UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGA

MDICA
REA DE LABORATORIO CLNICO Y ANATOMA
PATOLGICA

Pastor Talledo, Ins de los Milagros

Ponce Jauregui, Csar Ricardo
Quispe Goithia, Rosa Zaninohga
 La tcnica del Western Blot (tambin llamado
inmunoblotting debido a que se utilizan
anticuerpos para detectar el antgeno o los
antgenos especficos de inters) fue descrita por
primera vez por Towbin et al. en 1979 y en la
actualidad es
tcnica de rutina en todos los laboratorios que
realizan anlisis de protenas. La especificidad de la
unin antgeno anticuerpo permite la deteccin de
una nica protena dentro de una mezcla compleja
de otras protenas.
En la actualidad se utiliza como criterio de
identificacin positivo de una protena especifica en
una mezcla compleja y para obtener datos
cualitativos y semicuantitativos sobre la misma.
Preparacin
Electroforesis en gel de
acrilamida
Transferencia de Protenas a la
Membrana
Hibridacin del Anticuerpo
Deteccin de Bandas
Una adecuada preparacin de la muestra es
esencial para tener xito en un ensayo de
Western Blot
Mtodos fsicos para la disrupcin de
muestras
Mtodo Descripcin Tipo de Muestra
Licuadora La muestra se tritura Gran cantidad de tejido
mediante cuchillas
rotatorias
Homogeneizador Tubo de vidrio con pistn Clulas Tisulares: til
Dounce ajustado maja las clulas para protocolos de
por accin de corte enriquecimiento de
protenas mitocondriales
Homogeneizador de Ondas de sonido emitidas Clulas, tejidos, bacterias
ultrasonido por una sonda para
romper las membranas
celulares
Pulverizacin en La muestra se pulveriza Tejido animal o vegetal
Nitrgeno Lquido utilizando un mortero y
una almirez refrigeradas
Perlas de Vidrio La ruptura celular se Levaduras
produce por agitacin de
las perlas de vidrio
Soluciones tampn y detergentes, segn el tipo de
protena de inters y la localizacin subcelular
Tipo/Localizacin Detergentes o Solucin Comentarios
Protena de interes Tampn
Nativa (no desnaturalizada) Detergente suave no inico Evitar detergentes
desnaturalizantes (SDS,
Deoxicolatos).
Citoplasmticos Tris HCL Pueden combinarse con
(soluble) mtodos mecnicos, tales
como el Homogeneizador
Dounce.

Citoplasmtico Tris Triton Los detergentes Triton son

(unida a citoesqueleto)
Membrana mitocondrial o
nuclear
NP 40, RIPA (muktiples
detergentes), Triton X 100
suaves y no inicos.
Para antgenos con niveles
bajos de espresin pueden
ser necesarios procesos de
enriquecimiento.

Lisado total de clulas NP 40, RIPA, Triton X - 100

Para evitar la degradacin de
protenas:
Evitar excesivos ciclos de
congelacin/descongelacin.
Trabajar rpido y mantener
las muestras en fro durante
todo el proceso.
Aadir inhibidores de la
proteasa en el tampn de
lisis.
Medicin de la protena Total
1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de
protenas en el gel.
2. Realizacin de Western Blot cuantitativo o
semi-cuantitativo.
Descripcin del Mtodo:

