Sunteți pe pagina 1din 19

BIOTEHNOLOGIA

Aceast tiin se prezint ca o ramur interdisciplinar a progresului tehnico-


tiinific i a aprut la intersecia tiinelor biologice, chimice i tehnice.
Conform definiiei O.C.D.E. (Organizaia pentru Cooperare i Dezvoltare
Economic), biotehnologia include orice tehnic ce presupune utilizarea unor
organisme vii sau a unor componente ale acestora pentru a obine sau a modifica
produse, pentru a ameliora plante ori animale sau pentru a produce
microorganisme cu utilizri specifice.
Biotehnologia modern constituie o achiziie de valoare fundamental i
aplicativ a tiinei contemporane. Odat cu dezvoltarea cunotinelor de biologie
celular, genetic molecular, biochimie, biofizic, microbiologie i inginerie
genetic, a devenit posibil manipularea artificial a informaiei genetice a
organismelor vii i pe aceast baz, au aprut biotehnologiile moderne cu implicaii
deosebite n ameliorarea plantelor i animalelor, n producerea de substane
farmaceutice i cosmetice, de produse chimice i bioenergetice valoroase.
Biotehnologiile sunt privite ca mijloace sigure de rezolvare a problemelor
alimentare, energetice, a resurselor de materii prime i ecologice.
n ultimii ani s-au realizat progrese importante n dezvoltarea tiinelor
biologice, fapt care a fcut posibil crearea de plante i animale transgenice,
obinerea de aminoacizi, enzime i proteine monocelulare neconvenionale,
microorganisme capabile s valorifice cele mai diverse medii de cultur, captarea i
conversia energiei solare i pe aceast baz mrirea eficienei fotosintezei.
Gama produselor biotehnologice se extinde considerabil datorit apariiei i
dezvoltrii fotobiotehnologiilor direcie nou de perspectiv n tiina
biotehnologic, una din preocuprile majore este punerea n valoare a unor noi
surse de materie prim neconvenionale,pentru obinerea preparatelor
medicamentoase i altor principii bioactivi valoroi.
Biotehnologiile contemporane au implicaii cu totul deosebite n agricultur i
industria alimentar, n medicin i industria farmaceutic, n industria chimic
i metalurgic, n valorificarea biomasei i producerea de energie
neconvenional.
Biotehnologia vegetal
Dac procedeele tradiionale de ameliorare a plantelor se bazeaz pe
manipularea genelor i cromozomilor prin reproducere sexuat, noile procedee
care au aprut recent prin dezvoltarea principiilor ingineriei genetice, opereaz la
nivel celular sau molecular n vederea manipulrii genetice (Cristea M., 2006).
Biotehnologia vegetal s-a dezvoltat ca o ramur de sine stttoare a
biotehnologiei i cuprinde o serie de tehnici, de la cele mai simple, cum este
nmulirea plantelor in vitro pe medii aseptice, n condiii controlate
(micropropagarea) continund cu producerea de plante haploide, hibridarea
somatic, fuziunea de protoplati, obinerea de biomas din culturi celulare sau
obinerea de semine artificiale din embrioni somatici (Tabelul 1.)
Aplicaii ale biotehnologiilor vegetale ( dup Sasson A., 1993)

Tipul de biotehnologie Aplicaia


Culturi de meristeme i producerea de plante in vitro Micropropagare, obinerea
plantelor libere de virusuri
Culturi de protoplati, de esuturi haploide, selecia mutantelor, Ameliorarea i micropropagarea
diviziunea protoplastelor i regenerarea plantelor in vitro cultivarelor
Tehnici de recombinare genetic, transfer de gene i Ameliorarea plantelor de cultur
regenerarea vitroplantelor
Culturi de celule vegetale, selecia variantelor i a mutantelor, Producerea de substane utile
cultivarea i diviziunea protoplastelor, tehnici de ADN
recombinant
Culturi de celule sau protoplaste, bioconversie Sinteza unor substane noi

Cultura in vitro a plantelor


Tehnica culturii "in vitro" elaborat independent de G a u t h e r e t si W h i t e, este folosit
att pentru studierea unor probleme fundamentale de fiziologia plantelor ct i n cadrul unor
programe cu caracter aplicativ pentru agricultur, horticultur i silvicultur.
Introducerea acestei tehnici a permis acumularea de cunotint privind totipotena,
diferenierea, diviziunea, nutriia, metabolismul i conservarea celulei vegetale.

