PRACTICA N°9:

DETERMINACION DE LINFOCITOS
EN SANGRE: ROSETAS T (E)
 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS
Respuesta inmune adaptativa mediada por linfocitos es estudiada mediante:
* Aislamiento
* Separación poblaciones-subpoblaciones
* Comportamiento

No es posible diferenciar los linfocitos T de los B por microscopía ordinaria, ni en la sangre ni en los
órganos linfoides, aunque sí se observan algunas diferencias por microscopía electrónica de barrido.
No obstante, se disponen de varios métodos que permiten diferenciar y cuantificar los linfocitos, sus
diferentes subpoblaciones e incluso su capacidad de responder a distintos antígenos. Los métodos
para el estudio de los linfocitos, más utilizados en la actualidad, los podemos agrupar en:

Determinación de marcadores y receptores de membrana.

Determinación de antígenos de membrana.

Pruebas funcionales.
 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DELINFOCITOS
1.- Marcadores y receptores de Membrana

Este método ha sido tradicionalmente utilizados para diferenciar y cuantificar poblaciones de linfocitos
B y T. Estos marcadores convencionales, están basados en las características específicas de ciertos
receptores de membrana, presentes en ambas poblaciones de linfocitos. Los principales marcadores
son:

Principales receptores utilizados tradicionalmente para diferenciar los

linfocitos T de los B
Linfocitos B:
Inmunoglobulinas de superficie

Linfocitos T:
Rosetas con eritrocitos de carnero
 1.- Marcadores y receptores de Membrana

Para los linfocitos B:inmunoglobulinas de superficie:

Que pueden ser detectadas con suero de anticuerpos Monoclonales o Acs. Monoclonales marcados con
fluorescencia (isoisotiocianato de fluoresceína).
En el microscopio de fluorescencia se puede observar que en la membrana aparece una reacción fluorescente
positiva.
Para los linfocitos T: Rosetas con los eritrocitos.
Los linfocitos T presentan la característica de formar Rosetas cuando se unen a los eritrocitos de carnero
Se pueden cuantificar los linfocitos mediante el marcaje con naranja de acridina y la posterior observación
al microscopio de fluorescencia y luz ordinaria a la vez. Los linfocitos T y B se marcan con naranja de acridina,
presentando los linfocitos T rosetas mientras que los B se marcan con la naranja de acridina pero no
forman rosetas.

Existen métodos de inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales, ya sea

manuales o automatizados, especialmente con el impresionante desarrollo de las
técnicas de Citometría de flujo, para cuantificar los linfocitos T humanos.
Linfocitos B
Linfocitos T
 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

Las primeras técnicas empleadas para aislar los linfocitos sanguíneos consistían en mezclar
la muestra con un agente aglutinante de eritrocitos, con el fin de que estos se separaran
debido a la sedimentación de los grumos. Sin embargo, estas técnicas son lentas, dan un
bajo rendimiento final y una baja pureza.

Posteriormente se desarrollaron las técnicas de centrifugación en gradientes. Bøyum (1958)

ideó un método basado en la centrifugación de la muestra sobre un gradiente de densidad
discontinuo, (consistía en una mezcla de ficoll y metrizoato de sodio), con densidad de
1,077 g/ml. Este método es rápido y simple, se utiliza para obtener preparaciones de
linfocitos sanguíneos.

Esta técnica resulta en la separación de los leucocitos mononucleares, que incluyen tanto a
los linfocitos como a los monocitos, los primeros superan ampliamente en número a los
segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre periférica.
 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS

El medio de separación

El medio de separación para linfocitos sanguíneos: una mezcla de dos componentes, el ficoll 400 es
un polímero sintético de sacarosa, soluble en agua y el diatrizoato de sodio, es un compuesto que, al
ser mezclado con el ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad.

La función del diatrizoato es proveer la densidad óptima para la separación y la osmolaridad para
mantener la viabilidad de las células. Además, el ficoll causa la aglutinación de los eritrocitos, lo cual
facilita su sedimentación. La mezcla de ficoll-diatrizoato está disponible comercialmente, (ej: Ficoll-
Paque®, Lymphoprep®, etc.).

Fundamento de la separación
Al colocar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las células
mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. El ficoll aglutina
los eritrocitos, estos pasan a través del medio y sedimentan al fondo, los granulocitos
también sedimentan por su tamaño y densidad, y por su tendencia a formar agregados.
 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS
Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su menor densidad, se quedan en la interfase entre
el plasma y el medio.

Al final de la centrifugación, los leucocitos mononucleares se recogen del anillo blanco que se
forma en la interfase entre el plasma y el ficoll-diatrizoato.
 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS
Este procedimiento permite recuperar alrededor de un 50% de los linfocitos presentes en la
muestra, con una viabilidad mayor del 90%.
 SEPARACION DE LINFOCITOS
Los linfocitos pueden separarse de las otras células de la sangre por centrifugación en una
gradiente de densidad de Ficoll – Hypaque de 1,077 de densidad. Ficoll – Hypaque es una
mezcla de 12 partes de Ficoll al 9% y 5 partes de Hypaque al 34%

