CROMATOGRAFIA

ANALISIS NUTRICIONAL DE
ALIMENTOS
Dra. Diana Chalco Quezada
 INTRODUCCION
• En 1910 el botánico ruso M. Tswett describió por
primera vez esta técnica, que se aplicó a la separación
de pigmentos de plantas, dándole el nombre de
cromatografía en referencia a las bandas coloreadas de
pigmentos que se separaban por su adsorción selectiva
sobre columnas de yeso.
• Se redescubrió en 1930 por Lederer y Kuhn, quienes la
aplicaron para la separación de carotenoides.
• A partir de allí, se fue extendiendo el uso de esta
técnica, desarrollándose diferentes versiones de la
misma.
 DEFINICION
• Método físico de separación, en el que los componentes a
separar se distribuyen entre dos fases, una inmóvil (fase
estacionaria) y otra móvil (fase móvil) la cual se desplaza a
través de la primera.
• Sirve para la determinación e identificación de los
componentes químicos de mezclas complejas.
• Ningún otro método es tan poderoso ni tiene tantas
aplicaciones como la cromatografía.
 DEFINICION

• Los componentes de una mezcla pasan a través

de una fase estacionaria mediante el flujo de
una fase móvil y las separaciones están
basadas en las diferencias en la velocidad de
migración entre los componentes de la fase
móvil.
 APLICACION
• No existen restricciones sobre la naturaleza de las
fases a utilizar siempre que la fase estacionaria
sea sólida o líquida, y la fase móvil líquida o
gaseosa.
• La dificultad está en la elección de las condiciones
óptimas de separación, lo que en muchas
ocasiones implica la irreproducibilidad de los
resultados.
• Por ello no es una técnica de rutina que pueda
aplicarse a cualquier mezcla, sin invertir gran
cantidad de esfuerzo y tiempo.
 TERMINOLOGIA
* Eluyente: componente que se emplea para acarrear los componentes de
una mezcla a través de una fase estacionaria.
* Cromatograma: es el grafico de concentración del soluto contra el tiempo
o volumen de elución.
* Tiempo muerto: es el tiempo requerido para que una especie no retenida
pase a través de la columna.
* Tiempo de retención: es el tiempo entre la inyección de la muestra y la
aparición del pico de un soluto en el detector.
* Elución: se limpian los solutos a través de una fase estacionaria por el
movimiento de una fase móvil.
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA
• Por la naturaleza de sus fases:

