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Qu son los microarreglos?

Tecnologa diseada por Brown P.O. y
Botstein D. en 1999

Conjunto ordenado de genes en una

pequea superficie slida (10,000 muestras/
cm2)

Permite el anlisis en paralelo de

prcticamente todos los genes de un
organismo en un slo experimento
 Tcnica utilizada para detectar niveles de expresin de los genes
colocados en el microarray.

Se extrae el DNA o mARN de la clula de inters o de algn

tejido particular, sometindolo a transcripcin inversa para
obtener cADN y se combina ste con un marcador fluorescente
(usualmente los tintes de cianina Cy3 y Cy5) para generar una
sonda, que es hibridizada sobre el microarray, de manera que
para cada gen se detecta el grado de fluorescencia, lo cual da el
nivel de expresin del gene.

Para identificar genes

con una expresin
diferencial en
condiciones distintas
Tipos de impresin de microarrays
Dos tipos principales:

De contacto.- deposita las muestras haciendo contacto con la superficie.
Piezoelctricos. Un aplicador ultrasnico deposita
las muestras (tecnologas muy recientes)
 Se depositan volmenes muy pequeos de una solucin de ADN sobre un
portaobjetos, creando manchitas de unas 100 a 150 m de dimetro.

Superficies como la nitrocelulosa

o el nylon , laminillas de vidrio,
u oro.
 Estas laminillas se pueden conseguir con diferentes recubrimientos como:
poli-lisina, aminas y aldehdos, las cuales permiten la unin qumica del
DNA con la superficie
80C por cuatro horas o luz UV

Ejemplo de la superficie sobre la que se pueden imprimir los microarreglos y del

mecanismo para el entrecruzamiento del DNA a la laminilla.
 Impresores de contacto

Cuentan con una cabeza en la que se pueden colocar de 1 a
48 aplicadores.
 Los aplicadores, son pequeas agujas con una ranura en la punta, y la
muestra se toma y se deposita por capilaridad.
Los ms comunes tienen una capacidad de 0.25 l y pueden hacer al
menos 100 aplicaciones, es decir 0.0025 l por aplicacin.

Hasta 300 aplicaciones y aplicadores slidos, es

decir sin ranura, y que pueden hacer hasta 10
aplicaciones.
 Obtencin de RNA

Aislamiento de RNA (lo msconcentrado posible, al menos 30g de
RNA total para realizar un experimento)

Fotografa de RNA total de levadura, corrido en un gel

desnaturalizante de agarosa 1%.
 Marcado de RNA

Para el marcado del RNA (sonda) se utiliza la sntesis de cDNA de
cadena sencilla. En los mtodos ms comunes; se coloca el RNA total
junto con un desoxioligonucletido poli T y un conjunto de hexmeros
al azar, permitiendo que reconozcan sus sitios en el RNA mensajero.

Imagen de fluorescencia de las

sondas marcadas con los fluorforos
Cy3 rojo y Cy5
verde
 Hibridacin

Aplicar la solucin de hibridizacin con
las sondas sobre la laminilla y cubrirla
con un cubreobjetos para permitir que la
solucin cubra todo el microarreglo de
igual forma que se hace una preparacin
para microscopa.
 Lectura

Existen dos tipos de lectores de microarreglos:
los lectores con cmaras digitales y
los lectores confocales.
En los lectores con cmaras digitales se registra la imagen fluorescente
como si se tomara una fotografa comn, mientras que en los lectores
confocales se hace una reconstruccin de la imagen utilizando los
principios de la microscopa confocal, que consiste en la utilizacin de
fotomultiplicadores para registrar la seal.
 Ambos tipos de lectores utiliza un lser para activar las molculas
fluorescentes unidas al cDNA y poder obtener la imagen de cada una de las
muestras contenidas en el microarreglo.
Este procedimiento se hace para cada uno de los fluorforos obtenindose
dos imgenes, una para el fluorforo Cy3 (rojo) y una para el fluorforo Cy5
(verde)
 Una vez obtenidas estas imgenes, pueden ser combinadas para
obtener un aspecto visual del microarreglo
 Cuantificacin

Para la obtencin de los valores cuantitativos de cada una de las seales
de fluorescencia contenidas en el microarreglo, se requiere del anlisis de
las imgenes. Comercialmente se pueden adquirir programas de computo
para estos fines
 Interpretacin de resultados

Requiere de anlisis estadsticos.
Bsicamente se trata de discriminar entre los miles de datos que se
obtienen, aquellos que son significativos y que representan un
cambio real.
Tambin existen programas que permiten agrupar a los genes ya sea
por su nivel de expresin, funcin, estructura, etc.
Estos procedimientos estadsticos y de agrupamiento es lo que
actualmente se conoce como bioinformtica.
 Conclusiones

Los microarreglos son en la actualidad una poderosa herramienta de
anlisis de expresin de genes debido al mayor nmero de secuencias
que se pueden analizar por prueba y tienen grandes ventajas sobre
otras tcnicas como la PCR convencional, la RTPCR y la PCR en
tiempo real, en las cuales slo se pueden analizar un nmero muy
limitado de genes de manera simultnea, debido a que en la mayora
de los casos que se requiere montar un ensayo por cada gen a
analizar.
 Bibliografa

Busquets X. y Agust A.G.N. Chip gentico (ADN microarreglo de
ADN): el futuro ya est aqu. Arch. Bronconeumol.,37, 394-396, 2001.
Albelda S.M. and Sheppard D. Functional genomics and expression
profiling: be there or be square. Am.J. Respir. Cell. Mol. Biol., 23,
265-269, 2000.
Rentara M. Breve revisin de los marcadores moleculares. 559-562
pp.
Ramrez J., Chvez L. Santilln J y Guzmn S. 2003. Microarreglos
de DNA. Universidad Nacional Autnoma de Mxico