Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
h hc
λ= => E=
mc λ
În funcţie de lungimea de undă, radiaţiile electromagnetice au fost
împărţite în domenii spectrale.
Spectroscopia de absorbție moleculară în ultraviolet şi
vizibil (fotometria)
Absorbţia moleculară în ultraviolet şi vizibil
• Absorbţia unei cuante determină trecerea moleculei într-o stare
excitată caracterizată de un nivel energetic crescut:
M + hν → M*
Moleculele excitate (M*) au o stabilitate scăzută, în medie 10-8 s, şi
revin la starea fundamentală M prin emisie de energie neradiantă.
M* → M + energie neradiantă
Grupările funcţionale care absorb radiaţii din domeniul spectral se numesc
cromofori.
Figura ......Diagrama
absorbţiei Lambert Beer a
unei radiaţii luminoase la
traversarea unei cuve de
It grosime d
d
I0 =Ia + It
Ia ~ d
Ia ~ c
Aceste două legi pot fi exprimate prin relaţia:
It = Io . 10-ε c d
în care, ε = coeficientul molar de absorbţie
Raportul It/I0 defineşte mărimea numită transmisie (T):
It
T =
I0
Absorbanţa (A) reprezintă logaritmul mărimii reciproce a transmisiei:
1 I0
A = log log A = log log
T It
=> A = ε . c . d (Lambert-Beer)
d = constant => A = kc
unde, k – constantă de proporţionalitate.
Dacă determinările se efectuează în domeniul vizibil absorbanţa se mai
notează şi cu E (extincţie), iar pentru determinările efectuate în
ultraviolet se notează şi cu DO (densitate optică).
Legea Lamber-Beer este valabilă numai pentru o radiaţie
monocromatică, în soluţii diluate (<10-2mol/l).
Creşterea concentraţiei particulelor absorbante peste o anumită limită
conduce la abateri de la legea de directă proporţionalitate
Concentraţie (c)
Aplicaţiile spectroscopiei moleculare în ultraviolet şi vizibil
Analiza calitativă se bazează pe dependența precisă care există între
gruparea funcțională sau moleculă și lungimi de undă specifice la
care speciile menționate absorb o radiație electromagnetică.
Parametrii monitorizaţi:
– prezentarea unor maxime (peak-uri) şi minime;
– intensitatea reletivă a benzilor;
– lungimile de undă corespunzătoare maximelor.
Radiație de It
Sursă de Monocromator măsurat Cuvă
radiații
probă
Sursa de radiaţii
VIS – lampă cu filament de wolfram
UV – lampă cu descărcare în hidrogen sau deuteriu; lampă cu
vapori de mercur.
Monocromatorul - are rolul de a separa radiaţia policromatică în
radiaţii monocromatice şi de a selecta radiaţia monocromatică
adecvată – prisme de cuarţ (UV şi VIS) sau sticlă (VIS).
Detectorul – celule fotoelectrice (VIS) sau fotomultiplicatoare (UV-VIS)
Spectroscopia de absorbţie atomică (AAS)
• Este o metodă de determinare a concentraţiei unui element chimic, prin
măsurarea absorbanței unei radiaţii luminoase caracteristice, de către atomii
elementului aduşi în stare gazoasă.
• Atomii absorb o cuantă de lumină şi trec în stare excitată:
A + hν A*
• Absorbţia radiaţiei respectă legea Beer:
A=k∙ N∙ d
unde,
N – numărul de atomi din unitatea de volum;
d – grosimea stratului de substanţă.
k – constantă de proporţionalitate.
În AAS se analizează absorbanţa radiaţiei, care este proporţională cu
concentraţia.
Spectroscopia de absorbție atomică implică existența a trei etape:
1. atomizarea probei;
2. absorbția unei radiații specifice de la o sursă de lumină construită din
elementul ce urmează a fi analizat, de către atomii aflați în stare
gazoasă;
3. determinarea absorbanței și calcularea concentrației analitului.
