Sunteți pe pagina 1din 59

REACTIA DE AGLUTINARE

Aglutinarea este un test serologic care se bazeaza


pe mecanismul de
legare a Ac la un Ag particulat
rezultand un conglomerat vizibil cu ochiul liber
(aglutinat)
REACTIA DE AGLUTINARE
calitativa/semicantitativa > titrare:
se utilizeaza in urmatoarele scopuri:
indicii despre concentratia
relativa a Ag/Ac in proba
a) dg serologic al bolilor infectioase
 se desfasoara in 2 etape:
b) detectarea Ac specifici tisulari in
a) combinarea specifica a Ac cu Ag bolile autoimune
pe suprafata celule /particule
c) detectarea prezentei DAg pe celule
b) formarea agregatelor vizibile aleAg
particulat d) tipizarea sangelui in vederea
transfuziei
COMPONENTELE
ESENTIALE ALE
TESTELOR SEROLOGICE

ANTIGENELE ANTICORPI
(Ag) (Ac)
Ag si Ac
IN REACTIA DE
AGLUTINARE IMUNA
Ag sunt: Ac sunt (aglutinine):
 particulate  participa la reactie > dilutii
seriate ale serului (bv)
 Cunoscute (laborator)
 au capacitate de aglutinare
 in cantitate constanta
diferita (~ izotipuri)
ex. Ig M dpdv functional sunt decavalente
teoretic si pentavalente practic
TITRUL

TITRUL aglutinant al serului =


inversul celei mai mari dilutii
care produce o aglutinare
acceptabila
ex: daca dilutia de 1/512 a serului produce o
aglutinare evidenta,
>la dilutia imediat urmatoare (1/1024) aglutinarea
= absenta,
>titrul aglutinant este de 512 U, =
serul imun contine 512 unitati aglutinante.
Titrul aglutinant- exprima in:
nr de unitati aglutinante de Ac/unitata de volum.
FORMAREA COMPLEXELOR IMUNE

Dimensiunea unui CI depinde de:

 valenta Ag

 concentratia Ac.

 Ac in exces > epitopii Ag se satureaza >>


CI de dimensiuni mici

 Ag, Ac:concentratii echivalente: o retea extinsa de CI

 Ag in exces > situsurile de combinare ale Ac se satureaza >


CI de dimensiuni mici
FACTORI CARE INFLUENTEAZA
REACTIA DE AGLUTINARE
 densitatea si dispozitia spatiala a D Ag de pe
suprafata celulelor / particulelor
 potentialul electric al reactantilor > variatiile de pH
 prezenta electrolitilor in mediul de suspensie ( la conc
fiziologica de NaCl)
 variatiile de temperatura
 durata incubatiei:
*pt aglutinarea bacteriana incubatia este de 1-2 ore la 37ºC;
Citirea finala a rezultatelor se face dupa 24 ore la temp camerei
REACTIA DE AGLUTINARE

Principiul reactiei Tipuri majore de


aglutinare:
 Ag particulat + Ac >> aglutinare Aglutinarea bacteriana

Hemaglutinarea:
 Formarea aglutinatului:
Imuna
Ag se leaga la Fab a 2 Ac >>
punti intre Ag Pasiva

virala
REACTIA DE AGLUTINARE
METODOLOGIE

 Ag particulat (vol. Cunoscut; orig-lab)


 (Ac?) Ser pacient (vol fix in dilutii seriate (scala geom= 2).

 omogenizare reactanti > incubare ~2h.


