DIAGNOSTICUL DE

LABORATOR AL INFECŢIILOR
VIRALE
 DIAGNOSTICUL INFECŢIILOR
VIRALE

Argumente:
• clinice (sdr. clinic, debut, evoluţie, patologia asociată)
• epidemiologice (vârsta, sex, sezonalitate, etc.)
• laborator
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE

Indicaţii:
• alegerea terapiei etiotrope;
• monitorizarea eficienţei terapiei;
• adoptarea măsurilor de profilaxie şi com-
batere în focar a unor boli contagioase;
• supravegherea epidemiologică a unor boli
infecţioase.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE

• Nejustificat (tardiv, fără consecinţe terapeutice)?

• Inaccesibil (infrastructură complexă, personal
înalt calificat)?
• Costisitor ?
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE

În prezent:
• justificat şi necesar (metode de diagnostic
rapid, antivirale eficiente);
• accesibil (cel puţin pentru anumite metode);
• cost / eficienţă.
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE

Indicaţii:
• iniţierea şi monitorizarea terapiei antivirale
(v. gripale, HSV1, HSV2, CMV, HIV, HBV,
HCV);
• stabilirea conduitei terapeutice sau profi-
lactice (herpes genital prepartum, infecţie
cu v. rubeolic, HIV la gravidă).
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE
• Adoptarea măsurilor de profilaxie şi comba-
tere în focar a unor boli contagioase (HAV).
• Supravegherea epidemiologică şi adoptarea
măsurilor de sănătate publică (triajul donato-
rilor de sânge şi organe, supravegherea epi-
demiilor gripale, a virusului SARS).
• Evidenţierea unor infecţii noi, virusuri noi sau
a unor noi asocieri virus-boală.
DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE

Tipuri de laboratoare:
• Laboratoare clinice
• Institute/centre de Sănătate Publică
• Centre de referinţă
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR
AL INFECŢIILOR VIRALE
METODE NESPECIFICE
METODE SPECIFICE

Metode directe Metode indirecte

• ex microscopic (ME, IF) • evidenţierea
anticorpilor specifici
• evidenţierea antigenelor virale
• evidenţierea secvenţelor ac.
nucleic
• izolarea - identificarea
• ex. citologic (MO)
 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL
INFECŢIILOR VIRALE - ETAPE

• Cooperarea clinician – medic de laborator!

• Alegerea celui mai potrivit test (contextul clinico-
epidemiologic)
• Alegerea produsului patologic:
tipul (sdr. clinic, stadiul bolii);
momentul prelevării;
metoda de recoltare şi transport.
 PRODUSE PATOLOGICE UTILIZATE
ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC
• Sdr respiratorii: exsudat nazal, exsudat faringian,
lichid de spălătură nazală, spută
• Sdr digestive: materii fecale, tampon rectal
• Rash vezicular: lichid vezicular, produs de raclaj
• Infecţii urinare: urină
• Infecţii oculare: raclat conjunctival sau corneean,
exsudat faringian
• Sdr meningian/ encefalitic: LCR, biopsie cere-
brală, materii fecale, salivă, ţesuturi
• Sânge
 MOMENTUL PRELEVĂRII ÎN
DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

