Sunteți pe pagina 1din 192

Notiuni introductive de chimie analitică

Chimia analitică → studiul metodelor de:


– separare,
– identificare şi
– determinare a compozitiei şi structurii substantelor.
Chimia analitică calitativă → identificarea constituenţilor
(elementelor, ionilor, grupărilor) din substanţa de studiat;
Chimia analitică cantitativă → determinarea compozitiei
cantitative a substantelor de analizat.
Clasificarea metodelor analitice
1. Metode chimice de analiză;
2. Metode fizico-chimice de analiză (metode
instrumentale).
• Metodele chimice de analiză folosesc pentru
determinarea calitativă şi cantitativă a analitului
unele proprietati chimice caracteristice şi
utilizează sticlăria uzuală în laborator.
• Metodele fizico-chimice de analiză folosesc
pentru determinarea calitativă şi cantitativă a
analitului, aparate speciale cu care evaluează
mărimi fizice ca: absorţia luminii, conductibilitatea
electrică a soluţiilor, indicele de refracţie etc.
Metode fizico – chimice de analiză

• Componentului de analizat se determină indirect, prin evaluarea


unor mărimi fizico-chimice:
– absorbţia luminii,
– intensitatea culorii,
– conductibilitatea eletrică,
– indicele de refracţie,
– diferenţa de potenţial,
– Căldura de combustie etc.
• Sunt necesare aparate speciale => metode instrumentale
Clasificarea metodelor fizico-chimice de analiză
• Metode optice
• Metode electrochimice
• Metode de separare
Metode optice de analiză
Spectroscopia
• Studiază interacţiunea materiei cu o radiaţie electromagnetică.
• Apar procese de absorbţie şi emisie de radiaţii de către materie.
Domenii spectrale
• Lumina sau radiaţia electromagnetică prezintă un caracter dual: de
undă şi de particulă.
• Lumina este reprezentată de particule (fotoni) de masă m care se
deplasează cu viteza c (3 .108 m/s) şi posedă o undă asociată, de
lungime de undă λ şi frecvenţă ν.

E = hν = mc2 (relaţia lui Planck), h = constanta lui Planck = 6,63.10-27erg.s

h hc
λ= => E=
mc λ
În funcţie de lungimea de undă, radiaţiile electromagnetice au fost
împărţite în domenii spectrale.
Spectroscopia de absorbție moleculară în ultraviolet şi
vizibil (fotometria)
Absorbţia moleculară în ultraviolet şi vizibil
• Absorbţia unei cuante determină trecerea moleculei într-o stare
excitată caracterizată de un nivel energetic crescut:
M + hν → M*
Moleculele excitate (M*) au o stabilitate scăzută, în medie 10-8 s, şi
revin la starea fundamentală M prin emisie de energie neradiantă.
M* → M + energie neradiantă
Grupările funcţionale care absorb radiaţii din domeniul spectral se numesc
cromofori.

Cromofor Exemplu Excitație λmax, nm ε Solvent


C=C Etenă π → π* 171 15000 Hexan
C≡C 1-Hexină π → π* 180 10000 Hexan
C=O Etanal n → π* 290 15 Hexan
π → π* 180 10000 Hexan
N=O Nitrometan n → π* 275 17 Etanol
π → π* 200 5000 Etanol
C-X, X=Br, Bromură de n → σ* 205 200 Hexan
I metal, n → σ* 255 360 Hexan
iodură de
metal
Legea Lambert-Beer
Dacă o radiaţie străbate un sistem absorbant, o cuvă de grosime d, o
parte din intensitatea radiaţiei incidente (I0) este absorbită (Ia), iar
cealaltă parte va trece prin sistem fiind transmisă (It) .

Figura ......Diagrama
absorbţiei Lambert Beer a
unei radiaţii luminoase la
traversarea unei cuve de
It grosime d

d
I0 =Ia + It
Ia ~ d
Ia ~ c
Aceste două legi pot fi exprimate prin relaţia:
It = Io . 10-ε c d
în care, ε = coeficientul molar de absorbţie
Raportul It/I0 defineşte mărimea numită transmisie (T):
It
T =
I0
Absorbanţa (A) reprezintă logaritmul mărimii reciproce a transmisiei:
1 I0
A = log log A = log log
T It
=> A = ε . c . d (Lambert-Beer)
d = constant => A = kc
unde, k – constantă de proporţionalitate.
Dacă determinările se efectuează în domeniul vizibil absorbanţa se mai
notează şi cu E (extincţie), iar pentru determinările efectuate în
ultraviolet se notează şi cu DO (densitate optică).
Legea Lamber-Beer este valabilă numai pentru o radiaţie
monocromatică, în soluţii diluate (<10-2mol/l).
Creşterea concentraţiei particulelor absorbante peste o anumită limită
conduce la abateri de la legea de directă proporţionalitate

Concentraţie (c)
Aplicaţiile spectroscopiei moleculare în ultraviolet şi vizibil
Analiza calitativă se bazează pe dependența precisă care există între
gruparea funcțională sau moleculă și lungimi de undă specifice la
care speciile menționate absorb o radiație electromagnetică.
Parametrii monitorizaţi:
– prezentarea unor maxime (peak-uri) şi minime;
– intensitatea reletivă a benzilor;
– lungimile de undă corespunzătoare maximelor.

Pentru analiza calitativă pot fi folosite cataloage cu spectre etalon.


Spectrele de absorbţie pentru clorofilă şi protoporfirina IX
Analiza cantitativă sau spectrometria
Principii
• fiecare substanţă prezintă o bandă de absorbţie caracteristică, iar
determinarea absorbţiei se va face la lungime de undă λmax care
corespunde absorbţiei maxime .
• absorbţia variază direct proporţional cu concentraţia substanţei într-
un anumit interval.
Procedeul curbei etalon: constă în constituirea curbei de etalonare a
dependenţei absorbanţei în funcţie de concentraţie.

Procedeul cu o soluţie etalon = compararea absorbanței soluţiei


etalon cu absorbanţa probei de analizat;
Calculul concentraţiei din relaţia lui Beer:
c = A/εd
• Aparatură
• Pentru determinarea absorbanţei se
utiliează aparate numite spectrofotometre.
Cuvă
Radiație de referință
referință I0

Radiație de It
Sursă de Monocromator măsurat Cuvă
radiații
probă
Sursa de radiaţii
VIS – lampă cu filament de wolfram
UV – lampă cu descărcare în hidrogen sau deuteriu; lampă cu
vapori de mercur.
Monocromatorul - are rolul de a separa radiaţia policromatică în
radiaţii monocromatice şi de a selecta radiaţia monocromatică
adecvată – prisme de cuarţ (UV şi VIS) sau sticlă (VIS).
Detectorul – celule fotoelectrice (VIS) sau fotomultiplicatoare (UV-VIS)
Spectroscopia de absorbţie atomică (AAS)
• Este o metodă de determinare a concentraţiei unui element chimic, prin
măsurarea absorbanței unei radiaţii luminoase caracteristice, de către atomii
elementului aduşi în stare gazoasă.
• Atomii absorb o cuantă de lumină şi trec în stare excitată:
A + hν  A*
• Absorbţia radiaţiei respectă legea Beer:
A=k∙ N∙ d
unde,
N – numărul de atomi din unitatea de volum;
d – grosimea stratului de substanţă.
k – constantă de proporţionalitate.
În AAS se analizează absorbanţa radiaţiei, care este proporţională cu
concentraţia.
Spectroscopia de absorbție atomică implică existența a trei etape:
1. atomizarea probei;
2. absorbția unei radiații specifice de la o sursă de lumină construită din
elementul ce urmează a fi analizat, de către atomii aflați în stare
gazoasă;
3. determinarea absorbanței și calcularea concentrației analitului.
Aparatură

Hollow chatode lamp


Tehnici de atomizare în AAS
• AAS cu flacără: proba este aspirată într-un arzător cu o flacără
generată de un gaz combustibil (acetilenă, hidrogen, gaz natural) şi
un gaz oxidant (aer, oxigen, NO).