• Cromatografía líquido - líquido

• Cromatografía gas - líquido
• Cromatografía líquido - sólido
• Cromatografía gas - sólido
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA
• Atendiendo al proceso químico-físico que va a
protagonizar el proceso de separación: este el criterio más
coherente de clasificación):
• Cromatografía de Adsorción (líquido - sólido o
cromatografía de fases normales). (capa fina)
• Cromatografía de Reparto (o líquido - líquido), se basa en
las características de solubilidad relativa de los solutos
entre la fase móvil y una fase estacionaria de un líquido no
polar. La fase líquida se impregna a un soporte inerte de
sílice o, en el caso de cromatografía de fase invertida, se
une químicamente. (cromatog.de papel)
• Cromatografía de Intercambio iónico.
• Cromatografía de Exclusión.
 TIPOS DE CROMATOGRAFIA
• Con base en la naturaleza del soporte en
el que se aloja la fase estacionaria:
• CROMATOGRAFÍA PLANA:
- Cromatografía en papel
- Cromatografía en capa fina (TLC)
• CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA:
- Cromatografía de gases (GC)
- Cromatografía líquida (LC)
- cromatografía líquido - líquido
- cromatografía sólido – líquido
 ADSORBENTES MAS COMUNES
• Celulosa
• Sulfato cálcico (yeso)
• Sílice
• Florisil
• Oxido de magnesio
• Alúmina
• Carbón activo
 DISOLVENTES MAS COMUNES
• Eter de petróleo
• Ciclohexano
• Benceno
• Tetracloruro de carbono
• Diclorometano
• Cloroformo
• Eter dietílico
• Acetato de etilo
• Acetona
• N- propanol
• Etanol
• Metanol
• Agua
• Acido acético
 COMPONENTES DEL SISTEMA
CROMATOGRAFICO
• Fase estacionaria (sólido, líquido, polar, apolar,
etc.)
• Fase móvil (sólido, líquido, gas, composición,
flujo)
• Soporte ( Placa de vidrio, plástico, aluminio;
Tubo de vidrio; HPLC: Tubo de acero
inoxidable Inerte
• Revelador (Universal: yodo, HPLC detector
I. Refracción; Específico: luz UV 254 nm,
• HPLC: Detector UV-Vis var., fluorómetro.
 CROMATOGRAFIA PLANA:
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
• En este caso, el soporte y fase estacionaria es
papel. El papel que normalmente se utiliza es
de celulosa.
• La celulosa es muy polar en el agua y se vuelve
electronegativa.
• El papel tiene propiedades de intercambio
iónico débiles, así como de adsorción.
 CROMATOGRAFIA EN PAPEL
• La mayoría de las propiedades varían de papel a papel, lo que
provoca variaciones en el Rf. Actualmente existen papeles
modificados con resinas cambiadores de iones, alúmina, etc.
• El aparato que se usa consta de un soporte para el papel, un
recipiente para el disolvente y una cámara hermética para
desarrollar el cromatograma.
• La cámara hermética es necesaria para evitar la evaporación
de los disolventes volátiles debido a la gran superficie del
papel expuesta.
• Antes de sumergir el papel en el disolvente de elución se
aplica la muestra en forma de punto diminuto con cualquier
objeto que pueda transferir un pequeño volumen.
CROMATOGRAFIA EN PAPEL
 CROMATOGRAFIA PLANA:
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA TLC
• Para la cromatografía en capa fina (TLC), la fase
estacionaria es una capa de partículas de unos
milímetros de espesor, fijadas sobre un soporte
sólido generalmente de aluminio, plástico o
vidrio. Después de aplicar el analito cerca de la
parte inferior de la placa seca, el disolvente
empieza a producir la separación.
• La ventaja principal de la TLC es que se analizan
simultáneamente la muestra y el patrón,
mientras que en la cromatografía en columna las
muestras se analizan individualmente.
 CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA - TLC
• La detección y localización de las manchas en la placa de TLC se
hace observando los cambios en la fluorescencia, o absorción en el
U.V., de un indicador que se incorporó a la fase estacionaria.
• La mancha en una placa de TLC se caracteriza por la distancia que
recorre con relación a la distancia recorrida por la fase móvil.
• El grado de retención en cromatografía plana de superficie se expresa
como el factor de retardación, o índice de retención Rf:
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA
 CROMATOGRAFIA PLANA
• El flujo de la fase móvil puede conseguirse de
dos formas: 1) por capilaridad (cromatografía
horizontal y ascendente) y 2) por capilaridad y
gravedad (cromatografía descendente).
• En la cromatografía plana queda eliminada el uso
de un gas como fase móvil, por lo que ésta
siempre es líquida.
 CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO
• La separación en la cromatografía de
intercambio iónico depende la adsorción
reversible de moléculas de soluto cargadas, a
una resina con grupos iónicos de carga
opuesta.
• El mecanismo de separación se basa en un
equilibrio de intercambio iónico.
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO
IONICO
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION

El sólido es un gel formado

por polímeros no iónicos
porosos que retienen a las
moléculas de soluto según
su tamaño.
 CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD
• Es un tipo de
cromatografía de
adsorción, utilizado en
bioquímica, en la que
un sólido tiene un
llamado ligando de
afinidad, que puede ser
un indicador enzimático
o un anticuerpo.
 CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
Se utiliza un tubo cilíndrico, en cuyo interior se coloca la
fase estacionaria y a su través se hace pasar la fase móvil.
El flujo de la fase móvil (líquido o gas) a través de la
estacionaria se consigue: 1) por presión, 2) por
capilaridad, 3) por gravedad.
Es necesario aclarar que la cromatografía de gases solo
puede realizarse en columna.
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA
• El aislamiento de las especies
separadas se logra pasando
una cantidad suficiente de la
fase móvil a través de la
columna para hacer que las
bandas individuales salgan
hacia el extremo(al ser fluidas
de la columna) donde se
puede recolectar o detectar.
 En la cromatografía plana la separación se realiza por
distancias mientras que en columna se hace por tiempos
o volúmenes.
 En general, los solutos mas retenidos en cromatografía
plana forman manchas compactas, por lo que se
detectan con mayor sensibilidad. Por el contrario, los
solutos mas retenidos en la columna son los que dan
picos más anchos menos resueltos y sensibles
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION HPLC