OPTIM – primele 2 – 3 zile de la

debutul bolii (diagnostic direct)!
 PRELEVAREA ÎN DIAGNOSTICUL
VIROLOGIC

• Tipul produsului patologic

• Expediere imediată
• Mediu de transport
• Refrigerare (+4 +8 ºC), nu congelare
(-15 -20 ºC)
• Lichid amniotic: se aspira lichidul cu seringa si se
injecteaza apoi intr-un tub steril.
• Scop: cultivare virusuri
• Sange periferic: se decontamineaza tegumentul.
Se folosesc tuburi cu heparina sodică
• Scop: cultivare virusuri
• Biopsie cerebrala: probele se transporta in mediu
de transport M4
• Scop: cultivare, PCR pentru VHS
• Bronhoscopie: se recomanda aspirarea secretiilor
prin camera interioara a bronhoscopului într-un
recipient steril cu 1 ml solutie salină. Se transportă
imediat la laborator.
• Scop: cultivare virusuri
• Cervix: se foloseste speculum fara lubrifiant.
• Se indeparteaza excesul de mucus si puroi cu ajutorul
tampoanelor de descarcare.
• Se introduce un tampon mic in endocervix si se roteste pentru
15 – 30 secunde.
• Se evita atingerea peretilor vaginali cu tamponul. Se compri-
ma usor cervixul între lamele speculului si se exprima puroiul
eventual existent.
• Se introduce tamponul intr-un tub colector.
• Daca sunt prezente leziuni, acestea se comprima cu un alt
tampon, care se introduce intr-un mediu de transport M4.
• Scop: cultivare virusuri si PCR
• Cornee: raclajul corneean este realizat de catre medic. Este
indicat a se introduce raclatul in mediu de transport M4
• Cultivare VHS
• LCR: se decontamineaza pielea. Se realizeaza punctie
lombara, ventriculara sau suboccipitala. Se strimite LCR
intr-un tub steril cu capac insurubat. Nu se foloseste mediu
M4. Se transporta in laborator imediat dupa prelevare.
• Cultivare virus si PCR pentru VHS.
• Ureche interna: se curata canalul extern cu antiseptic cu
actiune medie. Se preleva puroiul aseptic.
• Cultivare virus
• Ochi (extern): se indeparteaza machiajul. Se antisepti-
zeaza tegumentul din jurul ochilor cu antiseptic slab. Se
trece de 2 ori un tampon umed la nivelul conjunctivei.
Evitati atingerea pleoapelor. Se foloseste mediu de
transport M4.
• Cultivare virus
• Leziuni herpetice: se sterge viguros baza unei vezicule
deschise cu un tampon, se trimite produsul in mediu de
transport M4.
• Cultivare VHS, PCR
• Biopsie pulmonara: se decontamineaza tegumentul. Se
efectueaza doar de catre specialist. Se trimite produsul la
laborator in mediu de transport M4.
• Cultivare virus
• Spalatura nasala / aspirat nasal: capul pacientului este
indicat a fi inclinat sub un unghi de 70°. Se aspira in
seringa 1 ml solutie salina. Se introduce lichidul in narine.
Se colecteaza lichidul si se reintroduce de cateva ori. La
final se colecteaza lichidul de spalatura intr-un tub steril
insurubat. Se trimite imediat la laborator. Detectarea rapida
de virus gripal este posibila in sezon epidemic.
• Cultivare virus gripal, virus respirator sincitial.
• Nasofaringe: se introduce un tampon subtire, in nasofaringe,
in cavitatea nasala. Se tine tamponul aproape de septul nasal.
Se roteste tamponul si se retrage. Se transporta imediat la
laborator. Se foloseste mediu de transport M4.
• Cultivare virus; detectare VRS
• Lichid pericardic, pleural, peritoneal: se decontamineaza
tegumentul.
• Se recomanda aspirarea sterila a câţiva ml intr-o seringa. Se
introduce lichidul intr-un recipient steril, cu capac.
• Cultivare virus
• Rash: se curata suprafata cu alcool 70%. Se instileaza o
cantitate mica de solutie salina si apoi se aspira intr-un tub
steril. Se foloseste mediu de transport M4.
• Pentru rash vezicular se curăţă viguros cu un tampon baza
veziculelor proaspete.