Combustibil Oxidant Temperatură (0C)


Gaz natural Aer 1700 – 1900
Hidrogen Aer 2000 – 2100
Acetilenă Aer 2100 – 2400
Acetilenă NO 2600 – 2800
Acetilenă Oxigen 3050 – 3150
• AAS cu cuptor de grafit: foloseşte un tub de grafit in care se
pipetează proba; tubul este încălzit la exteriror la temperaturi
ridicate.
Sursa de radiaţii – lampă cu catod scobit (Hollow catod lamp – HCL)

Catodul – este constituit din elementul ce urmează a fi analizat


Anodul – tungsten
Există şi lampi multielement!
Exemplu, lampa pentru elementul Al
Spectrofotometru AAS

Lămpi cu
catod
scobit
Avantajele utilizării AAS
• Permite determinarea a 68 de metale din aer, sânge, urină, carne, păr,
lapte, apă, sol, cereale, şampoane, ulei, sedimente etc.
• Decelează metale aflate în concentrţii de ppm.
• Precizia determinărilor în flacără este mai mică de 1%.
• Interferenţe sunt foarte mici şi deja studiate.
• Proba se prepară foarte uşor prin dizolvare în acid.
• Instrumentul este foarte uşor de manipulat.
Spectroscopia de emisie atomică (AES)
Absorbţia de energie termică de către un atom, determină trecerea atomului
din starea fundamentală (A) într-o stare excitată (A*). Această trecere se
produce datorită tranziţiilor electronice de pe straturi cu energie joasă pe
straturi cu energie înaltă. Atomii excitaţi revin la starea iniţială prin emisia
unei cuante de lumină hν.

A + energie termică → A* → A + hν

Cu Li Sr Na Be K
Principii:
• atomii fiecărui element sunt caracterizaţi prin linii spectrale specifice;
• intensitatea fiecărei linii spectrale depinde de concentraţie, fiind
direct proporţională cu concentraţia.
Culoarea dominanată

Spectrul de emisie al K încălzit la bec Bunsen


Etape de realizare:
• atomizarea probei şi excitarea atomilor în vederea emisiei de radiaţii;
• separarea spectrală a radiaţiilor emise şi determinarea intensităţii lor;
• compararea radiaţiilor emise cu liniile caracteristiceale ale unor probe standard în
care elementele corespunzătoare se găsesc în concentraţii cunoscute.
1. Emisia în flacără
Excitarea atomilor se realizează în flacără

COMBUSTIBIL OXIDANT TEMPERATURĂ OBSERVAŢII

Propan Aer Temperatura scăzută determină excitarea unor


1900°C atomi uşor excitabili ca: Na, Li, K şi Ca.
Butan Aer
Temperatură medie corespunzătoare majorităţii
Acetilenă Aer 2300°C emisiilor; se pot excita şi atomii de Mg, Mn
şi Sr.

Temperatura ridicată determină excitarea


Acetilenă Oxid de azot 3000°C elementelor refractile ca P.

Principala aplicaţie a emisiei în flacără este determinarea cantitativă a


elementelor alcaline şi alcalinopământoase la concentraţii având limita
inferioară la 0,1 µg/ml.
Hollow chatode lamp
2.Emisia în plasmă
– Plasmă cuplată inductiv (the inductively coupled plasma – ICP) (AES – ICP)
– Plasmă în curent direct (the direct current plasma – DCP) (AES – DCP)
– Plasmă indusă de microunde (the microwave induced plasma – MIP) )AES-
MIP).
A typical inductively coupled plasma source called
Schema de principiu pentru ICP-AES
a torch

Utilizări
Determinarea metaleleor în băuturi şi alimente;
Determinarea metalelor în aer, sol apă, uleiuri industriale, cenuşă;
Determinarea metalelor in sânge, urină, oase;
În criminalistică pentru a identifica locul crimei;
Analiza uleiurilor de motor pentru a stabili timpul de viaţă al unui ulei;
Cercetarea spaţiului la NASA.
Element Concentraţia minimă Concentraţia minimă
în flacără (μg/mL) în ICP (μg/mL)
Ag 2 0,2
As 2000 2
Ca 0,1 0,0001
Cd 300 0,07
Hg 150 1
K 0,001 30
Na 0,01 0,1
Mg 1 0,003
Pb 0,2 1
Pt 2000 0,9
Sn 100 3
Zn 1000 0,1
Spectroscopia în infraroşu (IR)
Radiaţiile infraroşii induc vibraţii moleculare puternice la nivelul
legăturilor covalente.
• Legăturile covalente pot vibra în diferite moduri: alungire, oscilare,
forfecare.
• Cele mai utilizate benzi din IR corespund frecvenţelor de alungire.
Exemplu:
Când hexanona este iradiată cu IR, carbonilul va absorbi radiaţia cu
lungimea de undă 5,83x10-6 m şi o energie de 4,91 kcal/mol şi va
trece într-o stare vibraţională excitată.

Energia de 4,91 kcal/mol este aceeaşi cu energia asociată frecvenţa


liniei de absorbţie. Într-o secundă, legătura carbonil vibrează înainte
şi înapoi de 5,15x1013, adică are frecvenţa 5,15x1013 Hz. Moleculele
excitate revin rapid în starea iniţială.
Instrumentul utilizat, numit spectrofotometru IR decelează tranziţia
vibraţională deoarece frecvenţa de alungire a grupării carbonil,
5,15x1013Hz s-a modificat:

Spectrul obţinut pentru hexanonă va fi:


Rezultă că:
- Proba de analizat va absorbi numai frecvenţe specifice, iar restul
frecventelor vor fi transmise (lumina transmisa).
- Detectorul detectează frecvenţele transmise dar poate reda şi
frecvenţele absorbite.
Absorbanţă 0 la frecvenţa corespunzătoare = transmisie 100%.
Spectrul IR poate reprezenta:
a) Absorbanţa în funcţie de lungimea de undă (sau de frecventa
radiaţiei)
b) Transmisia în funcţie de lungimea de undă (sau de frecventa
radiaţiei)
Clasificarea benzilor de absorbţie în IR
a) Slabe
b) Medii
c) Puternice
Legături active în IR

Nu toate legăturile chimice produc benzi de absorbţie în spectrul IR.


Legăturile active în IR sunt cele polare.
Intensitatea benzii depinde de intensitatea momentului de dipol
asociată cu următorii factori:
- Legăturile polare puterice (ex., C=O) produc benzi puternice;
- Legăturile polare medii şi asimetrice produc benzi medii;
- Legăturile cu polaritate scăzută şi simetrice produc benzi medii sau
nu produc benzi observabile in IR.
Forma benzilor în IR

• Cele mai comune benzi sunt:


a) Înguste – subţiri si punctate, ca un pumnal
b) Late
Ex de bandă lată – banda de absorbţie a grupării O – H din alcooli şi
gruparea carboxil.
Informaţii oferite de spectrul IR

- Prezenţa sau absenţa unor grupări funcţionale


- Constituie o amprentă moleculară pentru compararea probelor .
Dacă două probe pure dau acelaşi spectru rezultă că reprezintă
aceeaşi substanţă.
- Spectrul IR nu oferă date referitoare la formula moleculară sau
structurală. Acesta oferă informaţii referitoare la fragmente din
structura moleculară, în special la grupări funcţionale.
Domenii de absorbţie în IR

Numărul de undă se notează cu ν, se exprimă în cm-1, şi reprezintă numărul de


unde dintr-un cm.
ν = 1/λ

ν (cm-1) = [1/λ (μm)] x 105


Regiunea amprentei

Pentru compararea moleculelor se poate utiliza domeniul 600 – 1400


cm-1(regiunea fingerprint). Această regiune prezintă un număr mare
de benzi, uneori suprapuse. Regiunea amprentei este specifică
pentru fiecare moleculă. Datorită complexităţii această regiune este
eludată de către începători.
Focus your analysis on this region. This is where most stretching Fingerprint region: complex and difficult to
frequencies appear. interpret reliably.

Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
Exemple de spectre IR pe funcţiuni organice
• Alcani: benzi pentru vibraţie de valenţă C – H : 3000 cm-1
– Benzi de deformare angulară a legăturii C – H : 1300 – 1500 cm-1

Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 5th ed. Pearson Education Inc., 2003
Alchene
Benzi datorate deformărilor de valenţă: C = C la 1600 – 1700 cm-1 şi
=C – H la 3080 cm-1
Deformare angulară C – H la 1300 – 1500 cm-1.

Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 5th ed. Pearson Education Inc., 2003
Banda pentru = C – H – poate fi obscură dacă legătura
dublă se află în interiorul moleculei

Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
• Alchine

Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
Nitrili
C ≡ N: in jur de 2250
Alcooli
O – H: 3000 – 3700 cm-1
Aldehide şi cetone

Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
Acizi carboxilici
O – H: 2800 – 3500 cm-1
C = O: 1710 cm-1
Amine
N – H: 3200 – 3600 cm-1
Amide
N – H: 3100 – 3500 cm-1

C = O: 1710 cm-1
NIR, MIR şi FIR
• NIR (infraroşu apropiat) este porţiunea spectrului cuprinsă între 700 şi 2500 nm
(13.000 – 4000 cm-1) – este lumina dintre VIS şi IR. Absorbţia abservată în NIR
este reprezentată de spectre sau combinaţii ale benzilor fundamentale de alungire
datorate uyual alungirii legăturilor C – H, N – H sau O – H.
• MIR (infraroşu mijlociu) NIR (infraroşu apropiat) 2500 – 25000 nm (4000 – 400
cm-1).
• FIR (infraroşu îndepărtat) 400 – 100 cm-1. spectrul obţinut este limitat şi oferă
informaţii referitoare la moleculele care conţin atomi ai metalelor grele, vibraţia
scheletului molecular, torsiuni moleculare şi vibraţia reţelelor cristaline dintr-un
cristal.

