SEMINARIO 1

BIOLOGA CELULAR

ORGANIZACIN ESTRUCTURAL Y
MOLECULAR DE LA CLULA
MICROSCOPIA Y METODOS DE
ESTUDIO DE LA CLULA
 Los seres vivos presentan una gran diversidad...
...incluso dentro del Reino Animal....
Escherichia coli
...y dentro de los Vertebrados Fuji velvia

Gallus gallus

Ginkgo biloba Xenopus laevis

Agaricus campestris

Homo sapiens

Argiope lobata
Trypanosoma cruzi
 Teora celular
(Schleiden y Schwann, 1839)

La clula es la estructura ms simple que posee las

propiedades que caracterizan a los seres vivos

Son capaces de extraer, transformar y utilizar

la materia y la energa almacenada en las
molculas que se encuentran en su entorno
Todos los seres vivos estn formados por una o ms
(metabolismo)
clulas
Pueden reproducirse y autoensamblarse,
generando copias de s mismos
 Niveles
SUB-ATMICO de organizacin de la materia

ATMICO
Las propiedades de los seres vivos resultan
C
de una serie de niveles
En de organizacin
cada nivel aparecen nuevas
O MOLECULAR
integrados
propiedades (propiedades
M
P MACROMOLECULAR emergentes), que constituyen un
L MACROMOLECULAR salto cualitativo respecto del nivel
E COMPLEJO anterior
J
I CELULAR
En ese sentido, entendemos a la
D TISULAR vida biolgica como un conjunto de
A
propiedades emergentes a partir
D RGANOS
del nivel de organizacin celular.
SISTEMAS DE
RGANOS ...
 SUB-ATMICO Las
...por
estructuras
eso se utilizan
de loslas
niveles
siguientes
ms bajos
tienen
unidadesdimensiones
mtricas...muy pequeas....
ATMICO
C
O MOLECULAR
1 10-10 m
M
P MACROMOLECULAR
L MACROMOLECULAR 1 nm 10-9 m
E COMPLEJO
J
I CELULAR
1 m 10-6 m
D TISULAR
A
D RGANOS 1 mm 10-3 m
SISTEMAS DE
RGANOS ...
Nivel de Organizacin Celular
 El estudio de las clulas
ncleo
nucleolo
membrana plasmtica

REG

mitocondria
Aparato de Golgi
REL

Ultraestructura: Microscopa electrnica

 Procarionte Eucarionte
Ncleo Ausente Presente

Citoesqueleto Ausente Presente

Sistema de Ausente Presente

Endomembranas
Dimetro < 1m 10-100 m
ADN Circular-Desnudo Con histonas
Cromosomas Varias copias de un Distinto nmero de
cromosoma cromosomas/especie
Endocits- Exocitocis Ausente Presente
Presente Slo en plantas
Pared Celular (Celulosa) y Hongos
(Quitina)

Ribosomas 70S (30S+50S) 80S (40S y 60S)

 Dado que las dimensiones de la mayora de las
clulas y de todos los organoides estn por debajo
del lmite de resolucin del ojo humano, es necesario
emplear instrumentos para su visualizacin.
El microscopio ptico nos permite ver las clulas y
tejidos (LR= 0,25 um)
El microscopio electrnico nos permite estudiar la
ultraestructura de las clulas (ej. visualizar
membranas, organoides, inclusiones y detalles de
todos ellos).(LR=2 a 5 Angstroms)
Unidades de medida que se utilizaran en el curso:

1 mm = 1000 m ( m : micrmetro)
1 m = 1000 nm ( nm : nanmetro)
1nm = 10 ( : Angstrom )

El microscopio ptico se basa en la utilizacin de la luz

visible
 Luz blanca
Distintas longitudes de onda
Ondas electromagnticas
Se desva en su trayecto al pasar por
medios de distinto ndice de refraccin
Al pasar por compuestos coloreados son
absorbidos determinados rayos
Partes del microscopio

Estativo Pie
Brazo
Platina
Tubo

Parte ptica : Espejo Aparato de

Condensador Iluminacin
Diafragma

Objetivo
Ocular
 Marcha de rayos

Lado de la lente donde se

Lado de la lente donde forma la imagen
se ubica el objeto
Centro de la lente
Distancia Focal
Punto focal Eje ptico
objeto Imagen

Punto focal
objeto

Lente biconvexa
 Lente objetivo

Objeto a una distancia

mayor que la distancia focal
La imagen :
se forma por interseccin de rayos: por
Formacin de la imagen eso es real
en el objetivo: Tambin es invertida
Algunos principios de ptica
1) Todo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva al atravesarla
2)Todo rayo que corre paralelo al eje ptico
Cuando atraviesa la lente pasa por el punto focal
imagen
3) Todo rayo que pasa por el punto focal objeto
Cuando atraviesa la lente corre paralelo al eje
ptico
* Puede considerarse esta lente como el objetivo del microscopio
(en realidad son varias lentes) .