Aparatură
Lămpi cu
catod
scobit
Avantajele utilizării AAS
• Permite determinarea a 68 de metale din aer, sânge, urină, carne, păr,
lapte, apă, sol, cereale, şampoane, ulei, sedimente etc.
• Decelează metale aflate în concentrţii de ppm.
• Precizia determinărilor în flacără este mai mică de 1%.
• Interferenţe sunt foarte mici şi deja studiate.
• Proba se prepară foarte uşor prin dizolvare în acid.
• Instrumentul este foarte uşor de manipulat.
Spectroscopia de emisie atomică (AES)
Absorbţia de energie termică de către un atom, determină trecerea atomului
din starea fundamentală (A) într-o stare excitată (A*). Această trecere se
produce datorită tranziţiilor electronice de pe straturi cu energie joasă pe
straturi cu energie înaltă. Atomii excitaţi revin la starea iniţială prin emisia
unei cuante de lumină hν.
A + energie termică → A* → A + hν
Cu Li Sr Na Be K
Principii:
• atomii fiecărui element sunt caracterizaţi prin linii spectrale specifice;
• intensitatea fiecărei linii spectrale depinde de concentraţie, fiind
direct proporţională cu concentraţia.
Culoarea dominanată
Utilizări
Determinarea metaleleor în băuturi şi alimente;
Determinarea metalelor în aer, sol apă, uleiuri industriale, cenuşă;
Determinarea metalelor in sânge, urină, oase;
În criminalistică pentru a identifica locul crimei;
Analiza uleiurilor de motor pentru a stabili timpul de viaţă al unui ulei;
Cercetarea spaţiului la NASA.
Element Concentraţia minimă Concentraţia minimă
în flacără (μg/mL) în ICP (μg/mL)
Ag 2 0,2
As 2000 2
Ca 0,1 0,0001
Cd 300 0,07
Hg 150 1
K 0,001 30
Na 0,01 0,1
Mg 1 0,003
Pb 0,2 1
Pt 2000 0,9
Sn 100 3
Zn 1000 0,1
Spectroscopia în infraroşu (IR)
Radiaţiile infraroşii induc vibraţii moleculare puternice la nivelul
legăturilor covalente.
• Legăturile covalente pot vibra în diferite moduri: alungire, oscilare,
forfecare.
• Cele mai utilizate benzi din IR corespund frecvenţelor de alungire.
Exemplu:
Când hexanona este iradiată cu IR, carbonilul va absorbi radiaţia cu
lungimea de undă 5,83x10-6 m şi o energie de 4,91 kcal/mol şi va
trece într-o stare vibraţională excitată.
Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
Exemple de spectre IR pe funcţiuni organice
• Alcani: benzi pentru vibraţie de valenţă C – H : 3000 cm-1
– Benzi de deformare angulară a legăturii C – H : 1300 – 1500 cm-1
Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 5th ed. Pearson Education Inc., 2003
Alchene
Benzi datorate deformărilor de valenţă: C = C la 1600 – 1700 cm-1 şi
=C – H la 3080 cm-1
Deformare angulară C – H la 1300 – 1500 cm-1.
Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 5th ed. Pearson Education Inc., 2003
Banda pentru = C – H – poate fi obscură dacă legătura
dublă se află în interiorul moleculei
Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
• Alchine
Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
Nitrili
C ≡ N: in jur de 2250
Alcooli
O – H: 3000 – 3700 cm-1
Aldehide şi cetone
Graphics source: Wade, Jr., L.G. Organic Chemistry, 6th ed. Pearson Prentice Hall Inc., 2006
Acizi carboxilici
O – H: 2800 – 3500 cm-1
C = O: 1710 cm-1
Amine
N – H: 3200 – 3600 cm-1
Amide
N – H: 3100 – 3500 cm-1
C = O: 1710 cm-1
NIR, MIR şi FIR
• NIR (infraroşu apropiat) este porţiunea spectrului cuprinsă între 700 şi 2500 nm
(13.000 – 4000 cm-1) – este lumina dintre VIS şi IR. Absorbţia abservată în NIR
este reprezentată de spectre sau combinaţii ale benzilor fundamentale de alungire
datorate uyual alungirii legăturilor C – H, N – H sau O – H.