Spectroscopia IR se utilizează în:


• analiza calitativă – identificarea moleculelelor organice
• analiza cantitativă – cunoscând transmisia se determină absorbanţa şi apoi dein
legea Lambert Beer concentraţia:
A = - lg T A = εcd
Spectroscopia de masă
(Mass spec sau MS)
Spectrometria de masă este o tehnică analitică utilizată pentru:
• Identificarea compuşilor necunoscuţi dintr-o probă;
• Elucidarea structurii şi proprietăţilor chimice ale diferitelor molecule.
Etape:
- Conversia probei în ioni gazoşi (cu sau fără fragmentare);
- Caracterizarea după raportul masă/sarcină (m/Z).
Tehnica se bazează pe studiul efectului energiei de ionizare asupra
moleculelor şi este dependentă de reacţiile în fază gazoasă în care
moleculele probei sunt consumate pentru a forma specii ionice sau
neutre.
Spectrometria de masă utilizează electroni de energie înaltă pentru a
rupe moleculele în fragmente.
Separarea si analiza fragmentelor oferă informaţii referitoare la:
 masa moleculară
 structura moleculelor dintr-o probă.
Dacă o moleculă de metan este bombardată cu un curent de electroni
de energie înaltă, molecula va pierde un electron şi se va transforma
într-un radical cation (o specie cu un electron neîmperecheat şi cu
sarcină pozitivă):

H H
I I
H – C – H + e‾ → H – C +•H + e‾
I I
H H
Ion molecular (M+)
(m/Z) = 16

Produsul de reacţie este un ion molecular sau radical cation cu masa


moleculară (m)16 şi sarcina (Z) 1.
Dacă molecula este mai complexă, numărul fragmentelor este mai mare. De
exemplu, în cazul etanului rezultă:

H H H H
I I I I
H – C – C – H + e‾ → m/Z = 30
H – C – C +• H
I I I I
H H H H
H H
I I
H – C – C + + H• m/Z = 29
I I
H H
H H
I I
H–C+ + •C – H
I I
m/Z = 15 H H m/Z = 0
(nedetectabil de MS)
=> În urma bombardării cu electroni a unei molecule rezultă:
 Ionii moleculari sau ioni parentali (M+)– au masa moleculară egală cu
masa moleculară a substanţei din care provin, şi au (în general cea mai
mare masă din spectru).
H H H
I I I
H – C +•H H – C – C +• H
I I I
H H H

 Cationi – au mase mai mici decât masa substanţei din care provin.

H
I
H–C+
I
H
Exemplu, spectrul de masă al acetonei (M = 58):

M+
Spectrul de masă al bromoetanului (M = 118, pentru 79Br şi 120 pentru
81Br)
Cationii formaţi sunt separaţi prin deflexie cationică (deviaţie cationică)
Tipuri de detectori pentru MS
- Detectorul cu cupă Faraday
Principiul – dinoda
(electrod CsSb, GaP sau
BeO, aflat in tub vidat,
emite electroni care
produc un curent electric.
Curentul este amplificat şi
înregistrat

- Detectorul cu multiplicare de electroni


Principiul – ionul loveşte
dinoda şi produce emisia
câtorva electroni care vor
lfi atraşi de altă dinodă ce
va emite mai mulţi
electroni suplimentari, şi
aşa mai departe.

http://www.sec.psu.ac.th/web-board/?pid=view_replies&thread_id=580&forum_id=7
- Detectorul cu fotomultiplicator sau cu numărător de scintilaţii

Principiul – ionii lovesc


dinoda şi generează emisie
de electroni. Electronii
lovesc un ecran de fosfor
care eliberează un fascicol
de fotoni care trec într-un
fotomultiplicator.
• În MS sunt detectaţi numai cationii; radicalii nu sunt
detectaţi.
• Numărul de ioni deflexaţi în câmp magnetic este
dependent de raportul m/Z. Majoritatea ionilor au
sarcina +1, din acest motiv, factorul determinanat este
masa ionului.
• Spectrul de masă este reprezentarea grafică a masei
în funcţie de abundenţa ionilor;
• Abundenţa peak-urilor este exprimată în procente
din peak-ul de bază (cel mai intens peak din spectru).
• Peak-ul de bază nu este întotdeauna un peak
parental.
Exemplu, spectrul de masă al etanolului:

Peak-ul de bază

M+

SDBSWeb : http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/ (National Institute of


Advanced Industrial Science and Technology, 11/1/09)
• MS permite recunoaşterea rapidă a elementelor
chimice.
Exemplu:din spectrul de masă al cianurii de metil se poate
deduce peak-ul elementului N:
+
M = 41

N+

SDBSWeb : http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/ (National Institute of


Advanced Industrial Science and Technology, 11/2/09)
• MS permite decelarea izotopilor unui element

• Majoritatea elementelor se găsesc în natură sub


formă de amestecuri de izotopi.
Prezenţa semnificativă a izotopilor cei mai grei
conduce la peak-uri mici cu mase mai mari
decât peak-ul ionului parental.
• M+1 – un peak care are masa mai mare cu o
unitate decât M+;
• M+2 – un peak care are masa mai mare cu 2
unităţi decât M+;
Exemplu 1: spectrul de masă al 2-bromopropanului are peak-ul
parental (M+), corespunzător cationului cu izotopul 79Br şi un peak
M+2, corespunzător cationului cu 81Br. Elementul brom în stare
naturală este constituit din 79Br (50,5%) şi 81Br(49,5%).

2-bromopropan

M+ ~ M+2

SDBSWeb : http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/ (National Institute of Advanced Industrial


Science and Technology, 11/1/09)
Exemplu 2: Elementul Cl are 2 izotopi: 35Cl şi 37Cl, în raport atomic 3:1;
în spectru de masă al clorobenzenului apare un peak
corespunzător M+ şi un peak corespunzător M+2, cu înălţimea 1/3
din înălţimea peak-ului M+.

SDBSWeb : http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/ (National Institute of


Advanced Industrial Science and Technology, 11/2/09)
• MS permite determinarea structurii substanţelor
Principii:
- Curentul de electroni de energie înaltă rupe molecula
în fragmente, cel mai adese într-un cation şi un
radical.
- Ruperea legăturilor se face în aşa fel încât să se
genereze cel mai stabil cation.
- Stabilitatea radicalului nu este importantă.
ALCANI
Fragmentarea alcanilor conduce, în general, la
următorii cationi:
- Metil – M+ = 15;
- Etil – M+ = 29
- Propil – M+ = 43
- Butil – M+ = 57
Alcanii fragmentaţi tind să formeze cel mai stabil
carbocationi.
Exemplu 1. Spectrul de masă al 2-metilpentanului
ALCHENE
Fragmentarea specifică conduce la carbocationi alilici cu
formule de rezonanţă stabile
Spectroscopia de fluorescenţă (FS)
Este o combinaţie între procesele de absorbţie şi emisie a luminii.
Procesul de fluorescenţă constă în absorbţia unei radiaţii luminoase de
către o specie moleculară aflată în stare fundamentală (M), trecerea
într-o stare excitată (M*) şi revenirea speciei moleculare la starea
fundamentală. Revenirea (relaxarea) la starea fundamentală se face
rapid (10-6 – 10-8 s) prin emisia unei radiaţii de lungime de undă mai
mare (energie mai mică). Procesul de relaxare are loc după cedarea
energiei de coliziune moleculelor solventului sau altor molecule din
mediu de reacţie.