Prin cultura in vitro


se nelege creterea pe medii artificiale, ncondiii de asepsie deplin i de
factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri deorgane, esuturi sau celule
vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil n
momentul n care explantul crete

Micropropagarea in vitro este ramura biotehnologiei vegetale care reprezint


un ansamblu de metode de nmulire a plantelor prin utilizarea culturilor in vitro de
celule, esuturi i organe vegetale. Utilizarea acestei tehnici permite sporirea
considerabil a randamentului la nmulire a diferitelor specii, fiind totodat i o
metod de eliberare de agenii patogeni din materialul sditor.
Importana micropropagrii i principalele sale avantaje comparativ cu multiplicarea
vegetativ clasic sunt (dup Cachi - Cosma, 1987; Stnic i colab., 2002) :
- Posibilitatea de a obine plante libere de ageni patogeni, n special viroze, prin culturi de
meristeme;
- Eficacitatea i productivitatea imens, inegalabil n prezent, datorit ratelor de multiplicare
imense, n progresie geometric, n mai multe cicluri pe an;
- Potenialul rol n ameliorarea plantelor, datorit faptului c o selecie valoroas poate fi
multiplicat extrem de rapid i introdus n cultura la scar mare;
- Nu este dependent de anotimp i de intemperii, datorit faptului c se realizeaz n incinte
cu climat controlat;
- Se face economie de spaiu;
- Ofer posibilitatea conservrii unor genotipuri valoroase n spaii mici;
- Uurina transportului unei cantiti mari de germoplasm independent de msurile de
carantin fitosanitar;
Ofer posibilitatea multiplicrii eficiente la unele specii la care multiplicarea prin metode
tradiionale este dificil sau neeconomic;
- Ofer o posibilitate real pentru a salva i nmuli specii de plante rare.
Micropropagarea are i unele dezavantaje:
- Este mai complicat i mai sofisticat dect metodele tradiionale i necesit
pregtire special;
- Costurile iniiale pentru realizarea unei uniti de micropropagare sunt relativ
mari; - Este nevoie de aparatur, utilaje i echipamente speciale, precum i de
substane chimice costisitoare i de puritate ridicat;
- Exist pericolul invadrii pieei cu soiuri i specii care sunt la mod sau
care sunt uor de nmulit in vitro, n detrimentul altor specii i soiuri.
Explantul constituie unitatea vie ce conine n celule ntreaga informaie genetic a plantei
mam i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe planteidentice cu
planta donor. Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care
sedesprinde de pe planta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un
mediuartificial de cultur.
Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma
o plant identic cu planta mam.
Teoretic fiecare celul vie este totipotent, ns n practic s-a observat c nu toate celulele
au capacitatea de a-i exprima acest caracter, datorit pe de o parte diferenierii celulare i
mbtrnirii, iar pe de alt parte gradului mare despecializare al acelor celule.
Plantele pot fi cultivate nu numai n ghivece, ser sau cmp, ci i in
vitro (in vitrolat. - n sticl despre o experien care se efectueaz n
afara organismului), pe medii nutritive adecvate, ntr-un mediu aseptic.
Tehnicile de cultur in vitro prezint un interes, din ce n ce mai bine
pus n valoare, pentru colectarea, nmulirea i conservarea
germoplasmei, permind propagarea materialului biologic cu o rat
superioar metodelor clasice, iar munca se poate desfura, pe tot
parcursul anului, indiferent de sezon, n condiii aseptice de mediu.
Prin intermediul acestei tehnologii se asigur eradicarea bolilor virotice,
producerea, multiplicarea i distribuia de genotipuri libere de patogeni.
Utilizarea tehnicilor de cultur in vitro pentru producerea de material
sditor debuteaz n 1922, cnd Lewis Knudson a reuit germinaia
asimbiotic a seminelor de orhidee pe un mediu nutritiv compus din ap,
sruri minerale, zahr i solidificat cu agar. Descoperirea lui Knudson a
dus la posibilitatea producerii masive, la un pre relativ sczut, a
orhideelor, prin tehnica germinaiei in vitro, care este mai ieftin dect
germinaia simbiotic. Mediul nutritiv Knudson C este utilizat i
comercializat i n prezent.
n 1962 Toshio Murashige i Folke Skoog au publicat reeta unui mediu
nutritiv optimizat pentru cultura in vitro a esuturilor de Nicotiana tabacum
(Murashige i Skoog, 1962), care s-a dovedit a fi foarte potrivit pentru
cultura i multiplicarea in vitro la o mare varietate de specii.
n prezent acest mediu nutritiv este utilizat n majoritatea laboratoarelor
de micropropagare, fiind adecvat pentru enorm de multe specii ierboase
i unele specii lemnoase.
Mediul nutritiv Murashige & Skoog (MS) a fcut posibil apariia i
dezvoltarea micropropagrii la scar industrial a speciilor horticole.
Dezvoltarea tehnicilor de propagare conservativ prin culturi in vitro a rspuns
unor necesitai practice, printre care salvarea unor specii recalcitrante la
conservarea prin semine, sau a celor cu multiplicare vegetativ, dintre care
unele au o deosebit importan economic (Strjeru Silvia i colaboratorii,
2001).
Multiplicarea in vitro a plantelor se bazeaz pe totipotena celulei vegetale
(capacitatea unei celule meristematice (embrionare) de a se dezvolta, ca rspuns
la prezena n mediu a unor substane de cretere a plantelor, ntr-o celul
specializat).
Conform acestui concept, orice celul vegetal, haploid sau diploid, coninnd
toat informaia ereditar n genom i izolat din esut, n situaia asigurrii
condiiilor optime continurii proceselor metabolice i fiziologice, i va relua
activitatea, va crete, se va divide i din celulele rezultate, se vor diferenia
esuturi, organe i plante.
Practicarea culturii in vitro presupune existena unui spaiu amenajat i
echipat scopului propus, a unor vase de sticl sau material plastic, a mediilor de
cultur adecvate i a materialului biologic sub form de esuturi, organe sau
plante. Absena microorganismelor reprezint condiia sine qua non pentru
reuita fiecrei culturi in vitro.
Organele plantelor superioare, de tipul meristemelor apicale, rdcinilor, primordiilor foliare,
mugurilor florali, ovulelor, anterelor, embrionilor, pot fi izolate i cultivate in vitro,
meninndu-i caracteristicile structurale i continund s creasc, fr pierderea organizrii
structurale specifice.
Medii de cultur in vitro

