TEMA 10

Cultivo y aislamiento de
patgenos viables
Tema 10. Cultivo y aislamiento de patgenos viables

1. Medios de cultivo
2. Preparacin de medios de cultivo artificiales
3. Condiciones para el aislamiento de patgenos
1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxgeno
1. Incubacin de microorganismos microaerfilos y
capnfilos
2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura
3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo
de incubacin
4. Medios artificiales
1. Ejemplos de medios de aislamiento primario
1. Agar infusin de cerebro y corazn (BHIA)
2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)
2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento
1. Caldo selenito
3. Ejemplos de medios enriquecidos
1. Agar sangre
4. Ejemplos de medios diferenciales
1. Agar de MacConkey
2. Agar salino manitol (SM)
Tema 10. Cultivo y aislamiento de patgenos viables

4. Medios artificiales (continuacin)

5. Ejemplos de medios selectivos
1. Agentes inhibidores
2. Agar entrico de Hektoen (HE)
3. Agar alcohol fenil etlico (PEA)
6. Medios cromognicos
5. Recuento de patgenos
1. Mediante la tcnica de estra en placa
2. Mediante la utilizacin de asa calibrada
6. Cultivo de patgenos intracelulares obligados
1. Medios de cultivo

Regla de oro de la Microbiologa

Cultivo y
aislamiento de
Identificacin
microorganismos
Muestra Cultivo puro

Realizacin
pruebas
susceptibilidad

Etapa limitante en la rapidez del

diagnstico microbiolgico
1. Medios de cultivo

Qu es un medio de cultivo?
2. Preparacin de medios de cultivo artificiales

Preparacin
Esterilizacin
Autoclave
Tindalizacin
Filtracin
Luz UV
Horno a 180 C
xido de etileno
Adicin de
sustancias
termolbiles

Vertido en placas de Petri

(medios slidos) o tubos
(medios lquidos o medios
slidos)
3. Condiciones para el aislamiento de patgenos

Medio de cultivo

No exigentes: nutrientes (C, N, S, P), sales, tampn.

Exigentes: nutrientes ms sustancias complejas (sangre, suero,
huevo, patata, factor X, factor V, vitaminas).

Condiciones de incubacin

Atmsfera

Temperatura

Humedad

Tiempo de incubacin

pH

Ausencia de factores inhibidores o antagonistas del crecimiento

1. Comportamiento de los microorganismos frente al oxgeno

Aerobios

Anaerobios facultativos

Anaerobios

Microaerfilos

Frascos con vela

Agar semislido

Capnfilos
Atmsfera de CO2
Sistemas GasPak, Bio Bag
(bicarbonato y cidos)
Utilizacin de estufas de CO2
Crecimiento
A: Aerobios obligados
B: Microaerfilos
C: Anaerobios facultativos
D: Anaerobios estrictos
3.1.1. Incubacin de microorganismos microaerfilos y capnfilos
2. Comportamiento de los microorganismos frente a la temperatura

Temperatura de incubacin

35-37 C

30 C
Otras temperaturas

Elevadas (42 C)

Bajas (4C) enriquecimiento en fro

Intermedias (22 C)

3. Comportamiento de los microorganismos frente al pH. Tiempo de incubacin.

pH

Tiempo de incubacin
4. Medios artificiales

Medios de aislamiento primario (medios de crecimiento o medios nutritivos)

Medios enriquecidos

Caldos de enriquecimiento

Medios diferenciales

Medios selectivos

Medios cromognicos
4.1. Ejemplos de medios de aislamiento primario

Agar nutritivo

Agar infusin de cerebro y corazn (BHIA)

Agar triptona soja (TSA)

Agar sangre

Agar chocolate

Agar CLED (urocultivo)

Caldo con carne picada

4.1.1. Agar infusin de cerebro y corazn (BHIA)

Componentes Cantidad Propiedad

Extracto de cerebro 7,8 g/L Fuente de nutrientes
Extracto de corazn 9,7 g/L Fuente de nutrientes
Peptona 10 g/L Fuente de protenas
Glucosa 2 g/L Hidrato de carbono
Tampn fosfato 2,5 g/L Regulacin pH
NaCl 5 g/L Estabilizador osmtico
Agar 15 g/L Agente solidificante

Medio rico, no selectivo, permite crecimiento

de la mayora de microorganismos no exigentes.

Ausencia de agentes inhibidores.