M + hλ → M* → M + hλ1 (λ < λ1)


79
 Lumina emisă prezintă următoarele caracteristici
1. Are o lungime de undă mai mare (energie mai mică) decât lumina de
excitare, deoarece o parte din energiea asociată cu starea M* este
pierdută ca energie termică.
2.Lumina emisă este compusă din radiaţii cu mai multe lungimi de undă
care generează spectrul de fluorescenţă.
Intensitatea fluorescenţei este exprimată în cantitate de lumină emisă
(quantum yield), Q. Q reprezintă raportul dintre numărul de fotoni emişi
şi numărul de fotoni absorbiţi
 Unele molecule sunt intrinsec flourescente (fluorofori endogeni), sunt
ele însele fluorescente:
 aminoacizii aromatici (Phe, Tir, Trp) şi proteinele care conţin aceşti
aminoacizi;
 Bazele azotate purinice si pirimidinice
 Coenzimele NAD+ şi FAD;
 Lipidele
Fluorescenţa acestor molecule este utilizată pentru a studia
modificările conformaţionale ale proteinelor, situsurile active şi
coenzimele enzimelor.
Fluoroflorii endogeni sunt excitaţi cu radiaţii luminoase cu lungimi de
undă cuprinse între 250 -450 nm şi emit radiaţii cu lungimi de undă
cuprinse între 280 – 700 nm.
IV. Biological Fluorophores
–Endogenous Fluorophores
amino acids
structural proteins
enzymes and co-enzymes
Fluoroflorii endogeni sunt excitaţi
vitamins
cu radiaţii luminoase cu lungimi de
undă cuprinse
lipids între 250 -450 nm şi
emit radiaţii cu lungimi de undă
între 280 – 700 nm.
porphyrins
cuprinse

–Exogenous Fluorophores
Cyanine dyes
Photosensitizers
Molecular markers – GFP, etc.
 Substanţele extrinsec fluorescente (fluorofori exogeni) sunt
molecule fluorescente care se adaugă în sistemele biologice pentru
a crea fluorescenţă.

Celulă umană colorată cu o


substanţă extrinsec fluorescentă
Exemple de substanţe extrinsec fluorescente:

84
Fluorofor Absorbţie (nm) Emisie (nm)

1,8 ANS 336 490


Clorura de dansil 372 518
Fluoresceină 490, 494 520, 525
AMC 345 445
Bromură de etidiu 510, 523 595, 605
Acridine orange ADN + ARN 440-480 520-650
 ANS, clorura de dansyl şi fluoresceina - proteine;
 Etidium, proflavina şi acridinele - acizi nucleici,
 Bromura de etidiu intensifică fluorescenţa atunci când se
legă de ADN dublucatenar, dar nu o intensifică atunci
când se legaă de o singură catenă ADN.
Aparatul utilizat se numeşte spectrofluorimetru.
Acesta conţine:
- Sursă de lumină – lampă de Xe (emite in UV, VIS şi NIR)
- 2 monocromatoare
- Cuvă pentru probă (cuarţ sau sticlă)
- Detector
Detectorul se află poziţionat la un unghi de 900, faţă de sursa de
lumină.
După excitare fluorescenţa este emisă în toate direcţiile şi este
detectată de fotocelulă în unghi drept faţă de fascicolul de excitare.
În FS se analizează lumina emisă după excitare!
88
FS – se utilizează pentru determinarea contaminării cu
fecale a apei şi alimentelor, determinarea prezenţei în
alimente a unor molecule rezultate din metabolizarea
unor medicamente administrate la animale,
monitorizarea pesticidelor şi erbicidelor din alimente,
verificarea autenticităţii uleiurilor etc.
Spectroscopia prin chemiluminiscenţă (CS)
Chemiluminiscenţa este emisia de lumină, ca rezultat al unei reacţii
chimice.
Exemplu:

CH3 – S – CH3 + F2 → Produşi + h√

CS - se bazeză pe determinarea radiaţiei emise de către speciile


atomice sau moleculare excitate printr-o reacţie chimică, pentru
a determina concentraţia analitului.
Cea mai utilizată substanţă chimică folosită în chemiluminiscenţa în fază lichidă
este luminolul. În mediu alcalin, luminolul formează luminol dianion, care, în
prezenţa oxigenului generat de peroxidul de hidrogen, se transformă într-un
peroxid organic extrem de instabil care se descompune în acid 3-aminoftalic
excitat care revine la o stare energetică inferioară (stabilă) prin emisia unei
cuante de lumină de culoare albastră h√
În reacţia:
Luminol + Cu2+ + H2O2 + Tampon NaHCO3/(NH4)2CO3, profilul emisiei
luminiscenţei este:

http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Electronic_Spectroscopy/Chemiluminescence

 Intensitatea chemiluminiscenţei scade în la 50% după 8sec.


 În condiţii identice de reacţie intensitatea chemiluminescenţei depinde de
concentraţia H2O2.
 Reacţia se poate utiliza pentru determinarea concentraţiei peroxidului de
hidrogen.
 Determinarea activităţii antioxidante a compuşilor chimici.
Aparatură
Aparatul utilizat se numes luminometru.
Aparatul nu conţine:
- sursă de excitare
- monocromator
Bioluminiscenţa – luminiscenţa produsă de licurici, unele bacterii,
unele animale marine – reacţia are loc în prezenţă de ATP şi
luciferază
Cu ajutorul luminometrului se poat determina:
• Chemiluminiscenţa bazată pe luminol
– Activitatea antioxidantă a unor extracte;
– Detectarea bacteriilor (Hem-proteinele catalizează oxidarea luminolului)
• Bioluminescenţa bazată pe enzima luciferaza
– Detectarea bacteriilor în sistemul luciferin/luciferază (valabil pentru bacteriile care
biosintetizează enzima luciferaza);

– Determinarea ATP cu lucifern/luciferază

Chemiluminiscenţa este de 100.000 ori mai sensibilă decât spectroscopia de absorbţie şi


de 1.000 ori mai sensibilă decât fluorimetria.
• Refractometria
• Indicele de refracţie poate fi utilizat pentru a confirma identitatea
unui compus, sau pentru a aprecia puritatea prin compararea
valorilor obţinute cu valorile din literatura de specialitate.
• La trecerea unei raze de lumină dintr-un mediu omogen şi
transparent în alt mediu omogen şi transparent are loc fenomenul
de refracţie.
Aparatură. Aparatele utilizate pentru determinarea indicelui de refracţie
se numesc refractomere.
Prin creşterea valorii unghiului de incidenţă, unghiul de refracţie tinde
către 900.
Valoarea unghiului de incidenţă pentru care unghiul de refracţie este
900 (nu există refracţie, raza refractată este tangentă la suprafaţa de
separare a celor două medii) se numeşte unghi critic.
La refractometru se citeşte unghiul critic (Ф1). Cunoscând unghiul critic
şi indicele de refracţie al prismei (μprismă = k) se calculează indicele
de refracţie al materialului analizat (μx ).
μx = k Ф1

De exemplu, apa pură are indicele de refracţie la 200C este 1,33.


adăugarea de sare, zahăr etc modifică indicele de refracţie, cu o
valoare dependentă de concentraţia acestor compuşi.
• Refractometria este utilizată în controlul
calităţii alimentelor pentru:
• determinarea conţinutului în zahăr, sare,
grăsimi al produselor alimentare;
• depistarea produselor alimentare
falsificate.
Polarimetria – este o metodă de analiză care se bazează pe
măsurarea unghiului de rotaţie a planului luminii polarizate.
La trecerea luminii naturale printr-o prismă Nicol are loc polarizarea
luminii, vectorul E→ va oscila într-un singur plan.

Prismă Nicol
• În funcţie de comportarea lor faţă de lumina polarizată, substanţele
şi soluţiile pot fi împărţite în două categorii:
– substanţe optic active – rotesc planul luminii polarizate;
– substanţe optic inactive – nu rotesc planul luminii polarizate.
• La trecerea luminii polarizate prin soluţia unei substanţe optic active,
planul de polarizare al razei imergente este rotit cu un anumit unghi,
numit unghiul de rotaţie al planului de polarizare.
Aparatură. Aparatul utilizat în polarimetrie se numeşte polarimetru.
• Determinările se efectuează la 200C, cu
lumina galbenă a sodiului
corespunzătoare liniei D din spectru şi se
utilizează relaţia:
[α]D20 = 100/(L ∙ c)
• L – grosimea stratului de substanţă; c–
concentraţia procentuală.