Mtodos
fsicos para la
disrupcin de
muestras
Eleccin de un ensayo de protenas
El equipo de lectura disponible en el
laboratorio
Los reactivos del tampn de lisis
La cantidad de muestra disponible
La facilidad/rapidez del ensayo
Tampn de Carga
El tampn de carga contiene Glicero, Azul de
bromofenol, SDS, beta Mercaptoetanol o DIT y
Tampn Tris Pepstalina (bajo condiciones
desnaturalizantes/ no reductoras)
Gel de Electroforesis
Eleccin del grosor del gel y del
tamao de poro
Los espaciadores de gel controlan el espesor del gel.
Estn disponibles en diversos tamaos.
Los geles con mayor espesor, pueden aceptar mayor
volumen de carga. Tambin se procesaran mas
lentamente y requieren tiempos de transferencia ms
largos que los geles mas delgados
El porcentaje del gel, segn la cantidad de
acrilamida y bisacrilamida, determina el tamao del
poro. A ms porcentaje menos tamao de poro.
El tamao de poro determina la ratio de separacin
de las protenas.
Elaboracin del gel
Inicio de Electroforesis
La glicina tiene una
carga negativa en el
tampn de
electroforesis a pH
8,3.
Con la aplicacin de
un campo elctrico,
la glicina, en el
Stacking Gel, se
aleja del electrodo
negativo
Inicio de Electroforesis
La glicina empieza a
perder su carga a pH
6,8 y ralentiza su
movimiento.
Los iones de cloruro
avanzan por delante
de la GLY.
El aumento de la
resistencia, obliga a
las protenas a
alejarse, de forma
apilada, del electrodo
negativo.
Inicio de Electroforesis
La glicina, debido a
un mayor pH del
Resolving Gel,
aumenta su carga
negativa y se mueve
por delante de las
proteinas.
Las proteinas se
separan segn su
peso molecular por
el
Sugerencias para la consecucin
exitosa de una transferencia
Evitar la manipulacin de membranas con las manos
desnudas.
Las burbujas de aire entre el gel y la membrana pueden
causar transferencia defectuosa y desigual.
No permitir un sobrecalentamiento la transferencia.
Ajustar las condiciones de transferencia al tamao de la
protena.
La aparicin de marcadores de tamao preteidos en la
membranas indicacin que se ha completado.
El colorante Ponceau S. puede utilizarse para teir la
membrana y asegurarse de la eficacia de la transferencia.
Bloquear sitios de union de la membrana que no han
reaccionado con el antigeno, para reducir la union
inespecfica de proteinas
 Etapa comn a todos los procedimientos de
inmunodeteccin
Se han descrito numerosas soluciones
bloqueantes, y todas ellas son efectivas.
El factor esencial a tener en cuenta es elegir
un sistema de bloqueo compatible con el
sistema de deteccin empleado.
 * Leche
descremada
* BSA
PROTEINAS *Suero fetal
de ternera
*Hb
BLOQUEDORES *Casena

* Nonidet P-
DETERGENTES 40
NO INICOS
*Tween 20
Tabla : Soluciones de bloqueo ms comunes en 'Western blotting'

Agente Caractersticas
bloqueante
Leche en 5% de leche desnatada en PBS /TBS. Muy econmico.
polvo Con poco 'background, fondo limpio. Se deteriora con
rapidez. Es posible que enmascare algunos antgenos.
Leche / Econmico. 5% de leche desnatada en PBS/TBS 0.1%
Tween-20 Tween-20. Fondos muy limpios. Puede enmascarar
antigenos.
Tween-20 0.1% Tween-20, 0.02% azida sdica en PBS/TBS.
Econmico. Permite la tincin despus de la
inmunodeteccin. Puede quedar un 'background'
residual.
BSA 3% BSA, 0,02% azida sdica en PBS. Bueno.
Relativamente econmico.
Suero de 10% suero de caballo, 0,02% azida sdica en PBS. Sin
caballo o 'background'. Moderadamente caro. Incompatible con
ternera fetal algunos anticuerpos anti-inmunoglobulinas.
Proteinas usadas como agentes bloqueantes en la
inmunotransferencia

Proteina [ ] recomendada Buffers Membrana compatible

BSA 0.2-5% (W/V) TBS, PBS Nitrocelulosa/ PVDF

Leche descremada 3-5% (W/V) TBS, PBS Nitrocelulosa/ PVDF
2-5% (W/V) TBS, PBS Nitrocelulosa/ PVDF
Casena 1% (W/V) TBS Nitrocelulosa/ PVDF
Gelatina de 2-10% (W/V) TBS, PBS Nitrocelulosa/ PVDF
pescado
Suero 1-5% (V/V) TBS, PBS Nitrocelulosa/ PVDF

TBS (Tampn Tris salino) o en PBS (Tampn Fosfato salino)