Un mediu de cultur in vitro prezint o component anorganic constituit din


sruri minerale i o component organic, care include carbohidrai, vitamine i
substane reglatoare de cretere. Aceste medii folosite pentru culturi statice
conin i un agent gelifiant, care este agarul. Apa folosit pentru prepararea
mediilor trebuie s fie purificat, deionizat, distila i filtrat.
Componenta anorganic pentru culturile in vitro include elementele eseniale
pentru creterea plantelor, la care se adaug uneori aluminiul i nichelul.
n funcie de cantitile n care se gsesc n diferite formule de mediu, acestea se
mpart n:
macroelemente (N, P, K, S, Mg, Ca)
microelemente (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Mo, Al, I, Fe)
Componenta organic
Celulele i esuturile cultivate in vitro nu sunt autotrofe (nu au capacitatea de a sintetiza
carbohidrai prin asimilarea CO2, n timpul fotosintezei) i de aceea n mediile de cultivare trebuie
Inclus zaharoz, n concentraie de 2 -3 %.
In vivo i vitaminele sunt sintetizate de plante, dar n culturile de celule i esuturi in
vitro absena sau insuficiena acestor vitamine provoac un dezechilibru n cretere.
Din acest motiv, n mediile de cultur se adaug n mod curent vitamina B1 (tiamina)
n doz de 0,1 10,0 mg/l, acid nicotinic (vitamina PP) n doz de 0,1 5 mg/l i
piridoxin (vitamina B6) n cantitate de 0,1 1,0 mg/l.
Diferii cercettori au luat n studiu cerinele de elemente minerale ale esuturilor cultivate i au elaborat
diverse medii de cultur care le poart numele, ( Tabel 2.):
Compoziia mediilor de cultur n vederea multiplicrii plantelor
mg / l.