• Polarimetrele sunt utilizate pentru


determinarea conţinutului în zahăr al
produselor alimentare.
Analiza potenţiometrică
(potenţiometria)
• Oxidarea = cedare de electroni; substanţa care cedează electroni
este numită reducător şi se notează cu red.
O reacţie de oxidare se scrie astfel:
p red1 – m p e‾ → p ox1
• Reducerea = acceptare de electroni; substanţa care acceptă
electroni este numită oxidant şi se notează cu ox.
Un proces de reducere se scrie în general astfel:
m ox2 + m p e‾ → m red2
• Oxidarea şi reducerea sunt procese care decurg simultan,
alcătuind un cuplu de reacţii denumit reacţie de oxido-reducere sau
reacţie redox.
Expresia generală a unei reacţii de oxidoreducere este:
p red1 + m ox2 → p ox1 + m red2
Seria activităţii electrochimice a metalelor
• Celule electrolitice→sub acţiunea curentului
electric extern se produc reacţii chimice care nu
au loc în mod spontan
• Celulele electrochimice (pile electrice sau
elemente galvanice) →generează energie
electrică în urma unor reacţii chimice care au loc
în mod spontan.
Celulă electrolitică

Ag(s)  Ag   e 
Cu 2  2e   Cu(s)

2Ag(s)  Cu 2  2Ag   Cu(s)


Celulă electrochimică

Ag   e   Ag(s)
Cu(s)  Cu 2  2e 

2Ag   Cu(s)  2Ag(s)  Cu 2


Anozi şi catozi

Anod – au loc reacţii de oxidare


Cu(s)  Cu 2  2e 

2Cl-  Cl2 (g)  2e 

Fe2  Fe3  e 

Catod – au loc reacţii de reducere


Ag   e   Ag(s)

Fe3  e   Fe2

NO3-  10H   8e   NH 4  3H 2 O
Reprezentarea unei celule electrochimice

Cu(s)  2Ag    Cu 2  2Ag(s)


Cu Cu 2 (0.0200 M) Ag  (0.0200 M) Ag

Reacţiile care au loc în cele două


semicelule sunt:
•Semicelula cuprului - oxidare
Cu(s) → Cu2+(aq) + 2e‾

•Semicelula argintului – reducere


Ag+(aq) + e‾ → Ag(s)
Potenţial de electrod

Reprezintă diferenţa de potenţial dintre conductorul


electronic şi cel ionic.
Potenţialul de electrod este considerat tensiunea necesară unei
semireacţii de oxidare sau reducere, scrisă convenţional ca o reacţie
de reducere:

Cu2+ + 2e‾↔ Cu

Ag+ + e‾↔ Ag
Potenţialul de celulă (voltajul)

Reprezintă forţa care împinge electronii în circuitul extern al unei celule


electrochimice. Această forţă se mai numeşte şi tensiune
electromotoare.
Reprezentare convenţională a celulelor electrochimice şi
electrolitice din slide-urile 104 şi 105
Cu(s)  2Ag   Cu 2  2Ag(s)
Cu Cu 2 (0.0200 M) Ag  (0.0200 M) Ag
Celulă Oxid Red
electrochimică Anod Catod
- 0.412 V
+
Voltmetru
2Ag(s)  Cu 2  2Ag   Cu(s)
Ag Ag  (0.0200 M) Cu 2 (0.0200 M) Cu
Oxid Red
Celulă
electrolitică Anod Catode

- - 0.412 V
+
Voltmetru
Semicelula unei celule electrochimice indică participanţii la
semireacţii

Cu(s)  2Ag   Cu 2  2Ag(s)


Cu Cu 2 (0.0200 M) Ag  (0.0200 M) Ag

Semicelula Ecell  Eright  Eleft Semicelula


Ag/Ag+
Cu/Cu2+
Ecell  Ecathode  Eanode

Ecathode Ag   e   Ag(s)
Ag  (0.0200 M) Ag
Eanode Cu 2   2e   Cu(s)
Cu 2  (0.0200 M) Cu

Prin convenţie, reacţiile semicelulelor sunt scrise ca semireacţii de


reducere
Sensul curentului electric şi modificarea concentraţiilor
- Curentul circulă de la anod la catod;
- Concentraţia Cu2+ creşte, iar concentraţia Ag+ descreşte;
- Ionii din puntea de sare migrează astfel: cei negativi în semicelula
cuprului, iar cei pozitivi în cea a argintului.
-Potenţialul iniţial al celulei Cu/Cu2+(0,02M)//Ag+(0,02M)/Ag este
0,412V
-Concentraţiile soluţiilor se modifică până la atingerea echilibrului (Eleft
= Eright)
Potenţialul standard al semicelulelor se
determină cu ajutorul electrodului normal
de hidrogen!
Electrodul standard de hidrogen

2H  (aq)  2 e   H 2 (g)
H  ([H  ]  x M) H 2 (p  1.00 atm), Pt


ESHE  0.00 volt s
Potenţialul standard de celulă
Se determină prin cuplarea electrodului standard de hidrogen cu
semicelula al cărui potenţial dorim să-l determinăm.

H 2 (g)  2Ag   2H   2Ag(s)


Pt, H 2 1.0 atm  H  (a  1.00) Ag  (a  1.00) Ag
Ecell  Ecathode  Eanode   0.799V

SHE Ag (a  1.00) Ag
Potenţialele standard de electrod au fost determinate la 250C şi
tabelate.
- Exemple de potenţiale standard de electrod:
Clasificarea metodelor electrochimice de
analiză

Metode de volum – se bazează pe fenomenele


electrice care au loc într-o soluţie.
– Metode conductometrice.
Metode interfaciale – semnalul electric depinde de
fenomenele care au loc la interfaţa electrod – soluţie.
– determinarea pH-lui soluţiilor cu electrodul de pH.
Metode electrochimice interfaciale

1.Metode statice – curentul nu circulă prin celulă (ex.,


potenţiometria)
2.Metode dinamice - curentul circulă în celula
electrochimică
- metode cu curent constant (coulometria)
- metode cu potenţial controlat (voltametria)
Controlarea şi măsurarea curentului şi
potenţialului
O celulă electrochimică este constituită din:
• 2 sau mai mulţi electrozi,
• electrolit,
• sistem electronic de monitorizare;
Electrodul indicator – potenţialul este sensibil la
concentraţia analitului;
Electrod de referinţă – completează circuitul electric şi
posedă un potenţial de referinţă cu care se compară
potenţialul electrodului indicator. Potenţialul acestui
electrod rămâne constant.
Celulele electrochimice constituite dintr-un sistem cu 3
elctrozi sunt constituite din: electrod indicator,
electrod de referinţă şi electrod auxiliar.
Potenţialul joncţiunii lichidului (Ejl)
- Se dezvoltă la interfaţa a două soluţii ionice care diferă
prin compoziţie, datorită diferenţei de mobilitate a ionilor.
- Potenţialul de joncţiune a lichidelor este datorat
diferenţelor de mobilitate între ionii + şi ionii -.
- Joncţiune lichidelor o reprezintă interfaţa dintre două
soluţii ionice de electroliţi diferiţi sau dintre două soluţii
ale aceluiaşi electrolit de concentraţii diferite.
- Amplitudinea ptonţialului joncţiunii depinde de
concentraţia ionilor celor două soluţii la nivelul celor
două feţe ale interfaţei şi poate fi mai mare de 30-40 mV.
Exemplul 1. Potenţialul joncţiunii între o soluţie de HCl 0,1M şi o
soluţie de HCl 0,01M este de 33,09 mV.

Explicaţii
• La separarea unei soluţii de HCl 0,1M printr-o memebrană poroasă
de o soluţie de HCl 0,01M, are loc difuzia ionilor H+ şi Cl- din soluţia
mai concentrată către soluţia mai diluată;
• Mobilitatea H+ > Cl-;
=>Soluţia mai concentrată va dezvolta un potenţial negativ (-), iar
soluţia mai diluată un potenţial pozitiv (+);
Diferenţa de potenţial dezvoltată de-a lungul membranei se numeşte
potenţialul joncţiunii lichidului.
=> Magnitudinea potenţialului este dependentă de concentraţiile
soluţiilor.
Exemplul 2
la suprafaţa de separare dintre o soluţie de NaCl şi apă distilată apare
un potenţial de joncţiune.

• Mobilitatea Cl- > Na+


• Na+ se acumulează la suprafaţa membranei în soluţia de NaCl;
• Cl- se acumulează la suprafaţa membranei în apă.
Electrozi referinţă şi electrozi de indicatori
A. Electrozi de referinţă
Electrodul de referinţă reprezintă o semicelulă cu potenţial cunoscut;
celaltă semicelulă va indica concentraţia analitului.
Prin convenţie, electrodul de referinţă este anodul; astfel, cea mai
simplă notaţie pentru o celulă potenţiometric electrochimică este:
Referinţă // Indicator
şi potenţialul celulei va fi:
Ecelulă = EInd – Eref + Ejl
Electrodul de referinţă ideal are potenţialul stabil şi deci, orice
modificare pentru Ecelulă este atribuită electrodului indicator, şi
impicit, modificării concentraţiei analitului.
Exemple de electrozi de referinţă

Electrodul standard de hidrogen (ESH)