Detergentes como agentes bloqueantes

Detergent [ ] Buffers Membrana

e recomendada compatible

SDS 0.02 - 0.05% TBS, Nitrocelulosa/

(W/V) PBS PVDF
Triton X- 1% (V/V) TBS, Nitrocelulosa/
100 PBS PVDF
Tween-20 0.05 - 0.1% TBS, Nitrocelulosa/
(V/V) PBS PVDF
NP 40 0.02 0.05% TBS, Nitrocelulosa/
(V/V) PBS PVDF
 Tampones para agentes bloqueadores
sensibilidad interferencia por el ruido de fondo
NO TODOS LOS TAMPONES DE BLOQUEO SON
COMPATIBLES CON TODOS LOS SISTEMAS
El tampn de bloqueo ideal se va a unir a todos los
potenciales sitios de unin inespecfica de la membrana,
eliminando todo ruido de fondo sin alterar o bloquear los
eptopos para la unin del anticuerpo primario
Parmetro fundamental seal/ruido (seal obtenida con
una muestra que contiene el analito diana en comparacin
con la obtenida con una muestra sin el analito en cuestin).
[ ]tampn >>>ruido de fondo seal/ruido,
[ ]tampn enmascarar las interacciones Ag-Ac o inhibir
la disminucin de la relacin seal:ruido
 El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampon
Tris Salino) o en PBS (Tampon Fosfato salino); se
puede aadir tambien detergente Tween 20
Incubacin: 1h a T. ambiente o 4C
SI LOS NIVELES DE RUIDO DE FONDO SON
DEMASIADO ALTOS, SE PUEDEN
SELECCIONAR OTRAS SOLUCIONES DE
BLOQUEO ALTERNATIVAS.
 PASOS
1. Cubrir la membrana de nitrocelulosa con
PBS+Tween20 (0.3%). PREVIENE: unin no
especfica del sistema de deteccin a la membrana,
con el riesgo asociado de tener un elevado
'background' o falsos positivos.
2. Lavado con PBS/Tween 0.05% en agitacion
constante
3. Guardar la membrana de nitrocelulosa con tiras de
papel filtro humedecidas en PBS en una bolsa
plstica, conservar a -20C
 Incubacin de membrana con anticuerpo 1
Anticuerpo reconoce EPTOPO (expuesto al
eliminar la estructura tridimensional en
condiciones desnaturalizantes y reductoras)
Geles nativos: anticuerpos requieren de la
proteina plegada para el reconocimiento del
antigeno
 ANTICUERPOS PRIMARIOS:
Monoclonal vs Policlonal
Se diferencian segn la forma en la que
se sintetizan
POLICLONALES: suero de conejo,
cabra, burro u oveja.
MONOCLONALES: aislados de bazo de
animal y se fusionan con celulas del
mieloma
Inyeccion de un antigeno en un animal,
para provocar una respuesta inmune.
Mientras que los anticuerpos monoclonales se unen slo a un nico eptopo especfico en un antgeno, anticuerpos
policlonales tienden a estar compuesto de una mezcla de especificidades a varios eptopos. La especificidad de los
anticuerpos policlonales se puede mejorar mediante purificacin por afinidad contra fragmentos de la protena diana.
Alternativamente, la especificidad de la respuesta de anticuerpos puede estar influenciada en la etapa de la inmunizacin a
travs del uso de inmungenos genticamente o truncada, donde estn expuestos slo los eptopos diana deseadas.
 Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales
Anticuerpos Anticuerpos
monoclonales policlonales
Reconocimiento Eptopo nico Mltiples eptopos en
eptopo y sensibilidad (>especificidad) una protena
< sensibilidad (<especificidad)
> sensibilidad
Reactividad cruzada Reactividad cruzada Reactividad cruzada
potencial menos probable ms probable/ con
Potencial para otras especies
reconocer otras
protenas que
contengan el eptopo

Tiempo requerido Largo Ms corto

para su produccion
Coste de preparacion > coste < coste.
 Incubacion de los anticuerpos
Dilusion del anticuerpo 1 en el tampn de bloqueo, TBST.
Afinidad del ac.,
Abundancia de la proteina en la muestra
sensibilidad del sistema de deteccion
PERIODO DE INCUBACIN: 1 a 2h (T ) o 4C (noche)
amb

La membrana en disolucion se somete a agitacion suave.