• MIR (infraroşu mijlociu) NIR (infraroşu apropiat) 2500 – 25000 nm (4000 – 400
cm-1).
• FIR (infraroşu îndepărtat) 400 – 100 cm-1. spectrul obţinut este limitat şi oferă
informaţii referitoare la moleculele care conţin atomi ai metalelor grele, vibraţia
scheletului molecular, torsiuni moleculare şi vibraţia reţelelor cristaline dintr-un
cristal.
H H
I I
H – C – H + e‾ → H – C +•H + e‾
I I
H H
Ion molecular (M+)
(m/Z) = 16
H H H H
I I I I
H – C – C – H + e‾ → m/Z = 30
H – C – C +• H
I I I I
H H H H
H H
I I
H – C – C + + H• m/Z = 29
I I
H H
H H
I I
H–C+ + •C – H
I I
m/Z = 15 H H m/Z = 0
(nedetectabil de MS)
=> În urma bombardării cu electroni a unei molecule rezultă:
Ionii moleculari sau ioni parentali (M+)– au masa moleculară egală cu
masa moleculară a substanţei din care provin, şi au (în general cea mai
mare masă din spectru).
H H H
I I I
H – C +•H H – C – C +• H
I I I
H H H
Cationi – au mase mai mici decât masa substanţei din care provin.
H
I
H–C+
I
H
Exemplu, spectrul de masă al acetonei (M = 58):
M+
Spectrul de masă al bromoetanului (M = 118, pentru 79Br şi 120 pentru
81Br)
Cationii formaţi sunt separaţi prin deflexie cationică (deviaţie cationică)
Tipuri de detectori pentru MS
- Detectorul cu cupă Faraday
Principiul – dinoda
(electrod CsSb, GaP sau
BeO, aflat in tub vidat,
emite electroni care
produc un curent electric.
Curentul este amplificat şi
înregistrat
http://www.sec.psu.ac.th/web-board/?pid=view_replies&thread_id=580&forum_id=7
- Detectorul cu fotomultiplicator sau cu numărător de scintilaţii
Peak-ul de bază
M+
N+
2-bromopropan
M+ ~ M+2
–Exogenous Fluorophores
Cyanine dyes
Photosensitizers
Molecular markers – GFP, etc.
Substanţele extrinsec fluorescente (fluorofori exogeni) sunt
molecule fluorescente care se adaugă în sistemele biologice pentru
a crea fluorescenţă.
84
Fluorofor Absorbţie (nm) Emisie (nm)
http://chemwiki.ucdavis.edu/Physical_Chemistry/Spectroscopy/Electronic_Spectroscopy/Chemiluminescence
Prismă Nicol
• În funcţie de comportarea lor faţă de lumina polarizată, substanţele
şi soluţiile pot fi împărţite în două categorii:
– substanţe optic active – rotesc planul luminii polarizate;
– substanţe optic inactive – nu rotesc planul luminii polarizate.
• La trecerea luminii polarizate prin soluţia unei substanţe optic active,
planul de polarizare al razei imergente este rotit cu un anumit unghi,
numit unghiul de rotaţie al planului de polarizare.
Aparatură. Aparatul utilizat în polarimetrie se numeşte polarimetru.
• Determinările se efectuează la 200C, cu
lumina galbenă a sodiului
corespunzătoare liniei D din spectru şi se
utilizează relaţia:
[α]D20 = 100/(L ∙ c)
• L – grosimea stratului de substanţă; c–
concentraţia procentuală.