- Este utilizat pentru satbilirea potenţialului standard
pentru alte semicelule;
- Cele două semicelule se conectează printr-o punte de
sare;
- Reprezentarea schematică a ESH este:
Pt(s), H2 (g, 1 atm) I H+ (aq, a = 1.00)
Ecuaţia reacţiei din semicelula ESH:
2H+(aq) + 2e H2(g) Eo = 0,0 V
Reprezentare
a schematică
a ESH
Electrozii de calomel
Calomel este numele comun pentru Hg2Cl2
Este un electrod ce se bazează pe cuplul redox Hg2Cl2 – Hg:
Hg2Cl2(s) +2e‾  2Hg(l) + 2Cl- (aq)
Potenţialul electrodului Hg/Hg2Cl2 este determinat de concentraţia CI‫־‬
în echilibru cu Hg2Cl2 şi Hg.
Electrodul saturat de calomel (ESC) Electrodul
tipic ESC este format din două tuburi concentrice
de sticlă.
Tubul interior conţie: fir de Pt, pastă de Hg-Hg2Cl2,
soluţie saturată de KCl şi un mic orificiu sau fibre
de azbest (puntea de sare).
Tubul extern conţie soluţie saturată de KCl şi un dop
ceramic care permite umplerea tubului cu KCl.
Concentraţia Cl‫ ־‬este fixată de solubilitatea KCl şi
este constantă chiar dacă se evaporă o cantitate
de apă din soluţie.
Electrodul saturat de calomel (ESC) are un
potenţial de 0,2444V la 220C.
Dezavantaje: temperatura influenţează solubilitatea
KCl. La temperaturi ridicate solubilitatea creşte,
iar potenţialul de electrod descreşte.
În electrodul fără soluţie saturată de KCl,
temperatura nu interferă, dar potenţialul depinde
de concentraţia KCl.
[KCl] = 1,0 M --> potenţial = + 0.3360V
[KCl] = 0,1M --> potenţial = + 0,2683 V
Electrozii Ag/AgCl

Reprezentarea schematizată a semicelulei este:


Ag(s) | AgCl (s) KCl (xM) ||
Reacţia din semicelulă este:
AgCl(s) + e-  Ag(s) + Cl-(aq)
Potenţialul electrodului Ag/AgCI este determinat de oncentraţia soluţiei
de KCl utilizată la construirea electrodului.
KCl – soluţie saturată => potenţial +0.197 V la 250C
KCl – soluţie 3,5 M => potenţial +0.205 V la 250C
B. Electrozi indicatori
Într-o celulă electrochimică potenţiometrică, potenţialul
electrodului indicator este proporţional cu concentraţia
(activitatea) analitului.
Există două tipuri de electrozi indicatori:
1. Electrozi metalici
2. Electrozi cu membrană ion selectivă
Electrozi metalici
1.Electrozi de specia I
Sunt formaţi dintr-un fir metalic aflat cufundat într-o soluţie
de electrolit care conţine cationii săi.
Electrozii sunt de tipul M(s)/Mn+(aq)
Ecuaţia reacţiei redox produsă este:
Mn+ + ne‾→ M
• Aceşti electrozi se limitează pentru determinarea ionilor
de Ag, Bi, Cd, Cu, Hg, Pb, Sr, TI, and Zn.
• Electrozii metalici nu pot fi utilizaţi în soluţii acide
deoarece se oxidează foarte uşor.
2. Electrozi de specia II este un electrod de specia I care
răspunde la activitatea unui ion care este în echilibru cu
ionul Mn+.
Electrozii de referinţă Hg2Cl2-Hg şi Ag-AgCl sunt electrozi
de specia II
Electrozi cu membrană
În 1904 Fritz Haber a observat că atunci când o memebrană de sticlă
desparte două soluţii de aciditate diferită apare un potenţial de
membrană. Existenţa potenţialului de membrană a permis
dezvoltarea electrozilor ion selectivi.
Potenţiale de membrană
O celulă electrochimică potenţiometrică cu electrod ion selectiv conţine
doi electrozi de referinţă:
• unul imersat în soluţia internă a electrodului ion selectiv;
• Unul imersat în soluţia de analizat
Schema celulei potenţiometrice este:
Ref (probă) || [A] probă | Membrană | [A] intern || Ref intern

Potenţialul celulei este:

Ecell = E Ref (intern) – E Ref (sample) + E membrane + Ejl

Potenţialul joncţiunii lichidului (Ejl) şi potenţialul electrodului de referinţă


sunt constante, astfel că orice modificare de potenţial în celulă este
atribuită potenţialului de membrană.
Curentul care traversează membrana apare datorită mişcării fie a
analitului fie a altui ion prezent în matricea membranei.
Selectivitatea membranei
- Membrană participă selectiv la schimbul de ioni cu soluţia de
analizat, pe faţa cu care vine în contact cu soluţia:

A+soluţie + M+membrană ↔ A+membrană + M+soluţie

Selectivitatea schimbului ionic depinde de compoziţia şi structura


membranei. Numai ionii cu un anumit volum şi o anumită sarcină
electrică pot participa la schimbul ionic. Schimbul ionic are loc şi pe
faţa care vine în contact cu soluţia de referinţă internă. La echilibru
există o concentraţie superficială de ioni pe cele două feţe ale
membranei. O faţă a membranei va fi încărcată pozitiv iar o faţă
negativ. Potenţialul membranei (Em) depinde de concentraţia ionilor
care au participat la schimbul ionic.
Electrod de referinţă
intern Ag/AgCl

Electrolit de referinţă
intern

A+ Membrană ion-
selectivă
(-)
Em A+ Soluţie de analizat
(+)

C-, B+
Electrodul cu membrană de sticlă
• Membrana de sticlă este permeabilă pentru
ionii H+.
• Construcţie:
– Balonaş de sticlă în care se află o soluţie de
referinţă internă de HCl 0,1M (pH = 0),
saturată cu AgCl;
– Electrod de referinţă internă Ag/AgCl,
cufundat în soluţia de HCl 0,1M;
– Sticla conţine aproximativ: 22%Na2O, 6%CaO
şi 72%SiO2.
– La imersarea în soluţie apoasă 10 nm din
suprafaţa memebranei se hidratează şi
formează situri încărcate negativ: -SiO‫; ־‬
– Ionii Na+ servesc ca numărător de ioni
deoarece H+ se leagă mai puternic de SIO-
decâr de Na+, înlocuind Na+:
H+ + SiO‫־‬Na+ → SiO‫־‬H+ + Na+
Electrodul de sticlă este utilizat, în general, pe
domeniul de pH 0,5 – 9. la pH mai mare se
memebrana răspunde mai puternic pentru alţi
cationi, cum sunt Na + şi K +.
In funcţie de pH, ionii de hidrogen migrează spre electrod sau în afara
electrodului.

Înlocuirea Na2O şi CaO cu Li2O şi BaO face electrodul utilizabil până la pH 12.
Determinarea pH-lui cu electrodul de stică
Electrodul de sticlă şi electrodul de referinţă se introduc în soluţia de
analizat, realizând o celulă potenţiometrică de forma:

Diferenţa de potenţial dintre cei doi electrozi este convertită în unităţi de


pH.
Electrodul de sticlă combinat

Acest electrod conţine într-un


singur cilindru electrodul de
referinţă şi electrodul cu
membrană de sticlă.
Electrodul este utilizat pentru
determinarea pH-ului
Alţi electrozi de sticlă
Dacă se schimbă compoziţia membranei de sticlă, membrana devine
selectivă pentru alţi cationi:
• 11%Na2O, 18%Al2O3, 71%SiO2 – selectivitate pentru Na+;
• 15%Li2O, 25%Al2O3, 60%SiO2 – selectivitate pentru Li+;
• 27%Na2O, 5%Al2O3, 68%SiO2 – selectivitate pentru K+;
Electrozi ion selectivi cu membrană de sticlă
Membrana = sare policristalină anorganică sau un singur cristal al unei
sări anorganice.
Membrana de sticlă conferă selectivitatea electrodului.
Exemple de membrane de sticlă şi analiţii pe care îi cuantifică
Electrozi ion selectivi cu membrană lichidă

Conţine o memebrană hidrofobică


care conţine un agent organic de
complexare lichid, selectiv.
Se utilizează trei tipuri de lichide
organice: schimbători de cationi,
schimbători de anioni, şi ionofori
neutri.
De exemplu, pentru electrodul Ca2+
selectiv se utilizează o membrană
poroasă saturată cu di(n-decil
fosfat).
Reprezentarea schematică a electrodului selectiv pentru Ca2+
Exemple de membrane lichide
Electrozi cu memebrane sensibile pentru gaze
Electrozi cu enzime imobilizate (Biosenzori)

Exemplu, biosenzorul pentru uree cu


urează imobilizată
Uree + urează →NH4+

NH4+(aq) + H2O (l) → H3O+(aq) + NH3 (aq)

În urma reacţiei se modifică pH-ul soluţiei.