 Aglutinarea este vizibila cu ochiul liber = Ac sun prezenti in
serul bv=Dg+
!* La dilutii mari ale serului nu mai obtinem aglutinarea = Ag particulat
ramane in suspensie.
REACTIA DE AGLUTINARE
APLICATII

AGLUTINAREA BACTERIANA
 se foloseste in laborator pt a stabili titrul de Ac serici in bolile infectioase
EX: tifos exantematic, infectii cu Brucella,enterobacterii- Salmonella
 exista 2 forme:
a) aglutinare de tip H (hauch = val): produsa de o suspensie de celule bacteriene
flagelate in cursul careia se formeaza flocoane bacteriene mari si laxe;
*Ag flagelare aglutineaza (flagelilor bacterieni) interactioneaza cu Ac specifici

b) aglutinarea de tip O sau somatica (ohne hauch = fara val): produsa de bacteriile
imobile; se formeaza conglomerate celulare dense, compacte, in care celulele
bacteriene reactioneaza prin intermediul Ag somatice reprezentate de LPS
(lipopolizaharide =componente majore ale suprafetei celulelor Gram -).
* Ag somatice interactioneaza cu Ac specifici serici.
AGLUTINAREA BACTERIANA
TESTUL WIDAL
Utilizare: Dg serologic al
infectiilor cu Salmonella
Typhi
 Georges-Fernand-Isidor
Widal si Sicard in 1896 au
descris Reactia Widal
 Acest test si-a dovedit valoarea de
dg in cazurile in care nu se puteau
obtine cultivarea celulelor
TESTUL WIDAL

Utilizare: dg febrei tifoide

Principiul testului Widal:

 Ac (ser bv) reactioneaza cu

 Ag (pe suport solid-lab)>aglutinare vizibila


TESTUL WIDAL

poate fi facut
in tub:dilutii seriate >

titrul
 pe lama: calitativa
DG SEROLOGIC AL INFECTIILOR
CU SALMONELLA
serotipizare serodiagnostic
identificarea tipurilor al febrelor tifoide/paratifoide
serologice de Salmonella cu un set de Ag
utilizandu-se seruri
standardizate:
imune cu specificitate
Reactia de aglutinare =
cunoscuta prin reactia
T Widal in tuburi
de aglutinare in tub sau
pe lama
SERODIAGNOSTIC:
REACTIA DE AGLUTINARE
(T WIDAL)
Materiale necesare: Evidentiaza
1) Ag standardizate O, H: Ac anti-H care sunt puternic
suspensie celulara alcoolata stimulati
O ( 500 mil cel/ml)si
1) prin vaccinare specifica
suspensie celulara formolata
2) dupa infectie cu tulpini
pt H (500 mil/ml)
flagelate
2) Dilutii seriate ale serurilor de
* suspensiile antigenice Vi
la bolnavi
sunt alcoolate
AGLUTINAREA-
CUM APARE DUPA REACTIE

Aglutinarea O este granulara


 Aglutinarea H este slaba si floculara
Citirea si interpretarea rezultatelor

 Aglutininele anti-H si anti-O apar in ser in prima


saptamana de boala;
titrul lor creste pana la maxim in zilele 16-29 de la debut
si ramane ridicat in convalescenta si o scurta perioada
dupa vindeare.

 Aglutininele anti-H au un titru inalt ( 1/1000-1/5000) iar


aglutininele anti-O : 1/250-1/1000.

 reactie pozitiva:
 >1/500 pt aglutininele anti-O

 > 1/1000 pt aglutininele H.


AGLUTINAREA-REMEMBER
 este o reactie Ag-Ac
 Ac specifici din ser aglutineaza
bacteria at c sunt prezenti Ag
correspunzatori
 Rezultatul este observabil ca o
solutie particulata/ conglomerate
vizibile
 Gradata dupa intensitate ca fiind
1+, 2+, 3+, si 4+
 4+ reprezinta un background clar
cu o aglutinare de 100%
 aglutinarea O este granulara
 aglutinarea H este slaba si
floculara
PROBLEME CU TESTUL WIDAL
 detecteaza doar Rezultatele aglutinarii:
Ac aglutinanti Titrurile > 1:100= Ac+
 posibile aglutinari pt Ag somatice si
nespecifice flagelare
Titrurile > 1:40= Ac + pt
Ag Vi
*Titrurile pozitive variaza de la un
laborator la altul!
CAUZE DE REZULTAT
FALS-NEGATIV IN T. WIDAL

 Ag bacteriene nu sunt expuse la suprafata si nu sunt accesibile


reactiei cu Ac <Ag capsulare: mascheaza Ag O:
se utilizeaza un preparat Ag bacterian supus in prealabil tratamentului
termic pt a expune Ag O al suprafetei celulare.
 Statusul de purtator : o inoculare inadecvata de Ag bacterian care la
nivelul gazdei nu reuseste sa induca producerea de Ac.