• Cultivare virus si IF directa pentru V Varicella Zoster
• Tampon rectal: in timpul proctoscopiei sau sigmoidoscopiei
se ating cu tamponul leziunile de la acest nivel. Se introduce
tamponul in mediu de transport M4.
• Cultivare virus
• Lichid şunt: se decontamineaza tegumentul si cateterul. Se
aspira steril de la nivelul şuntului si se conditioneaza intr-un
recipient steril.
• Cultivare virus
• Materii fecale: se colecteaza in recipiente curate, uscate, cu
capac. Daca se recolteaza in plosca, se evita contamina-rea cu
urina sau dezinfectante. Transportul nu trebuie sa depaseasca
1 ora.
• Cultivare virus. Detectie Rotavirus (e.g. LA).
• Faringe: tampon ce prelevă exudatul faringian sau
de la nivelul membranelor formate. Se şterg viguros
criptele amigdaliene. Nu se atinge mucoasa bucala
sau limba!
• Cultivare virus
• Ţesut: se recolteaza de catre medic
• Cultivare virus
• Aspirat traheal: secretiile se transporta in container
steril.
• Cultivare virus
• Secretie uretrala: se recolteaza la o ora dupa
ultima mictiune. Se introduc tampoane f subtiri,
de 2 – 4 cm in uretra si se rotesc timp de 3 – 5
secunde. Se depune tamponul intr-un tub colector.
Pentru VHS se foloseste mediu de transport M4.
• PCR pentru VHS2; Cultivare VHS
• Urina de la nivelul cateterului: se dezinfecteaza
tubul cu alcool. Se aspira urina cu o seringa
sterila. Se transporta in container steril. Se refrige-
reaza imediat.
• Cultivare virus
• Urina suprapubiana / citoscopie: se realizeaza
recoltarea de catre medic intr-un recipient steril; se
refrigereaza imediat.
• Cultivare virus
• Vagin: se foloseste speculum cu lubrifiant. Se
introduce un tampon steril in vagin. Mediu M4 pentru
VHS.
• Cultivare VHS, PCR
• Vulva: nu se foloseste alcool pentru membranele
mucoase. Tegumentul se antiseptizeaza. Se colecteaza
cu tamponul sau se aspira cu seringa. Mediu M4 pentru
VHS.
• Cultivare VHS, PCR
 Diagnosticul direct
• Examinarea directă a produselor patologice
* Detectarea de antigene:
– evidentiere de virus - ME si identificare - IEM
– imunofluorescenţă (IF),
– teste imunenozimatice (ELISA – enzime linked
immunosorbent assay);
– latex aglutinarea (LA);
* Detectarea genomului
– PCR si RT-PCR
 Diagnosticul direct
• In examinarea directă, produsele patologice
sunt examinate pentru evidenţierea:
– virusului;
– antigenelor virale;
– a genomului;
– modificărilor histopatologice induse de către
infecţia virală.
 Diagnosticul direct
Avantaje:
• examinarea directă este rapidă,
• rezultatele fiind obţinute în aceeaşi zi, mai ales în
scopul instituirii chimioterapiei.
Dezavantaje:
• costul ridicat al tehnicilor,
• personalul de laborator înalt calificat, fac din aceste
metode apanajul laboratoarelor de cercetare sau special
echipate.
• Tehnicile de biologie moleculară au devenit, în ultimul
timp, din ce în ce mai accesibile, iar sensibilitatea şi
specificitatea lor, dublată de automatizarea metodei,
depăşesc aceste inconveniente.
 Diagnosticul direct
• Scăderea preţului de cost per determinare
reprezintă soluţia de viitor pentru extinderea lor
pe scară mai largă.
• Prin dezvoltarea tehnologiilor tip DNA chip se
vor putea detecta virusuri direct în produsul
patologic (PP), cu posibilitatea cuantificării lor,
în vederea monitorizării terapiei antivirale.
 Metode
– Microscopia electronică (ME) pentru evidenţierea
morfologiei şi dimensiunilor virusurilor şi identifi-
carea acestora utilizând imunoelectron-micros-
copia (IME).
– Microscopia optică: modificări histopatolgice şi
evidenţierea de incluzii.
– Detectarea genomului viral: hibridizarea şi reacţia
de amplificare genică (PCR – polymerase chain
reaction).
 Izolarea virusurilor