4.1.2. Agar CLED (cistina, lactosa, deficiente en electrolitos)

Componentes Cantidad

Digerido pancretico de gelatina 4 g/L

Digerido pancretico de casena 4 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Lactosa 10 g/L
L-cistina 0,128 g/L
Azul de Bromotimol 0,02 g/L
Agar 15 g/L

La lactosa es el nico carbohidrato presente. Permite diferenciar los

fermentadores de lactosa de los no fermentadores gracias a la presencia
del indicador azul de bromotimol que vira a color amarillo a pH cido.

Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de

Proteus invadan la placa de cultivo, lo que facilita el recuento.

La cistina facilita el crecimiento de los coliformes.

4.2. Ejemplos de caldos de enriquecimiento

Caldo selenito Salmonella

Caldo tetrationato Salmonella y Shigella

Caldo para Gram negativos Salmonella y Shigella

Se debe subcultivar en medios ms selectivos al cabo de unas horas

4.2.1. Caldo selenito

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 5 g/L Fuente de protenas
Lactosa 4 g/L Fuente de carbono

Selenito de sodio 4 g/L Agente inhibidor de la mayora de

enterobacterias, incluyendo muchas
especies de Shigella
Fosfato de sodio 10 g/L Tampn

Enriquecimiento de especies de Salmonella en muestras de heces, aguas

fecales, etc.
Subcultivar al cabo de 8-12 horas en medio ms selectivo (Agar SS o
Agar sulfito de bismuto).
3. Ejemplo de medios enriquecidos
1. Agar sangre

Agar base de Columbia + 5% sangre desfibrinada

Componentes Cantidad

Peptona 5 g/L
Triptena 12 g/L
Extracto de levadura 3 g/L
Extracto de corazn (buey) 3 g/L
Almidn soluble 1 g/L
Cloruro sdico 5 g/L
Agar 15 g/L

Medio rico y diferencial.

La sangre ms comnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estril y desfibrinada.

Una vez preparado el medio de cultivo, se enfra hasta 45C y se le aade la

sangre.
4.3.1. Agar sangre

CARACTERSTICAS DE LA BETA YALFA HEMLISIS

Lisis completa de los glbulos rojos

Beta hemlisis Halo transparente alrededor de la colonia

Lisis parcial de los glbulos rojos

Se abren poros en la membrana
Alfa hemlisis Salida de hemoglobina al medio
Oxidacin del grupo hemo
Formacin de biliverdina (color verdoso)
Halo verdoso alrededor de la colonia

4.4. Ejemplos de medios diferenciales

Agar sangre

Agar CLED

Agar EMB

Agar de MacConkey

Agar SS

Agar entrico de Hektoen (HE)

Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Agar salino manitol (SM)

4.4.1. Agar de MacConkey

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 17 g/L Fuente de protenas
Polipeptona 3 g/L Fuente de protenas
Lactosa 10 g/L Azcar fermentable
Sales biliares (conc. moderada) 1,5 g/L Inhibidor de Gram positivos
Cristal violeta 0,001 g/L Inhibidor de Gram positivos
NaCl 5 g/L Estabilizador osmtico
Rojo neutro 0,03 g/L Indicador de pH
Agar 13,5 g/L Agente solidificante

Aislamiento y diferenciacin de bacilos entricos Gram negativos fermentadores

y no fermentadores de la lactosa.
4.4.1. Agar de MacConkey
Colonias rojas/rosa
Fermentadores de lactosa

No patgenos (E. coli, Citrobacter)

Patgenos (Klebsiella,
Enterobacter)

Colonias transparentes/blancas
No fermentan la lactosa

Patgenos (Salmonella, Shigella,

Yersinia, Proteus)

Precipitacin en el medio
Fermentadores fuertes de lactosa
(E. coli, Enterobacter)
4.4.2. Agar salino manitol (SM)

Medio de Chapman

Componentes Cantidad

Extracto de levadura 2,5 g/L

Triptona 10 g/L
Gelatina 30 g/L
Lactosa 2 g/L
Manitol 10 g/L
Cloruro sdico 75 g/L
Fosfato dipotsico 5 g/L
Rojo fenol 0,025 g/L
Agar 15 g/L

Se pueden distinguir los estafilococos que fermentan el manitol de los que no

lo fermentan gracias al rojo fenol que vira a color amarillo en medio cido.