Ag(s) Ag e
Cu 2 2e Cu(s)
Ag e Ag(s)
Cu(s) Cu 2 2e
Fe2 Fe3 e
Fe3 e Fe2
NO3- 10H 8e NH 4 3H 2 O
Reprezentarea unei celule electrochimice
Cu2+ + 2e‾↔ Cu
Ag+ + e‾↔ Ag
Potenţialul de celulă (voltajul)
- - 0.412 V
+
Voltmetru
Semicelula unei celule electrochimice indică participanţii la
semireacţii
Ecathode Ag e Ag(s)
Ag (0.0200 M) Ag
Eanode Cu 2 2e Cu(s)
Cu 2 (0.0200 M) Cu
2H (aq) 2 e H 2 (g)
H ([H ] x M) H 2 (p 1.00 atm), Pt
ESHE 0.00 volt s
Potenţialul standard de celulă
Se determină prin cuplarea electrodului standard de hidrogen cu
semicelula al cărui potenţial dorim să-l determinăm.
Explicaţii
• La separarea unei soluţii de HCl 0,1M printr-o memebrană poroasă
de o soluţie de HCl 0,01M, are loc difuzia ionilor H+ şi Cl- din soluţia
mai concentrată către soluţia mai diluată;
• Mobilitatea H+ > Cl-;
=>Soluţia mai concentrată va dezvolta un potenţial negativ (-), iar
soluţia mai diluată un potenţial pozitiv (+);
Diferenţa de potenţial dezvoltată de-a lungul membranei se numeşte
potenţialul joncţiunii lichidului.
=> Magnitudinea potenţialului este dependentă de concentraţiile
soluţiilor.
Exemplul 2
la suprafaţa de separare dintre o soluţie de NaCl şi apă distilată apare
un potenţial de joncţiune.
Electrolit de referinţă
intern
A+ Membrană ion-
selectivă
(-)
Em A+ Soluţie de analizat
(+)
C-, B+
Electrodul cu membrană de sticlă
• Membrana de sticlă este permeabilă pentru
ionii H+.
• Construcţie:
– Balonaş de sticlă în care se află o soluţie de
referinţă internă de HCl 0,1M (pH = 0),
saturată cu AgCl;
– Electrod de referinţă internă Ag/AgCl,
cufundat în soluţia de HCl 0,1M;
– Sticla conţine aproximativ: 22%Na2O, 6%CaO
şi 72%SiO2.
– La imersarea în soluţie apoasă 10 nm din
suprafaţa memebranei se hidratează şi
formează situri încărcate negativ: -SiO; ־
– Ionii Na+ servesc ca numărător de ioni
deoarece H+ se leagă mai puternic de SIO-
decâr de Na+, înlocuind Na+:
H+ + SiO־Na+ → SiO־H+ + Na+
Electrodul de sticlă este utilizat, în general, pe
domeniul de pH 0,5 – 9. la pH mai mare se
memebrana răspunde mai puternic pentru alţi
cationi, cum sunt Na + şi K +.
In funcţie de pH, ionii de hidrogen migrează spre electrod sau în afara
electrodului.
Înlocuirea Na2O şi CaO cu Li2O şi BaO face electrodul utilizabil până la pH 12.
Determinarea pH-lui cu electrodul de stică
Electrodul de sticlă şi electrodul de referinţă se introduc în soluţia de
analizat, realizând o celulă potenţiometrică de forma:
Particule de
Perete
suport
Strat
imobilizat
SCOT
WCOT
Faza staţionară în cromatografia solid – gaz (GSC) – material
adsorbant: silice (SiO2), alumină (Al2O3), C grafitizat. După
mecanismul de separare in acest caz avem cromatografie de
adsorbţie.
Faza staţionară în cromatografia lichid – gaz (GLC) – lichide cu
aspect de clei sau gumă (trimetilclorsilan, hexametil disilazan),
depuse pe suport inert. După mecanismul de separare GLC este
cromatografie de partiţie.
Detectori în GC – solutul eluat din coloană interacţionează cu
detectorul. Detectorul transformă interacţiunea în semnal electric pe
care îl trimite în sistem. Reprezentarea grafică a magnitudinii
semnalului în funcţie de timp (momentul 0 = momentul injecţiei)
reprezintă cromatograma generată.