Materiales

1.- Buffer salino fosfato (PBS) 6.- Pipetas de 1ml

2.- Suero de ternero fetal al 2% 7.- Pipetas de 5ml
3.- Tubo de 13 x 100 mm con 1.5ml de Ficoll-Hypaque 8.- Pipeta pasteur con tetina
4.- tubos de 16 x 150mm 9.- Pro pipeta
5.- Tubos de 10 x 75mm 10.- bocal con legia
 PROCEDIMIENTO
1.- Tomar 1 mL de sangre desfribrinada y depositarla en un tubo de 16 x 150 mm
2.- agregar 3mL de PBS para diluir la sangre1:4 Mezclar bien y depositar en zona , 3 mL de sangre en
el tubo que contiene 1.5 mL de Ficol – Hypaque
3.- Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos
4.- Segregar 0.5 – 1.0 mL de PBS separar suavemente el anillo de los linfocitos con la pipeta pasteur y
transferirlos al tubo de 10 x 75 mm . Agregar 0.5 – 1.0 mL de PBS
5.- Centrifugar a 800 rpm durante 3 minutos
Descartar el sobrenadante y agregar 0.5 – 1.0 mL de PBS, resuspender las células agitando
suavemente esto se hace para lavar los linfocitos y retirar los restos de Ficoll- Hypaque
6.- Centrifugar nuevamente a 800rpm durante 3 minutos y descartar el sobrenadante
7.- Resuspender las células en aproximadamente 0.5 mL de PBS, agregando una gota de suero de
ternera fetal
 FORMACION DE ROSETAS T

Las diferentes poblaciones de linfocitos no son distinguibles morfológicamente. Para

identificarlas, se requieren métodos de laboratorio que detectan, por lo general, proteínas
de membrana que utilizamos como "marcadores" de dichas poblaciones.

El fenómeno de formación de rosetas se debe a que los linfocitos T humanos poseen en su

superficie un receptor que media la unión (fortuita) con los eritrocitos de carnero.
Inicialmente, este receptor fue denominado "antígeno T11", cuando se generaron las
primeras series de anticuerpos monocloales.

Posteriormente, se introdujo el uso de la nomenclatura de "grupos de diferenciación" (CD,

clusters of differentiation), se cambió su nombre a CD2 (glicoproteína presente en todos los
linfocitos T humanos maduros), cuya función natural es la interacción con una glicoproteína
denominada LFA-3 o CD58, presente en la superficie de diversos tipos celulares.

Eritrocitos de carnero poseen una molécula análoga al LFA-3 humano en su superficie, por
ello interactúan con el CD2.
 FORMACION DE ROSETAS T

CD2, su presencia es útil para identificar a los linfocitos T humanos, a través de la

formación de rosetas. El sencillo método de las rosetas para cuantificar los linfocitos T
humanos ha sido sustituido por métodos automatizados como la Citometría de Flujo.
 FORMACION DE ROSETAS T

La unión que se establece entre los linfocitos T y los eritrocitos de carnero es muy frágil, lo
cual constituye el principal problema técnico de este método: las agitaciones, aún leves,
pueden desintegrar las rosetas y causar amplias variaciones en los resultados.

Calcular el porcentaje de linfocitos T (%T o % células E+), así como su número absoluto, con
base en los datos del hemograma de la muestra (número de leucocitos totales y fórmula
leucocitaria diferencial).
• Ejemplo del cálculo de la cifra absoluta de linfocitos T: recuento de leucocitos = 8000/μl
% de linfocitos = 30%
% de células E+ = 55%
→cifra absoluta de T = 8000 x 0,3 x 0,55 = 1.320 cél.T/μl

En los RN es común un menor porcentaje de linfocitos T por este método. Sin embargo, la
cifra absoluta de células T es mayor que en adultos, debido a que hay más linfocitos
totales por μl. El porcentaje de linfocitos T aumenta gradualmente hasta alrededor de los 7
años, mientras la cifra absoluta disminuye en forma similar hasta nivelarse a la misma edad
 TECNICAS PARA EL ESTUDIO DE LINFOCITOS
•
Aislamiento de linfocitos: Gradiente sobre Ficoll/Hypaque (Boyum 1968)Humanos:
Sangre Periférica – Organos
M. Experimental : bazo, NL, timo Importante conocer si se requiere esterilidad . Rendimiento:
1-2 x 106 cel / ml
 F O R M A C IÓ N DE ROSETAS T

La suspensión de Linfocitos debe tener de 1 – 10 x 10 6 celulas por mL, y debe contener 80 – 90 % de

celulas vivas. Las rosetas T solamente se forman alrededor de celulas vivas

Materiales
1.- Eritrocitos lavados al 0.5% en solucion salina 4.- Pipetas pasteur con tetinas
2.- Azul de toluidina al 0.5% en PBS 5.- Laminas, laminillas y parafina solida 3.-
tubos de 7 x 100 mL calentada

PROCEDIMIENTO
1.- Depositar dos gotas de la suspensión de linfocitos en un tubo de 7 x 100 mm
2 Colocar 2 gotas de eritrocitos al 0.5 %
3 Centrifugar a 800 rpm durante 1 minuto
4.- Con la pipeta pasteur con tetina separar y descartar una gota del sobrenadante sin resuspender
las celulas del fondo del tubo.
5.-Cuidadosamente, tomar las celulas del fondo y colocarlas en una lamina con una gota de azul de
toluidina. Cubrir con laminilla y sellar con parafina licuada con laminilla
6.- observa al microscopio
 RESULTADO
Observar que alrededor de algunas celulas (linfocito T) hay adheriodos eritrocitos de
carnero, formando rosetas. Para que sea consideradas una roseta, el numero de
eritrocitos tendrá que ser mayor de tres