Menor volumen, membrana se sella y se incuba con agitador
orbital
Eliminacion del excedente: LAVADO
Tampones de lavado: TBS, PBS TBST o PBST
Solucion de detergente de <[ ] 0.05-1% de
Tween20 en PBS o TBS
PBS-Tween adecuado
Exceso de detergente elusion de la proteina
Ac mono/poli altamente purificados Tampon de
lavado sin detergente
Recomendacin
Mnimo: 3 veces (5 -10/lavado) en un V de 4ml de
tampn de lavado/cm2 de membrana con agitacion
constante
 Indirecto
Verstil
> sensibilidad seal ms intensa.
Ventajas
Mx. inmunoreactividad del Ac1
PROS
se mantiene, ya que no est
etiquetado.
> amplificacin de la seal debido
a la unin de varios Ac2 a cada Ac
1
> posibilidad de unin
Uso de Ac 2 requiere pasos
adicionales de bloqueo y de control.
Ms lento, se necesita un paso
CONTRAS
extra de incubacin
Unin no especfica del Ac 2
Alto ruido de fondo.
Directo
Menos pasos
Unin especfica del Ac.2 (no
reactividad cruzada)
de la variabilidad del ensayo
Ms costoso
Inmunoreactividad de Ac puede
estar afectada por el marcaje
Necesidad de marcar cada Ac 1
para cada Ag de inters: consume
tiempo y es costoso.
La inmunoreactividad del Ac 1
puede verse afectada por el
marcaje.
No hay flexibilidad en la eleccin
marcador del Ac 1 de un
experimento a otro.
Amplificacin de seal mnima.
ANTICUERPOS SECUNDARIOS

Especie del Ac.1 dicta la eleccion del Ac.2.

Ac1 conejo Ac2 anti-conejo
Eleccion depende del tipo de marcaje
Radioisotopos
Fluoroforos
Ac 2biotinilados
Enzimas
Sistemas de deteccion
Quimioluminiscencia*
Quimiofluorescencia
Fluorescencia
Cromogenico
Radioisotopos
Sustratos cromognicos
Gran nmero de sustratos disponibles
Depende de: enzima utilizada (AP o HRP), la
sensibilidad deseada y el mtodo de deteccin o
tipo de seal que se busque (colorimetra,
fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.)
Sustratos cromognos:
SUSTRATO + ENZIMA productos insolubles
coloreados que precipitan sobre la membrana.
Enzimas
FOSFATASA HRP
ALCALINA
TAMAO 140kDa 40 kDa
PRECIO Caro Barato
ESTABILIDAD >0C < 0c
SUSTRATOS Pocos Muchos
CINETICA Lenta Rpida
pH PTIMO 8-10 5-7
 Para HRP TMB (3,3,5,5-tetrametil-benzidina), el 4-CN (4-cloro-1-
naftol) y el DAB (tetrahidrocloruro de 3,3-diaminobenzidina).

o Para la AP NBT (cloruro de tetrazolio nitro-azul), el BCIP (sal p-

toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato) y el Fast Red (fosfato de
naftol AS-MX + sal Fast Red TR).
Quimioluminiscencia
 Quimioluminiscencia
emisin de energa en forma de luz a partir de una sustancia, como
consecuencia de una reaccin qumica. El luminol es uno de los
sustratos ms ampliamente utilizados y su oxidacin en presencia de
perxido, origina la formacin de un producto en estado excitado
llamado 3-aminoftalato, que al pasar a un estado de energa menor,
emite fotones de luz.
VENTAJAS
Mltiples exposiciones de la membrana hasta conseguir la
mejor imagen
Se puede lavar la membrana, eliminando por completo todos
los reactivos para, posteriormente, volver a incubarlo para
visualizar otra protena u optimizar la deteccin de la primera
mayor rango lineal, lo que permite la deteccin cualitativa y
cuantitativa en un mayor rango de
concentraciones
Los sustratos quimioluminiscentes proporcionan la mayor
sensibilidad de todos los mtodos de deteccin existentes
Pasos:
1. incubar la membrana de NC con el
Ac2 de 1-3h
2. Lavar con PBS/Tween al 0.05% x 10 (2
o mas veces)
3. Incubar con el sustrato por 10
4. Detener la reaccin con agua destilada.
GENERALIDADES:
Diagnstico de infeccin por VIH, HTLV-1,
mononucleosis infecciosa, hepatitis C,
infeccin por citomegalovirus, herpes 1 y 2.
Diagnstico de cisticercosis,
hidatidosis,toxocariosis.
Diagnstico de bartonelosis, leptospirosis.
APLICACIONES : Diagnstico de VIH

Test ms especfico y ms costoso.