Exemple de biosenzori potenţiometrici
Metode de separare
Cromatografia
• Cromatografia este o metodă de analiză care se
bazează pe separarea în zone spaţiale distincte a
componenţilor unui amestec, la trecerea amestecului
printr-un mediu prin care componenţii se deplasează cu
viteze diferite.
• În cromatografie există două faze nemiscibile:
– Faza staţionară = materialul prin care circulă proba şi
care asigură separarea;
– Faza mobilă (eluentul) = amestecul lichid sau gazul
care transportă proba prin faza staţionară.
Clasificarea metodelor cromatografice
1. După starea de agregare a celor două faze:
Faza staţionară Faza mobilă Tip de cromatografie
Lichid (L) Gaz (G) Lichid – gaz (CLG)
Lichid (L) Lichid (L) Lichid – lichid (CLL)
Solid (S) Gaz (G) Solid – Gaz (CSG)
Solid (S) Lichid (L) Solid – Lichid (CSL)

2. După mecanismul de separare metodele cromatografice


pot fi clasificate astfel:
• cromatografie de adsorbţie;
• cromatografie de partiţie;
• cromatografie de schimb ionic;
• cromatografie de excludere moleculară;
• cromatografie de afinitate.
• Cromatografia de adsorbţie - se bazează pe adsorbţia
diferenţiată a componenţilor unui amestec pe un suport
adsorbant solid (faza staţionară). Între suportul adsorbant şi
substanţele care se deplasează se stabilesc interacţiuni
intermoleculare de tipul: dipol-dipol, van der Waals, legături
de hidrogen.

Componenetul adsorbit puternic (A) se deplasează mai greu iar


componenetul adsorbit mai slab (B) se deplasează mai
repede.
• Cromatografia de partiţie - se bazează pe coeficienţii
de partiţie diferiţi ai componentelor unui amestec în două
faze nemiscibile sau parţial miscibile.

Componenetul cu solubilitate mare în faza staţionară (A) se


deplasează mai greu iar componenetul cu solubilitate mare în
faza mobilă (B) se deplasează mai repede.
• Cromatografia de schimb ionic - utilizează o
răşină schimbătoare de ioni (faza staţionară
solidă) care conţine grupări ionizabile legate
covalent.
• Răşinile schimbătoare de ioni (schimbătorii de
ioni) sunt substanţe care au proprietatea de a
schimba un ion propriu cu un alt ion din mediul
lichid cu care aceste substanţe se găsesc în
contact.
• Clasificare:
• 1. cationiţi (schimbători de cationi)
• 2.anioniţi (schimbători de anioni).
Cationiţii conţin grupări funcţionale cu caracter slab acid
sau puternic acid şi au proprietatea de a schimba ionul
H+ cu un cation din mediul lichid cu care se află în
contact.
Anioniţii conţin în structura lor grupări funcţionale cu
caracter slab bazic sau puternic bazic şi au proprietatea
de a schimba ionul HO- cu un anion din mediul lichid cu
care se află în contact.
Cromatografia de excludere moleculară , numită şi gel-
filtrare, utilizează ca fază staţionară anumite substanţe
polimerice (dextran, poliacrilamidă) care în contact cu
apa sau cu soluţii saline se îmbiba formând geluri de
diferite porozităţi.
Sub acţiunea fazei mobile (eluentul) moleculele cu
dimensiuni mai mari decât cele ale porilor vor fi excluse
de structura gelului şi se vor deplasa concomitent cu
eluentul. Moleculele cu dimensiuni mici vor penetra gelul
pătrunzând în lichidul din interiorul porilor gelului şi
astfel eluţia lor prin coloană va fi încetinită. În acest mod,
eluţia componenţilor se va face în ordinea descrescândă
a masei moleculare
Cromatografia de afinitate - reprezintă o tehnică de
separare a proteinelor, acizilor nucleici, celulelor, pe
baza proprietăţilor lor de legare specifică, prin forţe
necovalente, de molecule complementare numite ligand.
Tehnici cromatografice
Cromatografia în fază gazoasă
Analiţii, aflaţi în stare de agregare gazoasă sau aduşi în
stare gazoasă prin vaporizare, trec printr-o coloană
cromatografică în care se află faza staţionară, sub
acţiunea fazei mobile care este un gaz. Separarea
analiţilor în timp şi spaţiu se realizează pe baza
adsorbţiei sau partiţiei diferite acestora în faza
staţionară.
Cromatografia în fază gazoasă se realizează cu un aparat
special numit gaz-cromatograf.
Compartiment
termostatat

Schema de principiu a unui gaz-cromatograf


•Gazul purtător – H2, He, Ar sau N2
•Proba – gazoasă sau lichidă. În cazul probei lichide, componeneţii
trobei trebuie să fie volatili şi stabili termic la temperatura injectorului
şi în condiţiile separării cromatografice (20 – 4000C).
Tipuri de coloane
- Coloane umplute – coloane metalice sau silice topită cu diametrul de
ordinul mm şi lungimea de 1m, umplute cu faza staţionară depusă
pe suport inert;
- Coloane capilare
- WCOT (wall coated open tubular) diametru 0,5 – 1 mm, lungimea 100m;
faza staţionară este depusă pe peretele coloanei.
- SCOT (support coated open tubular) diametru 0,5 – 1 mm, lungimea
100m; faza staţionară e depusă pe particule suport.

Particule de
Perete
suport
Strat
imobilizat

SCOT
WCOT
Faza staţionară în cromatografia solid – gaz (GSC) – material
adsorbant: silice (SiO2), alumină (Al2O3), C grafitizat. După
mecanismul de separare in acest caz avem cromatografie de
adsorbţie.
Faza staţionară în cromatografia lichid – gaz (GLC) – lichide cu
aspect de clei sau gumă (trimetilclorsilan, hexametil disilazan),
depuse pe suport inert. După mecanismul de separare GLC este
cromatografie de partiţie.
Detectori în GC – solutul eluat din coloană interacţionează cu
detectorul. Detectorul transformă interacţiunea în semnal electric pe
care îl trimite în sistem. Reprezentarea grafică a magnitudinii
semnalului în funcţie de timp (momentul 0 = momentul injecţiei)
reprezintă cromatograma generată.
- Detectorul cu ionizare în flacără
- Detectorul azot fosfor
- Detectorul cu captură de electroni
- Detectorul cu conductibilitate electrică
- Detectorul flamfotometric
- Detectorul de chemiluminiscenţă
Detectorul cu ionizare în flacără
Principiul – o substanţă organică
generează electroni la combustie şi se
transformă în ioni. Ionii formaţi lovesc
colectorul şi generează un semnal.
Utilizări – analiza compuşilor organici
cu legături C – H.

Principiul – compuşii sunt arşi în


Detectorul azot fosfor plasma creată în jurul unui pat de
rubidiu, susţinută cu hidrogen şi aer.
Compuşii cu N şi P produc electroni
care sunt atrşi de colector. Ionii formaţi
lovesc colectorul şi generează un
semnal.
Utilizări – analiza compuşilor organici
cu N şi P (ex., pesticide
organofosforice şi carbamat –
NH2COOH).
Detectorul cu captură de electroni
Principiul – electronii generaţi de o
sursă radioactivă (63Ni)produc un
curent electric în celulă. Atomii
electronegativi rezultaţi din probă
captează electronii şi reduc curentul
electric.
Utilizări – analiza compuşilor organici
cu halogeni şi azot (ex., pesticide
organoclorurate şi carbamat).
Detectorul cu conductibilitate termică
Principiul – un fir metalic încălzit
pierde căldură cu o viteză determinată
de compoziţia gazului înconjurător.
Modificarea temperaturii determină
modificarea conductibilităţii electrice a
firului.
Utilizări – analiza tuturor compuşilor.
Detectorul flamfotometric
Principiul – compuşii sunt arşi într-o
flacără cu hidrogen. Sulful şi fosforul
din compuşi emit radiaţii luminoase (S
– 394 nm, P – 526 nm) care ajung pe
un fotomultiplicator (FMT).
Utilizări – analiza compuşilor cu S şi P.

Detectorul de chemiluminiscenţă
Principiul – compuşii care
reacţionează cu fluorul produc
chemiluminiscenţă.
Utilizări – analiza compuşilor care
produc chemiluminiscenţă cu F2.
Documentul obţinut se numeşte cromatogramă.

