceptionally vulnerable. It also killed Mycobacterium tuberculosis. It
was also found to be effective in vivo, when used to treat mice infected
with methicillin-resistant S. aureus (MRSA), and Streptococcus
pneumoniae. The dose required to achieve 50% survival against
MRSA is only 10% of the PD50 dose of vancomycin, an antibiotic
typically used for MRSA.
It is not active against bacteria with an outer membrane such as gram
negative pathogens, particularly carbapenem resistant
enterobacteriaceae, or those with New Delhi metallo-beta-lactamase
1 (NDM1).
The Isolation chip (or ichip) is a method of culturing
bacteria. Using regular methods, 99% of bacterial
species are not able to be cultured as they do not grow
in conditions made in a laboratory, called the "Great
Plate Count Anomaly". The ichip instead cultures
bacterial species within its soil environment. The soil is
diluted in molten agar and nutrients such that only a
single cell, on average, grows in the ichip's small
compartments or wells, hence the term "isolation". The
chip is then enclosed in a semipermeable plastic
membrane and buried back in the dirt to allow in
nutrients not available in the lab. With this culturing
method, about 50 to 60 percent of bacterial species are
able to survive.
Notably, the bacterial species Eleftheria terrae,
which makes the antibiotic Teixobactin that has
shown promise against many drug-resistant
strains like Methicillin-resistant Staphylococcus
aureus, was discovered using the ichip in 2015.
In addition to antibiotics, it is argued that anti-
cancer agents, anti-inflammatory and
immunosuppressives (which have previously
been discovered from bacteria) as well as
potential energy sources could be
discovered. The ichip was disovered by the drug
discovery company NovoBiotic Pharmaceuticals,
founded by Kim Lewis and Slava Epstein.
-
.

,
. ,

. ,

,

- ,
.
,
, .
-
,
, - ,
.

.

,

,
-.

,
,

.
Activitatea AB se msoar n uniti de mas
(g, mg, g) sau de aciune (UA).
1 UA cantitatea minim de AB care inhib
creterea unei tulpini de referin n condiii
standarde.
Penicilina 1UA = 0,6 g de substan pur
Cerinele fa de AB:
- Toxicitate selectiv
- Efect terapeutic cu doze minime
- Activitate de lung durat
- Spectru restrns de aciune
- S fie solubile i absorbite uor
- S nu provoace efecte secundare
- S nu se dezvolte rezistena contra AB
- S fie ieftine
Sensibilitatea microbilor la AB
n funcie de rezultatele clinice, bacteriile se
divizeaz n 3 clase: sensibile la AB (S),
rezistente (R) i intermediare (I, moderat
sensibile).
Tulpinile S efectul terapeutic este obinut cu
doze terapeutice uzuale
Tulpinile R efectul terapeutic nu poate fi
obinut cu doze terapeutice
Tulpinile I succesul terapeutic este
imprevizibil. Ar fi posibil cu doze mari sau la
administrarea local a AB.
Fiecare tulpin izolat manifest sensibilitate
particular. Ea poate fi studiat n laborator pentru
determinarea profilului de sensibiliti al acestei
tulpini, ceea ce constituie o antibiogram.
Prin antibiograma se intelege testarea sensibilitatii
unei tulpini bacteriene izolate dintr-un produs
patologic fata de diverse antibiotice.
Rezultatele testelor de sensibilitate permit medicului
s claseze tulpinile bacteriene dup categoriile
terapeutice (S, R, I) tratament corect, monitoring-
ul apariiei i evoluiei rezistenei la acest AB, uneori
sunt utile n identificarea tulpinilor.
Testarea sensibilitii bacteriilor la AB
Metoda difuzimetric (discurilor, rondelelor) Kirby
Bauer. Calitativ, utilizat uzual n infecii banale.
Condiii: mediu standard, concentraie standard de
mi/o (105/ml), rondele/discuri (comprimate) cu %
standarde de AB, condiii standarde.
Mediul este inoculat cu suspensia bacterian. Dup
uscare n termostat se aplic rondelele cu pensa
sau cu dispersor automat de discuri 24h, 37C.
In jurul acestora se va realiza un gradient de
concentratie prin difuziunea locala a antibioticului
(in imediata vecinatate a discului realizindu-se o
concentratie mai mare de antibiotic care descreste
pe masura indepartarii de acesta).
Citirea se msoar diametrul zonei de inhibiie a creterii culturii
bacteriene.
Interpretarea Sensibil (S), Rezistent (R), Intermediar (I) n funcie
de valorile din tabelele de interpretare.
Metoda diluiilor (cantitativa)
ntr-un ir de tuburi cu 1 ml BP se efectueaz
diluia AB (256 UA, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2,
1, 0,5, etc). Se adaug n fiecare tub (cu
excepia celui martor) 0,1 ml de suspensie
bacterian 105/ml. Termostat - 24h.
Lectura cea mai mic doz de AB care
inhib creterea culturii dup 24h de
incubare (mediu clar) constituie
Concentraia Minim de Inhibiie (CMI) a
AB pentru tulpina testat.
CMI msoar efectul bacteriostatic.
Concentraia Minim Bactericid (CMB)