 Dificultati tehnice /erori de procedura.

 Tt anterioare cu ATB.

 Variatii in prepararea kiturilor comerciale


HEMAGLUTINAREA
REACTIILE DE HEMAGLUTINARE
UTILIZEAZA HEMATIILE CA:
Celule indicator
Ag

APLICATII:
Tipizarea sangelui (hemaglutinare directa)
Diagnosticul unor anumite boli (hemaglutinare pasiva)
Identificatrea unor virusuri (hemaglutinarea virala )
HEMAGLUTINAREA DIRECTA
PRINCIPII IMMUNOLOGICE

Componentele immunologice principale:


Ag (de pe RBC) & Ac

APLICATIE PRINCIPALA:
TIPIZAREA GRUPELOR DE SANGE

REGULA DE AUR:
Ag sunt pe suprafata RBC
Ac sunt in ser
SISTEMUL ABO
AL GRUPELOR SANGVINE
Exprimat in → tesuturi & fluidele CLASIFICAREA Ac DE GRUP
organismului inclusiv pe RBC, SANGVIN
plachete & celule endoteliale
Alloanticorpi:
3 Ag: A, B, H
•Reactioneaza cu Ag straine care nu
2 Ac: anti-A and anti-B sunt prezente pe propriile RBC
4 fenotipuri: A, B, AB, O → •Sunt produse ca rezultat al
stimularii imune via transfuzii/sarcina
A & B: transmitere fenotipica
autozomal co-dominanta Autoanticorpii:
(exprimata pe group A / B / AB de
Reactioneaza cu Ag de pe propriile
pe RBC);
RBC/ acelasi Ag de pe celulele altui
individ
REACTIVITATEA INCRUCISATA
Ac > reactie incrucisata cu Ag nespecific
in cazul in care Ag impartasesc un epitop similar/ identic

TESTAREA GRUPELOR SANGVINE

DIRECT / FORWARD TYPING INDIRECT/REVERSE TYPING


BETH-VINCENT TEST (SIMONIN TEST)
Testare pt Ag Testare pt Ac
RBC pacient = Ag ? Ag cunoscut (celula)
necunoscute
Ac ? necunoscut (serul pacientului)
seruri (Ac) cunoscuti serul este combinat cu celule cu Ag cunoscut intr-o
proportie de 2:1

METODA: pe lama/in tub METODA: pe lama/in tub


Grup O, Rh+
Fara aglutinare cu serul anti-A si anti-B
Da aglutinare cu serul anti Rh

Grup B, Rh-
Fara aglutinare cu serul anti-A si anti-Rh
Da aglutinare cu serul anti-B
SISTEMUL DE GROUP SANGVIN Rh
CLASIFICARE/NOMENCLATURA
Wiener Antigenele Rh
IPOTEZA ALELELOR
MULTIPLE Sistem complex reprezentat de cateva
5 Ag: Rho, rh’, rh”, hr’, subunitati Ag : A, B, C, D, E.
hr”
Rosenfeld Contine 3 proteine membranare
Sistem Numeric integrale
Rh1 - Rh5 RhD/Rho ( important)
Fischer & Race RhCcEe
3 allele: D/d, C/c and Rh> Asociate cu GP:(Rh50, RhAg)
E/e
5 Ag: D, C, E, c, e Antigenul D → consta intr-o
d → fara locus D → proteina:
fara produsi antigenici RhD→cel mai immunogenic >
urmat de c, E, C e
TESTARE Rh

Testarea pt Ag Rho (D) :

 Folosim ser uman

 RBC (Ag=parte integrala din membrana, mult mai putin


numeroase decat Ag ABO)

 Mediu de reactie (proteine)