- Detectorul cu ionizare în flacără
- Detectorul azot fosfor
- Detectorul cu captură de electroni
- Detectorul cu conductibilitate electrică
- Detectorul flamfotometric
- Detectorul de chemiluminiscenţă
Detectorul cu ionizare în flacără
Principiul – o substanţă organică
generează electroni la combustie şi se
transformă în ioni. Ionii formaţi lovesc
colectorul şi generează un semnal.
Utilizări – analiza compuşilor organici
cu legături C – H.
Detectorul de chemiluminiscenţă
Principiul – compuşii care
reacţionează cu fluorul produc
chemiluminiscenţă.
Utilizări – analiza compuşilor care
produc chemiluminiscenţă cu F2.
Documentul obţinut se numeşte cromatogramă.
%Cx = ΣA∙100/Ax
Gaz cromatografia cuplată cu spectrometria de masă (GC/MS)
Se realizează legătura HPLC → MS. Solutul eluat trece din coloana
cromatograficî în spectrometrul de masă (MS), iar ionii rezultaţi sunt
detectaţi de detectorul MS.
Cromatografia de lichide de înaltă performanţă (HPLC)
Aparatură. Instrumentul utilizat se numeşte HPLC.
Un HPLC tipic este alcătuit din:
- rezervor pentru faza mobilă,
- pompă,
- injector,
- coloană cromatografică,
- detector şi
- înregistrator.
https://www.shodex.com/en/kouza/a.html
Pompa – asigură curgerea eluentului prin coloana cromatografică şi asigură
presiunea înaltă în sistem.
Injectorul - este plasat după pompă şi cu ajutorul unei seringi proba este
introdusă în fluxul eluentului.
Coloana cromatografică - este confecţionată din oţel inoxidabil. Coloana este
umplută cu silica gel, geluri polimerice sau alte geluri, cu dimensiunea
particulei cuprinsă între 3 şi 15 μm, sau chiar mai mici.
- Coloanele cu fază inversată. În cromatografia cu fază inversată gelul are
polaritate scăzută iar eluentul polaritate înaltă (apă, acetonitril).
- Coloanele ODS – sunt din silicagel modificat cu radicali octadecil (nepolari)
→coloane octadecilsilica (ODS sau C18). 80% din coloanele HPLC sunt
coloane C18.
- Alte coloane cu bazate pe silica gel. Deoarece radicalul octadecil are o
lungime mare, poate reţine prea mult compuşii şi o analiză poate să dureze un
timp mai lung. Din acest motiv, este bine să se utilizeze radicali alchil mai scurţi:
C8 – octil, C4 – butil şi C3 – propil. Există şi coloane cu radicali fenil şi
cianopropil.
- Coloanele pe bază de polimeri prezintă următoarele avantaje: timp de viaţă
mai lung, repetabilitate bună, pot fi utilizate în condiţii alcaline, au rezoluţie bună
şi preţ de cost nu foarte ridicat.
- Coloanele cu fază normală. În cromatografia cu fază normală gelul este
polar (silicagelul), iar eluentul nepolar (hexan, cloroform).
- Coloane cu silicagel fără radicali sau grupări funcţionale.
- Coloane pentru interacţiune cromatografică hidrofilică. Este un nou
concept de cromatografie de partiţie (combinaţie între C cu fază normală şi
C cu fază inversată). Coana este umplută cu silicagel sau polimer modificaţi
cu grupări funcţionale polare de tipul: amino, amidă, diol, ciano. Faza
mobilă este un amestec polar de apă şi acetonitril.
- Coloane Sodex partiţie/adsorbţie. Coloana este umplută cu un gel cu
dublă polaritate:
- Partea dreaptă a gelului este nepolară – pentru C cu fază inversă;
- Partea stângă a gelului este polară – pentru C cu fază normală
Detectori pentru HPLC
- Detector UV VIS – determină
absorbanţa pe domeniul 195 – 700
nm.