cantitatea minim de AB care omoar 99,9% din


inoculum dup 18h de incubare.
Determinarea CMB din ultimele tuburi fr
cretere se repic 0,1 ml de mediu pe placa cu
geloz. Dup 18-24h se compar numrul
celulelor ce au supravieuit cu nr iniial de bacterii
(105/ml).
Testarea CMI / CMB este indicat n tratamentul
infeciilor grave - meningite, septicemii,
endocardite, infecii cronice sau la persoane cu
imunosupresie, testarea bacteriilor cu cultivare
lent
Activitatea antibacterian in vitro a unui AB,
analizat izolat, nu garanteaz eficiena sa
in vivo
n studii in vitro parametrii (densitatea
suspensiei bacteriene, concentraia AB, etc)
nu se modific n timp. In vivo, la pacieni,
concentraia AB variaz n timp i n funcie
de coeficientul de difuzie al AB in esut.
Numai luarea n considerare concomitent a
aspectelor bacteriologic i farmacocinetic
(farmacodinamia antibioticelor) va
permite predicia eficienei bacterio-clinice
a AB.
n plan bacteriologic, elementul fundamental
al relaiei antibiotic-bacterie este
concentraia minim inhibitorie (CMI) a
antibioticului asupra bacteriei (studii in
vitro).
n plan farmacocinetic, prezint importan
concentraiile serice sau tisulare ale
antibioticelor (determinate in vivo).
Concentraiile critice sunt stabilite pe baza
concentraiilor serice/tisulare obinute dup
administrarea unei posologii uzuale i a
posologiei maximum tolerate. n primul caz
este vorba despre concentraia critic
inferioar (c), n al doilea caz - despre
concentraia critic superioar (C).
Fiecare AB are propriile concentraii critice
(terapeutice)
O tulpin izolat, pentru care CMI este
inferioar sau egal cu c este sensibil la AB n
cauz (efect terapeutic posibil cu doze uzuale).
Dac CMI-ul este situat ntre valorile c i C
(c<CMI<C), tulpina este intermediar (efect
terapeutic imprevizibil).
Dac CMI este mai mare dect C, tulpina este
rezistent (efect terapeutic imposibil).
Testarea automatizata a sensibilitatii
Rezistena mi/o la antibiotice
Cauzele:
1. Factori genetici, proprii bacteriilor
2. Factori ce favorizeaz selecia i difuzarea
tulpinilor bacteriene rezistente
Tipurile de rezisten:
1. Natural, ereditar, de specie, prezent la toi
membrii unei specii sau gen
- lipsa intei ex.: micoplasme, micete;
- imposibilitatea de a atinge inta ex.:
Mycobacterium (cerurile, lipidele mpiedic
ptrunderea AB n citoplasm);
- bacteriile nu efectueaz procesul inhibat de AB
ex.: acidul folic este preluat din mediu
rezisten la sulfamide
2. Achiziionat, dobndit, afecteaz tulpinile unei specii
sensibile. Depinde de aciunea de selecie exercitat de AB
utilizate n tratament, urmat de rspndirea ei (ntre bacterii,
interuman, transmisie de origine animal).
Mecanismele rezistenei dobndite:
- Diminuarea permeabilitii membranare

- Modificarea intei moleculare

- Eliminarea excesiv a AB

- Inactivarea enzimatic a AB, care poate fi


hidrolizat (penicilinaz, cefalosporinaz)
sau modificat structural (acetilaze,
adenilaze, fosforilaze), etc.
Rezistena dobndit se poate manifesta fenotipic
(bacteriile n faza de repaos, formele L de
bacterii) sau genetic (genotipic)
Rezistena genetic poate fi achiziionat n urma:
- Mutaiilor (rezisten cromozomial) - 10%
Mecanisme: modificarea intei moleculare,
diminuarea permeabilitii membranare
- Transferului de material genetic, realizat prin
transfer de gene (conjugare prin intermediul
plasmidelor R (poate fi rezisten multipl),
transducie bacteriofagi, transformare)
Mecanisme: inactivarea enzimatic, modificarea
intei, substituia sau supraproducia intei, excreie
excesiv a AB.
Prevenirea rezistenei
1. Supravegherea epidemiologic a tulpinilor
rezistente
2. Politic strict de prescriere a AB
3. Respectarea dozelor terapeutice corecte i a
timpului de tratament necesar
4. Asocierea AB cu mecanisme de aciune diferite
5. Prescrierea AB care nu sunt sensibile la beta-
lactamaze, utiliznd inhibitori (acidul clavulanic,
sulbactamul, tazobactamul). Ex.: augmentina
amoxicilina+acid clavulanic
6. Reciclarea AB
7. Producerea AB noi
Efectele negative ale antibioticoterapiei
1. Efect toxic (streptomicina surditate,
cloramfenicolul toxic pentru mduva
osoas, polipeptidele nefrotoxice, etc)
2. Efect teratogen

3. Aciune sensibilizant (penicilina, etc)

4. Disbacterioz

5. Dereglarea imunogenezei

6. Selecia tulpinilor rezistente


Bacteriocinele substane proteice
bactericide produse de numeroase specii
bacteriene i active asupra altor tulpini ale
aceeai specii sau asupra speciilor
nrudite. Producerea bacteriocinelor este
determinat plasmidic (plasmide Col).
Tipuri de bactericine: colicine (secretate de
Escherichia coli), corinecine
(Corynebacterium), vibriocine (Vibrio),
piocine (Pseudomonas), etc.
Studiul sensibilitii unei tulpini la
bacteriocine (bacteriocinotipia) se
utilizeaz n scopuri epidemiologice