Rh-varianta Du

Weak D Antigen (Du)


Varianta Rho >
Aglutinare slaba/absenta a RBC cu serul anti-D →
poate fi detectat doar cu
reactivul anti-globulina umana (R Coombs) (anti-D
bovin)

Varianta slaba este produsa in 3 situatii:

Lipseste o parte din Ag D


Gena D este translocata pe cromozomul opus genei
C → (+) impiedicare sterica
Mostenirea unei gene ce codifica mai putin Ag D
HEMAGLUTINAREA PASIVA

OBIECTIVE: COMPONENTE:
detectarea titrurilor scazute
de Ac serici (ex Rh Du) Suport solid pt Ag solubil
(cunoscut)
PRICIPIU: RBC = celule indicator
Ac (bv ser) reactioneaza Particule de latex
cu Carbune
Ag adsorbit pe RBC > Bentonita
hemaglutinatinare Serul > Ac necunoscut

*(RBC = pasive, nu
participa to reactie)
HEMAGLUTINAREA PASIVA
APPLICATII:
TESTUL ANTIGLOBULINIC

TESTUL ANTIGLOBULINIC
TESTUL ANTI-HUMAN GLOBULIN (AHG),
TEST COOMBS

UTILIZARI:
Detectarea Ac (IgG) anti-eritrocitari cu specificitate pt sistemul
ABO/Rh
PRINCIPIUL TESTULUI
ANTIGLOBULINIC
Metoda:
1) RBC > sensibilizate prin acoperirea cu IgG / complement >
Nu vor aglutina direct cand sunt centrifugate.
Pt a obtine aglutinarea:
2) + alt Ac > reactioneaza cu RBC prin Fc (IgG) sau C3b/C3d
3) > "punte" intre : Ac /C' adaugat si IgG de pe RBC > aglutinare.

RBC acop cu IgG RBC acop cu Complement


PRINCIPIUL TESTULUI
ANTIGLOBULINIC(II)
Avem nevoie de:

Reactiv anti-globulinic (Reactiv Coombs ) care se va lega de


 Fc (IgG )atasata la RBC
 C3b/C3d atasata la RBC.

Pt a obtine reactivul anti-globulinic (Coombs):


 Iepuri > immunizati cu gamma globulina umane
 produc Ac (reactiv AHG ) fata de IgG / C3d.
TIPURI DE
TESTE ANTIGLOBULINICE

Prima data Coombs si Mourant au detectat acesti Ac in vitro


(prin Testul Antiglobulinic Indirect) in special cei legati de
sistemul Rh, care pot produce boala hemolitica a nou-
nascutului.
Exista doua tipuri de teste antiglobulinice:
1. Direct Antiglobulin Test (DAT) – detecteaza in vivo Ac
/C3 de pe RBC
2. Indirect Antiglobulin Test (IAT) – utilizeaza o etapa
suplimentara de incubatie la 37oC > detecteaza Ac
serici care pot reactiona cu Ag de pe celule in vitro.
Dupa spalarea RBC, reactivul Coombs este utilizat pt
detectarea Ac de pe RBC
TIPURI SPECIFICE
DE REACTIVI AHG (COOMBS)
 Ser , polispecific (policlonal) anti-human:
amestec de Anti-IgG & Anti-C3b, -C3d
 Reactivi monospecifici (monoclonali)
Anti-IgG / Anti-C3b,-C3d

*Nota:
*Reactivii nu contin Ac IgM. Prezenta Ac IgM pe
RBC este evidentiata de C3 (IgM = puternic
activator al C').
REACTIVI
Reactivul Anti-Human globulin (AHG or Coombs)