MS B5 Schenk
Compoziia mediului (Murashige & Nitsch Gamborg &Hildebran
Skoog 1962) (1972) (1976) dt (1972)
Sruri minerale
KNO3 1900 950 2500 2500
NH4NO3 1650 720 - -
(NH4)2SO4.H2O - - 134 -
Ca Cl2.2 H2O 440 220 150 200
NH4 H2PO4 - - - 300
Mg SO4. H2O 370 185 250 400
NaH2PO4. H2O - 150 - -
KH2PO4 170 68 - -
FeSO4.7H2O 27,8 27,8 27,8 15
Na2EDTA 37,3 37,3 37,3 20
MnSO4.4H2O 22,3 25 13,2 13,2
H3BO3 6,2 10 3 5
ZnSO4.7H2O 8,6 10 2 1
KI 0,83 - 0,75 1
Na2MoO4.2H2O 0,25 0,25 0,25 0,1
CuSO4.5H2O 0,025 0,025 0,025 0,2
CoCl2.6H2O 0,025 - 0,025 0,1
Vitamine
m - Inositol 100 100 100 100
thiamina HCl 0,1 0,5 100 5
piridoxin HCl 0,5 0,5 10 0,5
Acid nicotinic 0,5 5 10 5
biotin - 0,05 - -
acid folic - 0,5 - -
glicin 2 2 - -
Zaharoz 30000 20000 30000 30000
Dintre regulatorii de cretere (fitohormoni sau hormoni vegetali), numai auxinele i citochininele
se folosesc mai frecvent. Sunt utilizate mult mai rar la giberelinele i extrem de rar acidul
abscisic.
Fitohormonii orienteaz procesele de cretere i dezvoltare in vitro, astfel tipul de cultur i
implicit explant determin tipurile i concentraiile hormonilor care vor fi folosii.
Explant exlat.-afar, scos;plantarelat. a planta , a sdi; celul, esut, organ extras dintr-un
organism oarecare, animal sau vegetal, transferat pe un mediu de cultur potrivit in vitro, n
vederea incubrii i renceperii diviziunilor mitotice.
Pentru exemplificare se prezint compoziia unui mediu de cultur (Murashige & Skoog 1962)in
vitro pentru multiplicare la cartof, completat cu ANA (0,5 mg/l) (Tabel 3.).
Compoziia mediului de cultur pentru multiplicare la cartof *(mg/l)
(dup Chiru Nicoleta i Antofie Adriana, 1997)

Constitueni Mediul de cultur


Iniiere Multiplicare Tuberizare
NH4NO3 1650 1650 1650
Macroelemente CaCl2.2H2O 440 440 440
MgSO4.7H2O 370 370 370
KNO3 1900 1900 1900
KH2PO4 170 170 170
CoCl2.6H2O 0,025 0,025 0,025
Microelemente CuSo4.5H2O 0,025 0,025 0,025
FeSO4.7H2O 27,85 27,85 27,85
Na2EDTA 37,25 37,25 37,25
MnSO4.4H2O 22,30 22,30 22,30
KI 0,83 0,83 0,83
Na2MoO4.2H2 0,25 0,25 0,25
O
ZnSO4.7H2O 8,6 8,6 8,6
H3BO3 6,2 6,2 6,2
Myo-inozitol 100 100 100
Constitueni Piridoxin 0,5 0,5 0,5
organici Acid nicotinic 0,5 0,5 0,5
Thiamin HCl 0,1 0,1 0,1
Glicin 2,0 2,0 -
GA 3 0,5 - -
ANA - 0,5 -
Chinetin - - 2,5
Cumarin - - 25,0
Zaharoz 30000 30000 30000
Agar-agar 7000 7000 7000
pH 5,8 5,8 5,6

Autoclavare la 100oC timp de 20 minute


Faza de pregtire a materialului vegetal
Eliminarea bacteriilor, ciupercilor i a altor microorganisme necesit o sterilizare de suprafa, care
trebuie s fie complet fr a afecta integritatea materialului vegetal.
n general, materialul provenit din cmp este foarte greu de sterilizat i din acest motiv se recurge
frecvent la obinerea acestuia n laborator, asigurndu-se n acest fel mediul aseptic nc din faza
de germinare. Prin urmare un protocol standard de sterilizare include:
splri cu ap curent;
imersia ntr-o soluie sterilizant (hipoclorit de sodiu sau de calciu);
splarea cu ap distilat steril.
Sterilizarea materialului vegetal se face n hote cu flux laminar (Fig. 1.), cnd se
repartizeaz i mediul n vasele de cultur (Fig. 2.).