• Culturi de celule: evidenţierea efectului citopatic (ECP)

produs de către virusuri citopatogene; identificarea virusului
izolat prin IF, reacţia de neutralizare (RN), testul de hemad-
sorbţie, RIA, etc.
• Izolarea pe ouă embrionate în dezvoltare: evidenţierea de
pocksuri la nivelul membranei chorioalantoidiene (MCA),
urmată de identificarea prin RIH.
• Izolarea pe animale de laborator determină decesul sau
reproducerea bolii la animal, urmată de obţinerea de secţiuni
histologice şi examinarea lor prin MO pentru evidenţierea
unor leziuni caracteristice şi identificarea de antigene prin
RN, RIH, etc.
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC

Microscopia electronică (ME)

 sensibilitate redusă (106-7 virioni/ml)
 personal specializat şi infrastructură
complexă
 cost ridicat
 utilizare limitată
 Microscopia electronică (ME)
• presupune un laborator dotat cu ME cu putere de
mărire între 20.000-40.000X sau 50.000-60.000X.
• Pe lângă dezavantajele legate de echipamentul
scump, al necesităţii de personal înalt calificat şi al
costurilor ridicate pentru reactivi şi întreţinerea ME,
tehnica are şi dezavantajul unei sensibilităţi reduse,
deoarece limita de detecţie presupune prezenţa
virusului în PP în cantitate de aproximativ 106
particule virale/ml.
 Microscopia electronică (ME)
• Avantaje:
• rapiditatea detectării virusurilor şi utilitatea descrierii
morfologiei virusurilor;
• uneori reprezintă singura metodă de diagnostic, aşa cum s-a
întâmplat în cazul descrierii coronavirusului recunoscut,
ulterior, ca agent etiologic al SARS (sindromul acut respirator
sever).
• Dezavantaje:
• sensibilitatea redusă,
• cost ridicat,
• similitudini morfologice între diferite virusuri,
• imposibilitatea identificării serotipului.
 Microscopia electronică (ME)

• Produse patologice utile pentru detecţia de

virus:
• materii fecale (MF) pentru rotavirusuri,
adenovirusuri, virusul Norwalk şi virusurile
Norwalk-like, astrovirusuri, calicivirusuri;
• lichid vezicular pentru VHS şi VVZ;
• produs din leziunile cutanate pentru
papillomavirusuri, virusul orf, moluscum
contagiosum.
Picornavirusuri
 IME
• Creste sensibilitatea si specificitatea ME
• Variante ale IME:
• IEM clasică: proba este tratată, anterior examinării la
ME cu un ser specific cu Ac monoclonali, anti-virus
presupus prezent în PP.
• Particulele virale, prezente în probe vor aglutina şi în
final, se vor agrega, datorită specificităţii reacţiei Ag-
Ac;
• IEM în fază solidă: grila ME, (sau alt suport), va fi
“coafată” cu Ac monoclonali; particulele virale,
prezente în PP vor fi adsorbite la suprafaţa grilei prin
intermediul Ac-lor.
 Microscopia optică:
Evidentiaza modificări histopatolgice şi
evidenţierea de incluzii

• Incluziile cu diferite localizări:

• intranucleare şi/sau intracitoplasmatice,
• eozinofile sau bazofile,
• cu variate forme – rotunde, alungite, piriforme,
etc.
• reprezintă doar un reper orientativ şi nu unul
patognomonic.
Infectii cu VHS (incluzii IN)
Leziuni determinate de VHS. Sageata verde indica incluzii IN, cea albastra ,
celule keratinizate, iar cea rosie, celule binucleate, cu incluzii iN.
Sageata rosie - incluzii IN, albastra, degenerarea celulelor cu balonizare
(aspect generat de VHS, keratinocite, multinucleate).
VVZ – incluzii IN
V. rabic – incluzii IC (bazofile)
Coloratie HE
 Incluzii Babes-Negri
granule albastru-inchis la nivelul incluziilor
(coloratie Sellers)
VRS – sincitii si incluzii eozinofile i.c.
 Infectie HIV – celule nervoase
Incluzii Cowdry A, IN si IC – eozinofile
(coloratie HE)
 METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC

Detecţia şi identificarea antigenelor virale

 imunofluorescenţă
 imunohistochimie
 metode imunoenzimatice
 latex-aglutinare
 reacţii de neutralizare, fixare a complementului,
inhibare a hemaglutinării
 METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA

• Anticorpi marcaţi cu fluorocrom

• Detecţia şi identificarea antigenelor de la
nivelul celulelor infectate (produs patologic,
culturi de celule)
 METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOFLUORESCENŢA
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE

• Detecţia şi identificarea antigenelor virale de la

nivelul celulelor infectate (produs patologic, culturi
de celule)
• Anticorpi marcaţi cu peroxidază
• Examinare la microscopul optic
• Dezavantaj – peroxidaza endogenă, prezentă în
numeroase ţesuturi, poate genera reactii fals
pozitive
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE
METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - IMUNOHISTOCHIMIE
Rabie - imunohistochimie
Incluzii IN Cowdry A – se vad uneori; Imunohistochimie, utilizand
Ac monoclonali anti- VHS: semnal (+) IN si IC (stanga coloratie
Papanicolau si dreapta: IHC, dupa recolorare)
METODE INDIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC
• Evidenţierea anticorpilor specifici
 metode imunoenzimatice (ELISA)
 latexaglutinare (LA)
 reacţia de fixare a complementului (RFC) /
evidentiaza Ac specifici de grup (exceptii /
VSR, paragripal tip 3)
 reacţia de inhibare a hemaglutinării (RIH)
• Sensibilitate, specificitate, complexitate şi
costuri – funcţie de metoda utilizată
• Criterii de semnificaţie a prezenţei Ac
 Criterii de semnificaţie a
prezenţei Ac
• 2 probe de ser (ideal)
- dinamica semnificativă
- seroconversia
• 1 probă unică
- titrul semnificativ
- clasa de Ac (IgM versus IgG)
 METODE IMUNOENZIMATICE ÎN
DIAGNOSTICUL VIROLOGIC
• Aplicaţii extrem de variate
• Diverse variante (directe, indirecte, competitive,
sandwich)
• Detecţia şi identificarea antigenelor (virioni,
antigene virale solubile, celule infectate) si a
anticorpilor
• Sensibilitate foarte bună
• Specificitate – funcţie de afinitatea anticorpilor
• Accesibilitate
• Cost redus
Teste pe membrana
Teste pe membrana (HIV si VHC)
 Teste pe membrana
• Pentru laboratoare putin dotate
• NU NECESITA PERSONAL
SPECIALIZAT
• In zone unde prevalenta infectiei respective
este redusa
• SE CONFIRMA OBLIGATOR PRIN
ELISA
 ELISA- principiu
• Evidenţierea complexului Ag-Ac cu
ajutorul unui element cunoscut (Ac sau Ag)
marcat cu o enzimă
• Reacţia de culoare, prin adăugarea unui
substrat specific (pentru enzima utilizată)
Placa ELISA (12/8)
 ELISA - metoda
• Ag partial purificat, inactivat este adsorbit
pe suport

• Se adauga ser (poate contine Ac – se

cupleaza de Ag)
 ELISA - metoda
• Ac anti Ig umana, cuplati cu enzima
(conjugat)

• Cromogenul (substratul) va schimba

culoarea reactiei daca se formeaza
complexul Ag-Ac-Conjugat
ELISA – ser reactiv
ELISA – ser nereactiv
 ELISA

Negative
Positive Control Control Patient A Patient B Patient C Assay Control

1.689 0.153 O.055 0.412 1.999 0.123

ELISA
indirect
ELISA
indirect
ELISA
ELISA – direct (detectare de Ag)
28.04
ELISA
 ELISA – competitiv
• competiţia se realizează direct în prezenţa
de Ac dirijaţi împotriva Ag insolubilizat,
prin adsorbţia pe faza solidă.
• este posibil să adăugăm reactivii în etape: în
prima etapă, Ag-ul de dozat se adaugă peste
Ac insolubilizaţi pe faza solidă.
ELISA – competitiv
 ELISA
• Nu se lucreaza probe hemolizate, contaminate!
• Pastrarea serului cel mult 5 zile la frigider (ideal,
maxim 3 zile).
• Nu se ingheaţă proba repetat!

• Rezultate fals pozitive: impun repetarea probei pe

2 godeuri (mai ales in cazul probelor indeterminate;
AS = CO).
 Surse de eroare în dozarea
antigenelor:

rezultatele fals pozitive pot fi determinate de:

* fixarea nespecfică a imunoglobulinelor de către
receptori Fc membranari sau de către factorul reuma-
toid (FR) prezenţi în ser sau alte lichide biologice;
* reacţii heterospecifice determinate de utilizarea
anticorpilor anti-antigene heterologe, anti-gazdă sau
anti-membrane ale gazdei sau de prezenţa de antigene
în probă (bacterii, levuri, ciuperci, proteine);
 Surse de eroare în dozarea
antigenelor:
* proasta conservare a serurilor ce duce la
alterarea imunoglobulinelor în probă;
* folosirea unui conjugat la titru sau cu o
aviditate insuficientă.
 Surse de eroare în dozarea
antigenelor:
• Rezultate fals negative
• Aviditate scazută a Ac adsorbiţi pe suport
• Conjugat nelegat (incubare insuficienta,
spalare in exces, etc)
 ELISA
• Conduita: repetarea pe aceeasi proba sau/si
pe o noua proba de ser (recoltat imediat sau/si
la 2-3 luni interval).
• Se prefera repetarea pe truse de la producatori
diferiti.
• Atentie: pacienti cu boli autoimune, sub
tratament cu cortosterioizi, hemodializati, etc.
 ELISA
• Rezultate fals negative:
• ser recoltat anterior perioadei de
seroconversie
• Ac complexati/legaţi cu Ag
• sensibilitate redusa a trusei
• Ac antiHIV2 nu sunt recunoscuti de truse
pentru HIV1
• imunsupresie
Evoluţia răspunsului imun în infecţia cu
HIV
ELISA – schematic (indirect)
ELISA – Ag p 24 (HIV)
Sandwich ELISA (Ac-Ag-Ac)
 IgG-Capture EIA