• Capaz de separar
macromoléculas y
especies iónicas,
productos naturales
lábiles, materiales
poliméricos, grupos
funcionales de alto peso
molecular.
 CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA
RESOLUCION (HPLC)
• Las reglas básicas en HPLC son cuatro:
• 1. Fase móvil y estacionaria han de ser de
polaridad opuesta.
• 2. Todos los solutos han de ser solubles en la
fase móvil (es decir, polaridad similar).
• 3. Todo soluto que entra en la columna ha de
salir de ella (propagación).
• 4. Y, a ser posible, con los distintos solutos
separados (migración diferencial).
 INTRUMENTACION GENERAL
• Un cromatógrafo de líquidos consta de
módulos con funciones bien definidas. Son:
• Sistema de suministro de fase móvil
• Sistema de inyección
• Detector continuo
• Otros elementos adicionales
 HPLC: SISTEMA DE SUMINISTRO DE
FASE MOVIL

• Es un sistema de bombeo de fase móvil de

alta presión para forzar el paso de la fase
móvil a través de la columna, cuyo relleno
muy compacto, es responsable de una
importante sobrepresión.
 SISTEMA DE SUMINISTRO DE FASE
MOVIL: BOMBA
• Su misión es suministrar un caudal constante de la fase
móvil a través de la columna.
• Un sistema de bombeo debe cumplir con las siguientes
características:
- Estar construido con materiales químicamente inertes
frente a la fase móvil.
- Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.
- Proporcionar un flujo libre de pulsaciones, ya que de lo
contrario pueden contribuir al ruido y disminuir la
sensibilidad, aunque no afecta a la separación en sí.
- Suministrar un caudal constante a lo largo del tiempo, ya
que de él depende la reproducibilidad de los tiempos de
retención.
SISTEMAS DE MEZCLA DE FASE MOVIL
• ISOCRATICO: cuando la fase móvil mantiene la
misma composición durante la elución.
• EN GRADIENTE: cuando la composición de la
fase móvil cambia según una función
dependiente del tiempo.
 HPLC: SISTEMA DE INYECCION DE
MUESTRA
• La inyección de un
volumen preciso de
muestra debe hacerse a la
entrada de la columna en
un corto período de
tiempo para perturbar lo
menos posible el régimen
de circulación de fase
móvil establecido en la
columna y el detector.
• Los volúmenes son
pequeños (pocos
microlitros).
 SISTEMAS DE INYECCION
• El método de introducción de la muestra es de suma
importancia, pues un mal sistema de inyección puede dar
lugar a ensanchamientos de la banda cromatográfica que
deterioren la eficacia del sistema cromatográfico.
• Un inyector ideal debe:
- Introducir la muestra en la columna como una banda lo
más estrecha posible.
- Ser de fácil manejo
- Resultados reproducibles tanto en la cantidad de muestra
inyectada como en el ensanchamiento de la banda
cromatográfica.
- Trabajar a presiones elevadas.
 TIPOS DE INYECTORES
• Inyectores de jeringa: La introducción de la muestra se
realiza por medio de una jeringa cuya aguja entra en el
sistema cromatográfico a través de un membrana (septum)
lo que permite depositar la muestra en la cabeza de l
columna.
• Inyectores de válvula: es la mas usada. Es una válvula de
seis vías, dos de las cuales están conectadas entre sí por
medio de una espira, la cual es un tubo de volumen
conocido, cuya misión es la de contener la muestra antes
de efectuarse la inyección. La inyección se lleva a cabo en
dos etapas: la primera se realiza a presión atmosférica y se
carga la muestra en la espira con ayuda de una jeringa; en
la segunda girando la válvula se hace pasar el eluyente a
través de la espira hacia la columna.
 CONDUCCIONES Y CONEXIONES
• Son de gran importancia entre inyector y
columna y entre columna y detector.
• El tubo de conducción debe ser de diámetro
interno pequeño(capilares) y evitar el uso de
tubos de conexión de grandes longitudes.
• De este modo se consigue reducir los volúmenes
muertos del sistema, que causan una pérdida de
eficacia.
• Deben ser inertes frente a la fase móvil y a las
sustancias a separar. Se usan de acero inoxidable
o titanio.
 HPLC: COLUMNA CROMATOGRAFICA
• Son tubos rectos de acero que miden entre 3-30 cm de
longitud, su diámetro es de 2-60 mm. Actualmente se
encuentran entre 0.5-2 mm y longitud de 25-100 cm.
• Como relleno se puede utilizar un relleno pelicular
(partículas pequeñas de sílice o alumina) o partículas
porosas (partículas más grandes).
• Muchas veces para alargar la vida de la columna
analítica se utilizan precolumnas con el objeto de
retener impurezas de la muestra que podrían
perjudicar la columna cromatográfica.
• El relleno de la precolumna es similar al de la columna
pero con mayor tamaño de partícula.
 COLUMNA CROMATOGRAFICA
• Es el elemento fundamental del sistema
cromatográfico, pues en ella tiene lugar la separación.