Timpul de sterilizare i concentraia soluiei sterilizante se aleg pentru fiecare material experimental n parte.
Faza de iniiere a unei culturi in vitro
Aceast etap de iniiere presupune urmtoarele activiti:
confecionarea explantelor din material vegetal sterilizat, folosind instrumente sterile (Fig. 92.);
trecerea explantelor n vasele de cultur prin inoculare la suprafaa mediului (Fig. 3.).

Trecerea plantelor n vasele de cultur


n continuare, culturile in vitro (Fig. 4., Fig. 5.) obinute, sunt transferate n dulapurile sau
camerele climatizate (Fig. 6.),(imagini surprinse la Banca de Gene Suceava).

Aspect din camera climatizat


de cretere a culturilor in vitro
n funcie de scopul urmrit i de natura materialului vegetal, culturile in vitro
pot fi clasificate astfel:
culturi de plante, care se obin prin germinarea seminelor, embrionilor sau
prin nrdcinarea lstarilor;
culturi de embrioni;
culturi de organe (apexuri, rdcini, antere);
culturi de explante (poriuni de organe, esuturi);
culturi de calus;
culturi de celule n suspensie (calusuri sau explante de origini diferite,
cultivate n mediu lichid, agitat, genereaz o mas de celule izolate i de
agregate celulare mici),
culturi de protoplati (celule lipsite de peretele celular)
Importanta practic, avantajele i dezavantajele micropropagrii Importana micropropagrii i
principalele sale avantaje comparativ cu multiplicarea vegetativ clasic sunt (dup Cachi -
Cosma, 1987; Stnic i colab., 2002) :
- Posibilitatea de a obine plante libere de ageni patogeni, n special viroze, prin culturi de
meristeme;
- Eficacitatea i productivitatea imens, inegalabil n prezent, datorit ratelor de multiplicare
imense, n progresie geometric, n mai multe cicluri pe an;
- Potenialul rol n ameliorarea plantelor, datorit faptului c o selecie valoroas poate fi
multiplicat extrem de rapid i introdus n cultura la scar mare;
- Nu este dependent de anotimp i de intemperii, datorit faptului c se realizeaz n incinte cu
climat controlat;
- Se face economie de spaiu;
- Ofer posibilitatea conservrii unor genotipuri valoroase n spaii mici; - Uurina transportului
unei cantiti mari de germoplasm independent de msurile de carantin fitosanitar;
- Ofer posibilitatea multiplicrii eficiente la unele specii la care multiplicarea prin metode
tradiionale este dificil sau neeconomic;
- Ofer o posibilitate real pentru a salva i nmuli specii de plante rare. Micropropagarea are i
unele dezavantaje:
- Este mai complicat i mai sofisticat dect metodele tradiionale i necesit pregtire
special;
- Costurile iniiale pentru realizarea unei uniti de micropropagare sunt relativ mari;
- Este nevoie de aparatur, utilaje i echipamente speciale, precum i de substane chimice
costisitoare i de puritate ridicat;
- Exist pericolul invadrii pieei cu soiuri i specii care sunt la mod sau care sunt uor de
nmulit in vitro, n detrimentul altor specii i soiuri.
n afar de acestea, micropropagarea prezint toate avantajele i dezavantajele producerii de
material sditor containerizat, deoarece n marea majoritate a cazurilor produsul final, plantele
nmulite prin micropropagare se prezint ca i material sditor containerizat (plantat la ghiveci).
Acestea sunt (dup Stnic i colab., 2002):
- Tehnicile culturale permit mecanizarea i standardizarea lucrrilor;
- Plantele sunt mai uor de manevrat comparativ cu cele cultivate n solul din cmp, nu trebuie
scoase din pmnt cu ocazia transplantrii sau livrrii;
- Plantele containerizate pot fi transportate, vndute, livrate i plantate pe tot parcursul anului,
cu excepia perioadelor foarte reci sau foarte calde;
- Valorificarea mai bun a terenului datorit densitii foarte mari a plantelor pe unitatea de
suprafa;
- Rdcinile plantelor containerizate sunt bine dezvoltate, formnd o reea relativ dens n
balotul de pmnt din container, ceea ce asigur un procent foarte mare de prindere, de aproape
100 %;
- Se elimin necesitatea stratificrii sau a depozitrii n condiii speciale, prin stratificare sau
ngropare.