*La flecha verde(objeto) es equivalente a una estructura del preparado.

*La lente objetivo tiene distancias focales menores que las distancias
Focales del ocular

Entonces .....
 La imagen de la lente objetivo
cae dentro de la distancia objeto
focal del . ocular

Lente
objetivo
Lente ocular

Formacin de la imagen del ocular:

La imagen se forma por 1) Todo rayo que pasa por el centro de la lente no se desva al
proyeccin de rayos: atravesarla
por eso es virtual 2)Todo rayo que corre paralelo al eje ptico
Cuando atraviesa la lente pasa por el punto focal imagen.

3)Para obtener la imagen deben proyectarse los rayos

Lente
objetivo
Lente ocular

La imagen es mayor, virtual e invertida

 Clculo del aumento
El aumento o magnificacin se obtiene
multiplicando la magnificacin del objetivo por
la del ocular.
Ejemplos:
Ocular y objetivo seco dbil.: 10X multiplico
por 10X= 100X.
Ocular y objetivo seco fuerte: 10X multiplico
por 40X= 400X.
Ocular y objetivo de inmersin: 10X multiplico
por 100X= 1000X.
Lmite de resolucin (LR)
Es la distancia mnima que debe haber entre dos puntos de un
objeto para que se visualicen como separados

El LR del ojo humano es de 0,1mm

Si estos dos puntos estn separados por una

distancia menor de 0,1 mm se vern como
un solo punto
D
Indice de refraccin (IR) de un medio:

Relacin entre la velocidad de la luz en un determinado medio

EJ : vidrio) y la velocidad de la luz en el vaco.

Cuando un rayo luminoso

pasa de un medio de menor
VIDRIO IR a uno de mayor IR se
aproxima a la lnea normal

AIRE
 Cuando un rayo luminoso pasa
de un medio de mayor IR a uno
AIRE de menor IR se aleja de la lnea
normal
VIDRIO
Lmite de Resolucin (LR) del microscopio ptico
Depende de
* la longitud de onda utilizada ()
* el ndice de refraccin del medio (n) que se encuentra entre la lente
objetivo y el preparado (n)

0.61 x 0,61 X
LR = =
n x sen
AN
AN : Apertura numrica
Objetivo
n.: .ndice de refraccin del aire = 1
(que est entre el preparado y la lente objetivo)
longitud de onda (Luz blanca:550 nm)
= semingulo de apertura.

Preparado

LR = 0,25m (microscopio Optico )

La frmula de LR tiene un significado fsico:
Seala: 1) El LR es directamente proporcional a
La (a mayor implica mayor LR y a menor
Menor LR).
2) El LR es inversamente proporcional a
La AN que depende del n (ndice de refraccin
Del medio) (a mayor n implica menor LR y a
Menor n implica mayor LR)
Poder de resolucin(PR) : es el poder tiene un microscopio de
Resolver dos puntos cercanos del objeto como diferentes

Como concepto:
Poder de resolucin es la inversamente proporcional al Limite de resolucin

Es decir, a mayor LR implica menor PR y a menor LR implica

Mayor PR.
Pero :
no se puede calcular el PR invirtiendo la frmula matemtica!
 Cmo se puede mejorar el Poder Resolutivo del MO?

Se logra un mayor PR si se obtiene un menor LR. Para ello:

0.61 X : Utilizando filtro azul
LR = 1)
n x sen
se aproxima
a los 400 nm
Objetivo
Este rayo no contribuye
a formar la imagen
2)
n
Aire n=1

Objetivo
Utilizando aceite de inmersin
n =1.52

Aceite de inmersin
El rayo entra dentro de la lente
objetivo y contribuye en la
formacin de la imagen
Hepatocitos observados con el MO. Tcnica de H&E.
Epitelio intestinal observado con el MO. Tcnica de coloracin
H&E.
Tipo de Microscopios pticos segn
el nmero de oculares

Monoculares
Binoculares
Trinoculares (generalmente el tercer ocular
es para adaptar una cmara fotogrfica, de
video o una salida de seal que puede ir a
un Analizador de Imgenes.
Tipos de microscopios pticos segn
iluminacin:
Campo claro
Campo oscuro
Luz polarizada
Contraste de fase
Contraste diferencial de interferencia (Optica
Nomarsky)
Fluorescencia
Confocal
Invertido.
De proyeccin.
 Microscopio de campo oscuro
Se ilumina el objeto de forma oblicua usando un condensador
especial. Slo la luz que impacta oblicuamente al objeto entra
al objetivo.
Empleo de objetivos de baja AN (<1.1)
Permite visualizar objetos que pueden ser de dimensin menor
que la resolucin que corresponde a la AN si la intensidad de
luz es elevada.
El objeto se ve brillante sobre fondo oscuro.
Se ven contornos o bordes, no se ve estructura interna.
Sirven para ver objetos que con campo claro no se ven por
falta de contraste.
Ventaja: Pueden distinguirse, aunque no resolverse, estructuras
que no se distinguen con el MO comn. Pueden visualizarse
clulas vivas
 Microscopio de contraste de fase

Convierte las cambios de fase en variaciones de intensidad.