Serum (1/100)

Goat-anti-Human-IgG
Capture Antibody Biotin-Labeled Ag

TMB Strepavidin-
Substrate Peroxidase
 ELISA
• Rezultate fals pozitive
• Confirmarea printr-un test principial
diferit (WB, IF).
HIV WB
 WB - principiu
• Ag virale fixate pe un suport (membrană),
reacţionează specific cu Ac din ser
• Marcaj imunoenzimatic
• Legarea reactivilor ca in ELISA de tip
indirect
 WB
• Avantaje:
• evidentiaza categorii de Ac
• este mai specifica
• permite aprecieri prognostice (ex.
aparitia/versus disparitia Anti- p24).
 WB
• Dezavantaje:
• timp mai mare de executie
• presupune dotari suplimentare
• personal super-calificat
• uneori presupune interpretari “subiective”
• cost ridicat
 LATEX AGLUTINAREA

• Anticorpi fixaţi pe particule de latex –

identifică antigene (reciproca este
valabilă, pentru evidenţierea de Ac)
• Metodă simplă, rapida şi accesibilă
• Sensibilitate şi specificitate relativ
reduse
• Ex: antigenul rotaviral in materii fecale
LA
 METODE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ
ÎN DIAGNOSTICUL VIROLOGIC

• Detecţia şi identificarea unor secvenţe specifice

de acizi nucleici
• Diverse variante
 Hibridizarea acizilor nucleici neamplificaţi
 Amplificarea semnalului (bDNA)
 Amplificarea secvenţei (PCR, RT-PCR, NASBA)
• Sensibilitate şi specificitate foarte bune
• Accesibilitate restrânsă
• Cost ridicat, dar cu raport cost/beneficii favorabil
PCR
PCR – evidenţierea fragmentului
amplificat
Detectarea calitativă a acizilor nucleici virali

• Cand metodele convenţionale sunt greu de utilizat:

• virusurile care se cultivă dificil (VHB, VHC,
papillomavirusul uman, HIV şi parvovirusul B19);
• datorită riscului crescut de infecţiozitate (HIV);
• când serologia nu este evidentă (ex. în cazul pacienţilor
imunocompromişi- virusul citomegalic);
• diagnosticul infecţiilor virale congenitale şi perinatale
(HIV, VHC);
• virusul este prezent în concentraţii foarte joase:
screening–ul sângelui şi al produselor sanguine (VHB,
VHC, HIV);
 Produse patologice
• testarea fluidelor organismelor care în mod
normal sunt sterile
- LCR (VHS, VVZ, VCM);
- lichidul amniotic (VVZ, VCM, parvovirusul
B19, virusul rubeolei);
- fluidele oculare (VVZ, VCM).
 PCR
- Au fost folosite variate metode pentru
aceste scopuri, inclusiv PCR şi hibridizarea,
cu scopul de a putea evidenţia concentraţii
scăzute de genom viral în probe.
 Secvenţierea acidului nucleic viral

• Odată ce genomul viral a fost detectat, secvenţierea genomului

poate evalua relaţiile dintre două sau mai multe izolate virale, în
cazurile în care este posibilă coinfecţia (VHB – VHC) sau poate
ghida terapia antivirală.

• În testarea rezistenţei la antitretrovirale a HIV se determină

secvenţierea RT şi a proteazelor şi se compară expresia
schimbărilor aminoacizilor cu tulpina iniţială de virus.