Se basa en determinar anticuerpos (Ac)
anti-VIH en el suero.
En los casos reactivos los Ac anti-VIH
quedan unidos a los Ag especficos.
APLICACIONES: Diagnstico de
VIH
Western blot es una prueba de confirmacin de la
presencia de anticuerpos anti-VIH.
CRITERIO DE POSITIVIDAD DE LA PRUEBA WESTERN
BLOT

CRITERIO REACTIVIDAD FRENTE A

OMS Dos glucoproteinas
cualquiera de: gp160,
gp120, gp41
CRSS P24 +(gp41 o gp120
ogp160) o p32 +(gp41 o
gp120 o gp160)
OMS: Organizacin Mundial de la Salud
CRSS: consortium for Retrovirus Serology and Standardization
APLICACIONES: Diagnstico de
VIH
PAUTAS DE LECTURA DE LA PRUEBA DE
WESTERN BLOT
1. Identificacin de bandas especificas virales
de reactividad
2. Valoracin de la reactividad de cada banda
3. Anotacin individualizada de los resultados
en cada muestra
4. Aplicacin del criterio de positividad
5. Emisin del resultado e informe
APLICACIONES: Diagnostico de
VIH
PROBLEMAS EN EL CRIBADO Y
CONFIRMACION DE LOS ANTICUERPOS
ANTI-VIH
Causas de falsos positivos en las pruebas
sricas de deteccin de anticuerpos anti-VIH
A. Relativa al suero: congelaciones y
descongelaciones repetidas,
almacenamiento a temperatura no optima,
errores de extraccin o identificacin.
APLICACIONES: Diagnostico VIH
APLICACIONES: Diagnostico de
VIH 1er suero
EIA

Positivo Negativo

Informe previo y solicitud Repetir o hacer

de nuevo suero otras pruebas

2do suero
Negativo
EIA

Positivo

WESTERN BLOT Negativo

Positivo Indeterminado
APLICACIONES: Purificacin de
protenas recombinantes

La produccin de protenas
recombinantes necesita un alto
grado de pureza y rendimiento.

Confirmar la presencia de
protenas de inters en fracciones
de cromatografa.
APLICACIONES: Purificacin de
protenas recombinantes

Detectar impurezas en protenas

recombinantes
APLICACIONES: Anlisis de fracciones de
IgG purificada de plasma humano

El plasma contiene protenas incluyendo

inmunoglobulinas.
La eficacia de cromatografa para purificar
IgG en el plasma puede ser probado por
transferencia de Western Blot
APLICACIONES: Las protenas b3 y PDI aisladas
de plaquetas humanas se unen con el rotavirus
Ecwt in vitro
Las posiciones de las bandas identificadas de
b3 o PDI en el western blot fueron utilizadas
para determinar los sitios de corte en el gel
preparativo.
APLICACIONES: Diagnstico de
angiostrongilosis abdominal

Angiostrongylus costaricensis es agente

etiolgico.
Hospedero: roedores
Hbitat es la regin ileocecal. Produce
reaccin inflamatoria.
No hay diagnostico en heces por ello se
emplea otros mtodos como histolgicos,
inmunolgicos (Western blot)
APLICACIONES: Diagnstico de
angiostrongilosis abdominal
Articulo: CARACTERIZACION DE
ANTIGENOS DE BAJO PESO MOLECULAR
DE Angiostrongylus costaricensis,
RECONOCIDOS DURANTE UNA
INFECCION EXPERIMENTAL EN
ROEDORES
Western blot identifica y caracteriza antgenos
con mayor especificidad porque trabaja con
bajo peso molecular (bajo los 30KDa).
Son reconocidas IgG, IgG1 y dos bandas:
20kDa, 15KDa
APLICACIONES: Diagnstico de
angiostrongilosis abdominal

Separacin
electrofortica de
Angiostrongylus
costaricensis (AcAg).
Se procedi a la
separacin analtica
del AcAg en el
mbito de los 26,0 a
los 1,0 kDa y a la
tincin de las bandas
obtenidas mediante
Coomassie.
APLICACIONES: Industria
alimentaria
En la industria alimentaria
Identificar el origen de alimento detectando los
ingredientes y posibles contaminantes
(agentes transgnicos, bacterias, virus).
Tcnica basada en el anlisis de protenas.
APLICACIONES: Industria
alimentaria
Diseado para detectar ingredientes
modificados genticamente mediante la
identificacin de protenas transgnicas
del maz (Cry9c, CryAb y PAT) y de la
soya (CP4 EPSPS)