Diafragma anular y placa de fase en el objetivo (anillo

transparente).

Imagen intermedia formada por interferencia de todos los rayos

1/2 long onda de dif: anula 1 long onda de dif: suma

Ventaja: estudio de clulas vivas.

 Microscopio de interferencia

- Se hacen visibles las diferencias de velocidad que sufren los

rayos luminosos al atravesar un objeto transparente: como
diferencias de intensidad o de coloracin.
- Aspecto de relieve.
- Luz blanca polarizada (polarizador).
- Divisin del rayo en dos haces paralelos (prisma de cuarzo)
- Colector de rayos
- Analizador
- Interferencia entre ambos haces: diferencias de fase se
convierten en diferencias de intensidad y cambios de color
- Ventajas: las del microscopio de contraste de fase y se
puede cuantificar el espesor del corte y cambios en el ndice
de refraccin
 Microscopio de polarizacin
Consta de:
Un polarizador: est debajo del condensador.
Un analizador: Encima de las lentes objetivos.
Cuando estos estn cruzados no hay transmisin de luz
polarizada.

Rotar el objeto para encontrar el brillo mximo o mnimo.

fibras colgenas, fibras musculares estriadas, mielina,
cristales
 Propiedades de la fluorescencia
Las molculas fluorescentes absorben la luz de
una determinada longitud de onda y emiten luz de
otra longitud de onda ms larga. Si un componente
de este tipo es iluminado a su longitud de onda
absorbente y visualizado a travs de un filtro que
slo permita pasar la luz de longitud de onda igual
a la de la luz emitida, el componente aparece
brillante sobre un fondo oscuro. La intensidad y el
color de la luz es una propiedad caracterstica de la
molcula fluorescente utilizada
 Microscopio confocal
Permite que slo observemos el plano que
est situado en el punto de foco del sistema
ptico eliminando, de forma ptica a travs
de un diafragma o "pinhole", la luz
proveniente de los planos que estn fuera de
foco. Este principio fu descrito por Minsky
en los aos 50, pero es a partir de los 80
cuando se empieza a extender su uso.
Microfotografamitocondias
electrnica
Ultraestructura: nucleolo
ncleo
REG de un hepatocito
Microscopa electrnica
 El estudio de las clulas
ncleo
nucleolo
membrana plasmtica

REG

mitocondria
Aparato de Golgi
REL
La mayora de los estudios sobre la fisiologa celular
requieren para su anlisis el aislamiento
Fraccionamiento del componente
subcelular
celular a ser analizado
 Fraccionamiento subcelular
ETAPAS

1- Ruptura de las clulas

Homogenizadores. Se rompen las clulas

con la ayuda de un mbolo rotatorio
Conjunto de mtodos ncleos
que se
y tcnicas que tienen como objetivo
ajusta perfectamente a las gruesas paredes de
unobtener fracciones
tubo de cristal puras o enriquecidas
especial. mitocondriasde un determinado
componente celular.
microsomas
Sonicacin. Consiste en la aplicacin de
ultrasonidos a una suspensin celular. La
ribosomas
intensa agitacin producida destruye las
membranas celulares.
citosol
homogenato celular
Uso de detergentes que solubilizan las
membranas celulares.
 Fraccionamiento subcelular
ETAPAS

2- Separacin de componentes

Centrifugacin

La separacin de partculas u
organelas que no presentan una
tendencia a sedimentar
espontneamente, requiere
aumentar la fuerza gravitatoria
a travs de la centrifugacin .

refrigeraci vaco
 Fraccionamiento subcelular
ETAPAS

2- Separacin de componentes

rotor
centrfuga
 Fraccionamiento subcelular
ETAPAS

2- Separacin de componentes

Centrifugacin diferencial

La velocidad de sedimentacin de cada partcula

Mediante centrifugaciones
sobrenadante es proporcional a suy tamao,
correlativas crecientes en
es proporcional a velocidad,
la densidadsedelogran
la partcula
aumenta al incrementarse la fuerza
separar los principales
gravitatoria
componentes celulares

sedimento o
pellet
 Fraccionamiento subcelular
por centrifugacin diferencial

1.000 g 20.000 g pellet:

10 20 mitocondrias,
lisosomas,
homogenato peroxisomas
pellet: clulas enteras,
ncleos.

80.000 g
1h

sobrenadante:
citosol 100.000 g
3h

pellet: pellet:
ribosomas, microsomas
grandes macromolculas
Gradiente de sacarosa
 Fraccionamiento subcelular
por centrifugacin diferencial

Cmo se confirma el xito de la tcnica?

Determinando actividades enzimticas

especficas de una organela

Verificando la morfologa mediante

microscopa electrnica