• Numărul de peak-uri = nr compuşilor separaţi;


• Înălţimea peak-ului – proporţională cu concentraţia analitului;
• Timpul de retenţie – indică poziţia peak-ului.
Analiza calitativă
Timpul de retenţie (tR) reprezintă o mărimă caracteristică pentru fiecare
solut eluat şi este timpul scurs de la injectarea analitului în injector
până la înregistrarea vârfului peak-ului de eluţie a acestuia.
Se compară timpii de retenţie ai soluţilor eluaţi cu timpii de retenţie ai
unor etaloane.
Analiza cantitativă
Se calculează aria fiecărui peak, prin asimilarea fiecărui peak cu un
triunghi.
Cunoscând suma ariilor, ΣA, şi aria fiecărui peak (Ax) se calculează
compoziţia procentuală a fiecărui solut (Cx):

%Cx = ΣA∙100/Ax
Gaz cromatografia cuplată cu spectrometria de masă (GC/MS)
Se realizează legătura HPLC → MS. Solutul eluat trece din coloana
cromatograficî în spectrometrul de masă (MS), iar ionii rezultaţi sunt
detectaţi de detectorul MS.
Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC)
Aparatură. Instrumentul utilizat se numeşte HPLC.
Un HPLC tipic este alcătuit din:
- rezervor pentru faza mobilă,
- pompă,
- injector,
- coloană cromatografică,
- detector şi
- înregistrator.

https://www.shodex.com/en/kouza/a.html
Pompa – asigură curgerea eluentului prin coloana cromatografică şi asigură
presiunea înaltă în sistem.
Injectorul - este plasat după pompă şi cu ajutorul unei seringi proba este
introdusă în fluxul eluentului.
Coloana cromatografică - este confecţionată din oţel inoxidabil. Coloana este
umplută cu silica gel, geluri polimerice sau alte geluri, cu dimensiunea
particulei cuprinsă între 3 şi 15 μm, sau chiar mai mici.
- Coloanele cu fază inversată. În cromatografia cu fază inversată gelul are
polaritate scăzută iar eluentul polaritate înaltă (apă, acetonitril).
- Coloanele ODS – sunt din silicagel modificat cu radicali octadecil (nepolari)
→coloane octadecilsilica (ODS sau C18). 80% din coloanele HPLC sunt
coloane C18.
- Alte coloane cu bazate pe silica gel. Deoarece radicalul octadecil are o
lungime mare, poate reţine prea mult compuşii şi o analiză poate să dureze un
timp mai lung. Din acest motiv, este bine să se utilizeze radicali alchil mai scurţi:
C8 – octil, C4 – butil şi C3 – propil. Există şi coloane cu radicali fenil şi
cianopropil.
- Coloanele pe bază de polimeri prezintă următoarele avantaje: timp de viaţă
mai lung, repetabilitate bună, pot fi utilizate în condiţii alcaline, au rezoluţie bună
şi preţ de cost nu foarte ridicat.
- Coloanele cu fază normală. În cromatografia cu fază normală gelul este
polar (silicagelul), iar eluentul nepolar (hexan, cloroform).
- Coloane cu silicagel fără radicali sau grupări funcţionale.
- Coloane pentru interacţiune cromatografică hidrofilică. Este un nou
concept de cromatografie de partiţie (combinaţie între C cu fază normală şi
C cu fază inversată). Coana este umplută cu silicagel sau polimer modificaţi
cu grupări funcţionale polare de tipul: amino, amidă, diol, ciano. Faza
mobilă este un amestec polar de apă şi acetonitril.
- Coloane Sodex partiţie/adsorbţie. Coloana este umplută cu un gel cu
dublă polaritate:
- Partea dreaptă a gelului este nepolară – pentru C cu fază inversă;
- Partea stângă a gelului este polară – pentru C cu fază normală
Detectori pentru HPLC
- Detector UV VIS – determină
absorbanţa pe domeniul 195 – 700
nm.
- Detector cu fluorescenţă – solutul
este excitat cu o radiaţie de o
anumită lungime de undă şi apoi
emite o radiaţie luminoasă cu o
lungime de undă mai mică.
Intensitatea emisiei variază
proporţional cu concentraţia solutului
eluat. Majoritatea produselor
farmaceutice, produşii naturali,
probelor clinice au fluorescenţă de http://www.chromatography-online.org/Fluorescence/rs_3_32.php

absorbţie. Compuşii care nu prezintă


fluorescenţă de absorbţie sunt trataţi
cu clorură de dansil.
- Detector cu chemiluminiscenţă –
solutul eluat produce
chemiluminiscenţă în urma unei
reacţii chimice.

http://www.shsu.edu/chm_tgc/chemilumdir/liquid.html
Cromatografia de lichide cuplată cu spectroscopia de masă
(LCMS)
LCMS utilizează un HPLC cuplat la un MS. Solutul eluat din coloana
HPLC trece în MS unde este ionizat. Ionii rezultaţi sunt sortaţi în
funcţie de raportul m/Z şi apoi direcţionaţi în detector, care identifică
şi cuantifică fiecare ion.
Electroforeza
Electroforeza este metodă fizico-chimică de analiză bazată pe procesul
migrării particulelor coloidale încărcate electric, într-un mediu solid
sau lichid, sub acţiunea unui câmp electric extern.
Electroforeza este utilizată pentru separarea proteinelor din fluide
biologice, extracte care conţin proteine şi acizilor nucleici.
Bazele fizice ale electroforezei
La introducerea unei particule coloidale în câmp electric, particula se
va deplasa spre electrodul de semn contrar cu o forţă electrostatică
F direct proporţională cu sarcina sa (e) şi cu intensitatea curentului
electric (E).

F = eE
Acestei forţe de deplasare i se opune o forţă de frecare internă (F’)
proporţională cu viteza particulei (v), vâscozitatea mediului (η) şi
raza particulei (r):
F’ = 6 π r η v
Egalând cele două forţe se obţine:
eE = 6 π r η v
=>viteza de migrare a particulei în câmp electric variază proporţional
cu intensitatea câmplui electric şi sarcina electrică a particulei şi
invers proporţional cu raza pariculei şi vâscozitatea mediului.

v = eE / 6 π r η
pH-ul mediului de dispersie determină sarcina netă a moleculelor. De
exemplu, în cazul proteinelor acestea pot avea sarcină:
- Zero – starea de amfion (zwitterion), pH = pHi depinde de structură;
- Pozitivă – (pH acid, pH < pHi)
- Negativă – (pH acid, pH > pHi)
R
I
H – C – NH3+ Catod
I (-)
pH < pHi COOH
R R H+
I I Cation
H – C – NH2 H – C – NH3+
I I pH > pHi
COOH COO- HO- R
I
Amfion H – C – NH2 Anod
I
pH = pHi (+)
COO-

Anion
-
-
- -
- - -
-
Particulă coloidală cu
-
- sarcină de suprafaţă
negativă - - -
-
-
-
-
- -
- -
-
- - - -

Stratul mobil
Sarcina netă a moleculei Stratul fix

POTENŢIAL ELECTROCHIMIC (ioni adsorbiţi)

POTENŢIAL ZETTA
Suporturi electroforetice
• Hârtia de filtru
• Membranele de acetat de celuloză
• Gelul de agar
• Gelul de agaroză
• Gelul de amidon
• Gelul de poliacrilamidă
Electroforeza în gel de agaroză
Agaroza este un polizaharid extras din alge marine. Se utilizează în
concentraţii 0,5 – 2%. Gelul se prepară uşor se se foloseşte pentru
aparate orizontale. Se utilizează pentru proteine şi fragmente ADN.

În agaroză proteinele serice se fragmentează în 5 fracţiuni:

Albumine +
α1- globuline
α2- globuline
β- globuline
√- globuline
Godeul de aplicare a probei
(punctul de start)
Electroforeza în gel de acrilamidă (Polyacrylamide Gel
Electrophoresis – PAGE)
Se utilizează în biochimie, genetică, biologie moleculară, criminalistică
etc.
Se efectuează în aparate vericale de electroforeză.
SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
SDS este un detergent cu sarcină negativă care denaturează proteinele şi le
uniformizează sarcina electrică.

 Separarea proteinelor se va efectua în funcţie de masa moleculară.


Proteinele uşoare migrează mai repede, iar proteinele mai grele mai greu,
prin porii de dimensiuni controlate ai gelului.
 Cu ajutorul unui kit de masă moleculară se pot determina masele
fracţiunilor proteice identificate.
PAGE SDS PAGE
pentru ser pentru ser
sanguin sanguin
Analiza şi interpretarea electroforegramelor
Analiza calitativă
Numărul spoturilor obţinute în urma separării electroforetice şi poziţia
lor conferă informaţii referitoare la numărul şi tipul componenţilor din
proba de analizat.
Analiza cantitativă
Analiza cantitativă a electroforegramei se bazează pe principiul legii
Lambert – Beer.
Se utilizează un aparat numit densitometru care cuantifică grafic
poziţia şi concentraţia componenţilor separaţi sub forma unor curbe
gaussiene.
Gelurile se plasează în aparat şi apoi acestea se deplasează lent de-a
lungul unui fascicul luminos. Semnalul obţinut de un detector
fotoelectric este înregistrat sub forma unor curbe gaussiene.
Numărul peak-urilor înregistrate corespunde cu numărul
componenţilor separaţi, iar aria fiecărui peak este proporţională cu
concentraţia.