La mayora de los microorganismos no crecen a una concentracin de cloruro

sdico del 7,5%, mientras que los estafilococos s lo hacen.
4.5. Ejemplos de medios selectivos

Moderadamente selectivos
MacConkey Enterobacterias
EMB Enterobacterias

Altamente selectivos

Agar salino manitol Staphylococcus

Agar SS Salmonella y Shigella

Agar entrico de Hektoen (HE) Salmonella y Shigella

Agar sulfito de bismuto Salmonella y Shigella

Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) Salmonella y Shigella

Agar alcohol fenil etlico (PEA) Gram positivos

4.5.1. Agentes inhibidores

Colorantes (azul de metileno, cristal violeta, verde brillante, eosina)

Antibiticos

Metales (Se, Bi)

Sales biliares

Azida

Alcoholes (alcohol feniletlico)

Sales (cloruro sdico a alta concentracin)

4.5.2. Agar entrico de Hektoen (HE)

Componentes Cantidad Propiedad

Peptona 12 g/L Fuente de C y N
Extracto de levadura 3 g/L Fuente de N
Sales biliares (alta conc.) 9 g/L Inhibidor de Gram positivos
Lactosa 12 g/L Azcar fermentable
Sacarosa 12 g/L Azcar fermentable
NaCl 5 g/L Estabilizador osmtico
Tiosulfato de sodio 5 g/L Fuente de azufre
Citrato frrico amnico 1,5 g/L Fuente de hierro
Azul de timol 0,04 g/L Indicador de pH
Agar 14 g/L Agente solidificante

Aislamiento y diferenciacin de especies de Salmonella y Shigella de otros

bacilos entricos Gram negativos en muestras fecales.
4.5.2. Agar entrico de Hektoen (HE)

Las colonias de los fermentadores de lactosa (E. coli, Klebsiella, Enterobacter) se

ven de color amarillo-naranja. Las de los no fermentadores se ven incoloras.
Salmonella tiene un punto negro central por la produccin de sulfhdrico
(sulfuro de hierro precipitado). La mayora de las especies de Shigella no
producen sulfhdrico.
4.5.3. Agar Alcohol Feniletlico (PEA)
Componentes Cantidad Propiedad
Extracto de carne 3 g/L Fuente de C y N
Triptosa 10 g/L Fuente de N
Feniletanol 2,5 g/L Inhibidor de Gram negativos
Cloruro de sodio 5 g/L Estabilizador osmtico
Agar 15 g/L Agente solidificante

Aislamiento de microorganismos Gram positivos, especialmente estafilococos y

estreptococos, a partir de diversas muestras con microbiota mixta.
La adicin de alcohol fenil etlico inhibe o reduce drsticamente el crecimiento de
bacterias Gram negativas porque inhibe la sntesis de ADN. Adems, previene la
proliferacin de colonias invasivas tipo swarming.
El alcohol fenil etlico es un antimicrobiano, antisptico y desinfectante que
tambin se utiliza como esencia aromtica y preservativo en farmacia y
perfumera.
Las placas de este medio recin preparadas huelen a rosas.
4.5.3. Agar Alcohol Feniletlico (PEA)

Cuando a este medio se le adiciona sangre de oveja al 5%, se convierte en un

excelente medio para el aislamiento de bacterias anaerobias presentes en
muestras clnicas donde hay una microbiota abundante y heterognea que
contiene bacterias Gram negativas de crecimiento rpido tal como Proteus.
4.6. Medios cromognicos

Medios altamente selectivos y diferenciales.

Incorporan sustratos incoloros que se
transforman en productos con color
(cromognicos) tras actuar sobre ellos una
enzima especfica.
Deteccin de actividades enzimticas
caractersticas de determinados gneros o
especies de bacterias.
- galactosidasa
- glucosidasa
- glucuronidasa

La produccin de un color caracterstico permite la identificacin.

- galactosidasa
ONPG ONP + galactosa

Incoloro Amarillo
4.6. Medios cromognicos

Ejemplos de medios cromognicos

Agar CPS-ID3

Chromogenic UTI

CHROMAgar Orientation

URI Select 4
5. Recuento de patgenos
1. Mediante la tcnica de estra en placa

Estimacin del nmero de

microorganismos en la
muestra original en funcin
del crecimiento:
Escaso
Moderado
Abundante
5.2. Mediante la utilizacin de asa calibrada
6. Cultivo de patgenos intracelulares obligados

Crecen slo dentro de clulas (clamidias, ricketsias, virus)

No se ha encontrado un medio completamente artificial para su desarrollo

Legionella pneumophila (Agar BCYE)

Cultivos de tejidos en el laboratorio

Cultivos primarios (n cromosomas=2n)

Clulas de rin
Fibroblastos
Lneas celulares continuas (aberraciones en el n de cromosomas,
aneuploida)
Hep-2, HeLa, Vero (Virus, ensayos de toxicidad Clostridium difficile)
McCoy (Clamidias)
A-549, RD, MDCK (Virus)
6. Cultivo de patgenos intracelulares obligados