Pot fi obtinuti prin:


 injectarea iepurilor cu IgG / C3 uman purificat >
recoltarea Ac produsi de iepuri >
ser poli/monospecific
 tehnologia Ac monoclonali > ser monospecific
TEHNOLOGIA
AC MONOCLONALI
SUMARUL REACTIEI
 RBC acoperite cu Ac* IgG si/sau C' (in vivo/in vitro-
prin incubare cu seruri lab)
 RBC > spalate 3-4X pt indepartarea Ac/C'
liberi/nelegati
 Ramane doar Ac/C' atasat la RBC
 Ad R. AHG (Coombs)
 Ac din R. Coombs reactioneaza cu IgG/ C3b/C3d din
C' de pe RBC, > aglutinarea
 Daca NU aglutinare > verificam prin add Coombs
control reagent cells* (CCC).
*joaca rol de Ag
TESTAREA ANTIGLOBULINICA
INDIRECTA
Este utilizata in mod frecvent pt
detectarea:

1) Du slab la donatorii de sange si la femeile insarcinate


cu D(-) la R.T. la tipizarea ABO si Rh.
2) Prezenta sau absenta Ag din sistemele minore de
grupe sangvine ( Kell, Kidd, si Duffy).
3) Ac neasteptati, semnificativi clinic descoperiti in teste
screening.
TESTAREA ANTIGLOBULINICA
INDIRECTA
SCOP:
detectarea in vitro a sensibilizarii RBC .
Se face at c sensibilizarea nu duce direct la
aglutinare <
-sunt prea putine Ag pe RBC,
-sunt prea putini Ac in ser si/sau sunt IgG .
TESTAREA ANTIGLOBULINICA
INDIRECTA
PRINCIPIU
Incubarea RBC cu serul bv la 37oC x 15 -30 min.
Spalari RBC 3-4x .
Add R. AHG (Coombs) > centrifugare > citirea
aglutinarii
Daca test - >
add Coombs Control Check Cells pt verificarea
rezultatelor fals-negative
INTERPRETATION OF ANTIGLOBULIN TESTS
Wash cells three
times to remove
unbound antibody
At ca RBC sunt Only antibody
acoperite attached to the cells
(sensibilizate) in remain
vivo/in vitro
>interpretarea
finala se bazeaza
pe prezenta/nu a Add Anti-Human
hemaglutinarii Globulin

1) Positive Visible Agglutination in


Antiglobulin the test tube:
Test Grade the reaction
strength
NEGATIVE ANTIGLOBULIN TEST
Antibodies are not
attached to the
antigens during
incubation.

Wash the cells 3 times


to remove any
unattached antibodies.

Add Anti-human
globulin

No visible agglutination
and therefore a negative
test

Add Coombs Control


Check Cells
DAT POZITIV
 Dg:
 anemia hemolitica autoimuna (dem prezenta AAc anti RBC)
 Boala hemolitica a nou-nascutului (dem prezenta Ac anti
Rh/anti ABO)
 Transfuzii recente (RBC/plasma/masa tr)
 Medicatie
 Cautam alte date de lab care indica o distructie
RBC: Ht, bilirubina, LDH)
CAUZE CLINICE DE DAT POSITIV

Sensibilizarea hematiilor datorata medicamentelor:

– penicilina si cephalosporinele pot induce acoperirea


nespecifica a RBC
– tetraciclinele, antihistaminele si sulfonamidele pot
determina aparitia unor CI capabile sa activeze C'3
– ibuprofen, levodopa si methyldopa pot produce reactii
autoimune.
*Daca pacientul are un DAT+ > trebuie luate in
considerare reactii induse de medicamente
THE END
IMPORTANTA T WIDAL

A scazut datorita:

 Incidenta febrei tifoide a scazut


 A crescut utilizarea vaccinarii in masa
TESTAREA PURTATORILOR DE
TIFOS

 Cei mai multi purtatori de bacili tifoizi au Ac anti-


Vi Ag (Salmonella T)

 Titrurile de Ac anti-Vi par sa se coreleze mai


bine cu starea de purtator decat cele de Ac anti-
O/ H>

> utilizarea aglutinarii anti-Vi (R Felix)


REACTIA WEIL-FELIX

 In 1915, Weil si Felix au aratat ca in serul pacientilor infectati


cu oricare membru al grupului de Salmonella typhi contine
aglutinine pentru 1/mai multe linii de Proteus OX.
 In cazul febrei tifoide reactia apare in <6zile si se obtine max<
2 sapt.
 T. Weil-Felix se bazeaza pe cross-reactivitatea cu Ag OX-19
and OX-2 ale P. vulgaris si OXk de P mirabilis, in care,
 in serul pacientilor este cautat Ac anti-OAg
INTERPRETAREA T. WEIL-
FELIX
Serul < bv tifos endemic aglutineaza Ag OX19,
OX2.
Ag< scoamele de tifos aglutineaza liniile Oxk.