• Resulta fundamental una correcta elección de la
columna adecuada para cada separación.
• Las columnas más utilizadas son las de relleno
• En la actualidad hay columnas capilares en las que se
usan tubos de 200-500 um de diámetro y de gran
longitud (varios metros), en las cuales la fase
estacionaria se encuentra ligada químicamente a las
paredes del tubo, por lo que se innecesario la
utilización de partículas de fase estacionaria.
 COLUMNA CROMATOGRAFICA
• Las características que influyen sobre la
capacidad de separación son:
- Diámetro interno
- Longitud
- Conexiones
- Relleno
- Tamaño de partículas de relleno.
PRECOLUMNAS
• Para aumentar la
vida y prestaciones
de la columna
analítica o
preparativa, se
recomienda que se
protejan de la
contaminación
proveniente de la
muestra, del
solvente o de la
matriz.
 HPLC: DETECTOR
Debe ser sensible a pequeñas concentraciones
de analito, dar una respuesta lineal amplia,
tener poco ruido de fondo, y ser estable en el
tiempo que dura el cromatograma.
• Permite medir a la salida de la columna, una
propiedad física del eluyente.
• La detección se realiza en contínuo.
 DETECTORES
• Se pueden dividir los detectores en dos grandes
grupos:
- Los que aportan información estructural sobre las
sustancias eluídas (permiten la obtención de
espectros de las sustancias que salen de la
columna) y aquellos que no la aportan (son los
más usados).
- Entre los del segundo grupo tenemos: detector
de índice de refracción, de ultravioleta y/o visible,
de fluorescencia, de conductividad eléctrica,
electroquímico.
 HPLC
• La elución de los componentes de una muestra
comprende el lavado de una parte de la muestra
disuelta en la fase móvil a través de una columna de
fase estacionaria por agregado de disolvente fresco. La
porción de muestra se introduce por la parte superior
de la columna (tiempo t0), los componentes se
distribuyen por sí mismos entre las dos fases según la
naturaleza química de éstos con respecto a las fases
móvil y estacionaria.
• Adiciones posteriores del disolvente llevan a las
moléculas de soluto hacia abajo en la columna, hasta
que salen de ella en una tiempo determinado.
 HPLC
• La velocidad a la cual un soluto migra
depende de la fracción de tiempo que ha
necesitado para salir de la columna, tiempo
que es detectado por un detector.
• Esta velocidad será pequeña para solutos
fuertemente retenidos por la fase
estacionaria, y será grande para solutos que
tengan mayor afinidad por la fase móvil.
 HPLC
• El detector se coloca en el extremo final de la columna,
y la señal se transforma en una gráfica en función del
tiempo denominada cromatograma.
• El cromatograma discurre horizontalmente paralelo a
la escala de tiempos (línea de base), zona que
informa de las condiciones generales del sistema en
ausencia de solutos.
• Luego se observa un brusco incremento sobre la línea
base, seguido de un descenso más o menos simétrico
que enlaza con la continuación de la misma (pico
cromatográfico).
 HPLC
• Idealmente el pico tiene apenas anchura: es estrecho,
casi una línea vertical. Pero muchas veces presenta una
anchura apreciable, tomando el aspecto habitual de
una gaussiana.
• También se presenta una primera banda peculiar
ascendente-descendente (frente del disolvente o
frente de inyección), no siempre observable, y que
suele hacerse coincidir con el tiempo muerto del
sistema o tiempo necesario para que un fluido sin
retención atraviese físicamente la columna, tubos, etc.
del sistema.
 HPLC
• Las moléculas de un mismo soluto, pese a
hallarse sometido a las mismas fuerzas, no
eluyen todas al mismo tiempo, sino
obedeciendo a un modelo gaussiano.
• Los picos sobre el eje de los tiempos se
emplean para identificar tanto cualitativa
(posición en el eje) como cuantitativamente
(área bajo los picos) los componentes de la
muestra
 HPLC
• La cromatografía cuantitativa se basa en
una comparación de la altura o del área del
pico de un analito con el de uno o más
estándares. Ambos parámetros varían
linealmente con la concentración.
• La cromatografía cualitativa se basa en la
comparación de la posición de los picos
(tiempos determinados de retención) con
cromatogramas estándares.
CROMATOGRAMA
 HPLC
• Los disolventes más utilizados son el agua, el
metanol y el acetonitrilo.
 CAMPOS DE APLICACION
• Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides,
analgésicos
• Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos,
lípidos
• Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales,
antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
• Productos de la industria química: Aromáticos
condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes
• Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB
• Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre,
narcóticos
• Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de
drogas, extractos de orina, estrógenos.
 CROMATOGRAFIA DE GASES
• La cromatografía de gases es una técnica
cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y
se inyecta en la cabeza de una columna
cromatográfica.
• La elución se produce por el flujo de una fase
móvil de gas inerte.
• A diferencia de los otros tipos de cromatografía,
la fase móvil no interacciona con las moléculas
del analito; su única función es la de transportar el
analito a través de la columna.
 CROMATOGRAFIA DE GASES
• Existen dos tipos de cromatografía de gases
(GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la
cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta
última la que se utiliza más ampliamente, y
que se puede llamar simplemente
cromatografía de gases (GC).
• En la GSC la fase estacionaria es sólida y la
retención de los analitos en ella se produce
mediante el proceso de adsorción.
CROMATOGRAFO DE GASES
 CROMATOGRAFO DE GASES
• Un cromatógrafo de gases consta de: sistema
de suministro de fase móvil, sistema de
inyección de muestra, columna cromatográfica
situada en horno termostatizado y detector.
 CROMATOGRAFO DE GASES
• El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reacción con
el analito o la columna.
• Generalmente se emplean gases como el helio, argón, nitrógeno,
hidrógeno o dióxido de carbono, y la elección de este gas en
ocasiones depende del tipo de detector empleado.
• El almacenaje del gas puede ser en balas normales o empleando un
generador, especialmente en el caso del nitrógeno y del hidrógeno.
• El suministro de gas va asociado con reguladores de presión,
manómetros y medidores de flujo.
 CROMATOGRAFIA DE GASES
• Para comprobar el caudal se puede utilizar un rotámetro, el cual da una medida muy
exacta del caudal volumétrico que entra a la columna.
• La inyección de muestra es un paso crítico, ya que se debe inyectar una cantidad
adecuada, y debe introducirse de tal forma que sea rápida para evitar el
ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas
de analito.
• El método más utilizado emplea una microjeringa (de capacidades de varios
microlitros) para introducir el analito en una cámara de vaporización instantánea.
Esta cámara está a 50ºC por encima del punto de ebullición del componente menos
volátil, y está sellada por una junta de goma de silicona septa o septum.
 CROMATOGRAFIA DE GASES
• Columna cromatográfica en horno
termostatizado: en ella se produce la separación
de los analitos.
• Existen dos tipos de columnas: empaquetadas y
capilares.
• Empaquetadas: rellenas con un soporte sólido de
grano muy fino que puede actuar como fase
estacionaria. El material debe ser inerte y
resistente a elevadas temperaturas.
• Estas columnas poseen diámetros de 3-6mm y
longitud de 1-5 metros.
 CROMATOGRAFIA DE GASES
• Las columnas tubulares o capilares son más
estrechas (0.2-0.5 mm) y más largas (10-
100m).
• La pared interior de la columna se recubre con
una película de fase estacionaria con un
espesor de pocas micras.
• La cantidad de muestra necesaria es menor.
• Poseen mucha mejor resolución, mayor
sensibilidad y menor tiempo de análisis.
• Las fases estacionarias juegan un papel primordial,
puesto que la fase móvil es inerte.
• Las fases estacionarias son en su mayoría líquidas y
deben cumplir una serie de requisitos:
• Baja volatilidad: su temperatura de ebullición debe
estar al menos 100 grados por encima de la
temperatura máxima de trabajo.
• Deben ser estables a temperaturas elevadas.
• Deben ser químicamente inertes.
• Se deben utilizar fases estacionarias polares para
separar compuestos polares; y apolares para
compuestos apolares.
 CROMATOGRAFIA DE GASES:
DETECTORES
El detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de poner de manifiesto
la presencia de solutos o analitos que salen de la columna cromatográfica. Las
características de un detector ideal son:
 Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisión cuándo sale
analito y cuando sale sólo el gas portador.
 Respuesta lineal en un intervalo amplio de concentración.
 Tiempo de respuesta corto
 Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura
ambiente hasta unos 350-400ºC, temperaturas típicas trabajo.
 DETECTORES

 No debe destruir la muestra.

 Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales
de analito debe dar salidas de señal iguales.
 Alta fiabilidad y manejo sencillo
 Respuesta semejante para todos los analitos,
 Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido
número de analitos.