- Detector cu fluorescenţă – solutul
este excitat cu o radiaţie de o
anumită lungime de undă şi apoi
emite o radiaţie luminoasă cu o
lungime de undă mai mică.
Intensitatea emisiei variază
proporţional cu concentraţia solutului
eluat. Majoritatea produselor
farmaceutice, produşii naturali,
probelor clinice au fluorescenţă de http://www.chromatography-online.org/Fluorescence/rs_3_32.php
http://www.shsu.edu/chm_tgc/chemilumdir/liquid.html
Cromatografia de lichide cuplată cu spectroscopia de masă
(LCMS)
LCMS utilizează un HPLC cuplat la un MS. Solutul eluat din coloana
HPLC trece în MS unde este ionizat. Ionii rezultaţi sunt sortaţi în
funcţie de raportul m/Z şi apoi direcţionaţi în detector, care identifică
şi cuantifică fiecare ion.
Electroforeza
Electroforeza este metodă fizico-chimică de analiză bazată pe procesul
migrării particulelor coloidale încărcate electric, într-un mediu solid
sau lichid, sub acţiunea unui câmp electric extern.
Electroforeza este utilizată pentru separarea proteinelor din fluide
biologice, extracte care conţin proteine şi acizilor nucleici.
Bazele fizice ale electroforezei
La introducerea unei particule coloidale în câmp electric, particula se
va deplasa spre electrodul de semn contrar cu o forţă electrostatică
F direct proporţională cu sarcina sa (e) şi cu intensitatea curentului
electric (E).
F = eE
Acestei forţe de deplasare i se opune o forţă de frecare internă (F’)
proporţională cu viteza particulei (v), vâscozitatea mediului (η) şi
raza particulei (r):
F’ = 6 π r η v
Egalând cele două forţe se obţine:
eE = 6 π r η v
=>viteza de migrare a particulei în câmp electric variază proporţional
cu intensitatea câmplui electric şi sarcina electrică a particulei şi
invers proporţional cu raza pariculei şi vâscozitatea mediului.
v = eE / 6 π r η
pH-ul mediului de dispersie determină sarcina netă a moleculelor. De
exemplu, în cazul proteinelor acestea pot avea sarcină:
- Zero – starea de amfion (zwitterion), pH = pHi depinde de structură;
- Pozitivă – (pH acid, pH < pHi)
- Negativă – (pH acid, pH > pHi)
R
I
H – C – NH3+ Catod
I (-)
pH < pHi COOH
R R H+
I I Cation
H – C – NH2 H – C – NH3+
I I pH > pHi
COOH COO- HO- R
I
Amfion H – C – NH2 Anod
I
pH = pHi (+)
COO-
Anion
-
-
- -
- - -
-
Particulă coloidală cu
-
- sarcină de suprafaţă
negativă - - -
-
-
-
-
- -
- -
-
- - - -
Stratul mobil
Sarcina netă a moleculei Stratul fix
POTENŢIAL ZETTA
Suporturi electroforetice
• Hârtia de filtru
• Membranele de acetat de celuloză
• Gelul de agar
• Gelul de agaroză
• Gelul de amidon
• Gelul de poliacrilamidă
Electroforeza în gel de agaroză
Agaroza este un polizaharid extras din alge marine. Se utilizează în
concentraţii 0,5 – 2%. Gelul se prepară uşor se se foloseşte pentru
aparate orizontale. Se utilizează pentru proteine şi fragmente ADN.
Albumine +
α1- globuline
α2- globuline
β- globuline
√- globuline
Godeul de aplicare a probei
(punctul de start)
Electroforeza în gel de acrilamidă (Polyacrylamide Gel
Electrophoresis – PAGE)
Se utilizează în biochimie, genetică, biologie moleculară, criminalistică
etc.
Se efectuează în aparate vericale de electroforeză.
SDS PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel
Electrophoresis)
SDS este un detergent cu sarcină negativă care denaturează proteinele şi le
uniformizează sarcina electrică.