Testul este negativ in eruptia rickettsiala si in


febra Q.
R fals- pozitive pot aparea si in infectii urinare

cu Proteus
TESTUL FELIX-WEIL

 este indicat atunci cand avem un pacient cu o eruptie


 dg tifos, anumite boli ricketsiale

 Bv suspectat de ricketsia> testat anti- (OX-2, OX-

19, OX-K).
SERO CONVERSIA

Reprezinta dezvoltarea
in ser,
ca rezultat al unei
infectii sau a unei
imunizari,
a unui titru detectabil de
Ac specifici fata de
microorganisme
SERO REVERSIA

Sero reversia este


opusul seroconversiei
Apare atunci cand

testele serologice nu
mai pot detecta
prezenta unor Ac/Ag in
serul unui pacient
TESTAREA IN PERECHE

Testarea pentru bolile


infectioase > in pereche:
 in faza acuta,

 in faza convalescenta

(~ la 2 sapt)

 Clinic semnificativ:
 Crestere de 4x a titrului

 Reactie + in 2 tuburi
aglutinare
Ag SOMATIC (O)
 localizare: perete celular > prezinta Ag O - clasificare
variatii de ordin chimic.
Ag majore:
 Toate liniile de Salmonella cu
> specificitatea de
> Ag O comun = un grup serologic.
grup
Genul Salmonella > 47 de grupe
Ag minore:
serologice (noteaza cu majuscule
de la A.....Z iar ultimile 15 grupe cu =modif chim minore
numere 51-56) ale Ag majore

AgO> Corespunde endotoxinei,


Ag SOMATIC (O)

Somatic
Stabil termic

Produce o aglutinare
granulara > in varianta
smooth (S) sau rough (R)
Unele dintre acestea pot fi

supuse la conversie
lysogenica de catre
bacteriophagi
Ag FLAGELAR (H)
se gaseste numai la formele mobile
 imprima specificitatea de de tip antigenic (aprox 2000 de

variante Ag H = serotipuri)

Stabile termic
Apar in flageli

Compuse din flageline

(proteine)
 Aglutinarea este rapida,

slaba si floculara
Pot aparea variatii de
faza reversibila
Ag DE INVELIS(Vi=K)

= de suprafata,
 situat > perete (K=Kapsel= capsula)

 actioneaza ca factor de virulenta


 structura G-L-P
 tulpinile bact care au Ag Vi vor fi aglutinate numai
de Ac anti-V
 Ag Vi se gaseste la putine serotipuri de
Salmonella, > rezistenta la fagocitoza
* chiar daca se afla in cantitate prea mica pt a
forma o structura capsulara vizibila, este suficient
pt a masca Ag O > inhiba aglutinarea celulelor
respective in prezenta serului specific anti-O.
TESTUL STANDARD AGLUTINARE
PT Ac SERICI ANTI- S. Tpyhi, S.
Paratyphi

Pentru suspensiile de Pentru suspensiile de H


Ag O & Vi : Incubare la 56ºC x 2 h
 Incubare la 37ºC x 2 h
 Frigider o.n. la 4ºC
 Incubare la R.T. x2 h
inainte de citire
REACTIA DE AGLUTINARE
UTILIZARI
se utilizeaza in urmatoarele
scopuri:
Variante :
pe lama
a) dg serologic al bolilor infectioase
in tub
b) detectarea Ac specifici tisulari in
bolile autoimune
pe microplaci speciale

c) detectarea prezentei epitopilor


antigenici de pe celule

d) tipizarea sangelui in vederea


transfuziei