• Testarea sensibilităţii HIV la antiretrovirale are un potenţial

limitat datorită beneficiului clinic redus, costurilor ridicate,
dificultăţilor de interpretare.
 Secvenţierea acidului nucleic viral

• Aplicaţii:
• alegerea terapiei de primă intenţie, adaptarea terapiei,
• profilaxia post – expunere şi prevenţia transmiterii
verticale.
• Ex. terapia HIV şi VHC.
• răspunsul la IFN în infecţiile cu VHC depinde de
genotipul viral: genotipurile 2 şi 3 răspund mai bine decât
genotipul 1;
• câteva variante de VHB cu sensibilitate redusă la
Lamivudină sunt asociate cu prezenţa unui singur nucleotid
la nivelul genei care codifica sinteza polimerazei.
 Cuantificarea acidului nucleic viral

• Cuantificarea încărcăturii virale este

importantă în virusologia clinică datorită
utilităţii sale ca:
- indicator al prognosticului;
- al răspunsului la terapia antivirală;
- al riscului transmiterii infecţiei.
 Evaluarea prognosticului:
• A fost bine stabilit pentru HIV.
• S–a demonstrat că nivelul plasmatic al ARN–
ului viral corelat cu stagiul bolii şi cu un nivel
scăzut al HIV1 în plasmă se asociază cu o
lungă perioadă asimptomatică.
• Incărcătura virală crescută după seroconversie
poate preceda progresia spre SIDA.
 Evaluarea prognosticului:

• Măsurarea încărcăturii virale pentru VCM este

utilă în cazurile post – transplant, această metodă
dovedindu–se mult mai eficientă decât determi-
narea calitativă.
• Incărcătura virală pentru VCM este un factor
predictiv independent în supravieţuire, în cazul
SIDA avansat.
• Creşterea VEB în plasmă şi în limfocitele din
sângele periferic poate precede apariţia unor
tulburări limfoproliferative post – transplant.
 Evaluarea răspunsului terapeutic:

• este cel mai bine cunoscută în cazul infecţiei cu HIV, caz în

care scopul terapiei este de a reduce nivelul plasmatic al HIV1
cât mai mult posibil;
• există controverse în acest sens:
- s-a sugerat că pacienţii cu nivelul plasmatic al HIV1 între
30.000 şi 50.000 cópii / ml ar trebui să primească terapie
antiretrovirală indiferent de stadiul clinic,
- în timp ce pentru pacienţii care au concentraţii între 5000 –
30000 cópii / ml trebuie să se aibă în vedere şi stadiul clinic şi
numărul CD4 pentru iniţierea terapiei antiretrovirale.
 Evaluarea răspunsului terapeutic:

• Terapia antiretrovirală este eficientă dacă s -

a redus nivelul plasmatic al HIV1 cu cel
puţin 0,5 log10.
• Revenirea nivelului ARN – ului plasmatic
până la valori egale cu cele dinaintea
terapiei, ar trebui să trezească suspiciuni cu
privire la dezvoltarea rezistenţei.
 Evaluarea răspunsului terapeutic:

• În cazul HVB, în care un nivel crescut de ADN înainte de

iniţierea tratamentului este asociat cu un răspuns slab la IFN,
cuantificarea ADN/ VHB a fost utilizată pentru a preconiza
răspunsul terapeutic şi pentru a monitoriza răspunsul la terapia
antivirală.

• La fel şi în cazul infecţiilor cu VHC, nivelul ridicat al viremi-

ei, înaintea iniţierii terapiei antivirale este asociat cu un răs-
puns terapeutic redus (s-a demonstrat că acesta apare indiferent
de genotip).
• Este încă neclar care este raportul dintre genotipul VHC şi
nivelul viremiei.
 Evaluarea riscului transmiterii virale:

• cuantificarea genomului viral pentru a evalua riscul transmiterii

virale nu este frecvent utilizată în prezent, dar poate deveni mult
mai importantă în viitor;

• este general acceptat că riscul transmiterii virale este corelat cu

nivelurile crescute de virus în diverse fluide ale organis-mului;
• transmiterea VHC de la mamă la copil este mai frecventă atunci
când nivelul ARN / VHC al mamei în sânge este mai mare decât
108 cópii / ml (practic risc = 0 la 103 cópii / ml ).

• Transmiterea se face frecvent în timpul naşteriii; frecvenţa ratei

transmiterilor este mai mică în cazul naşterilor prin cezariană
decât în cazul naşterilor pe cale naturală.
 Evaluarea riscului transmiterii virale:

• În ceea ce priveşte transmiterea mama-fat în cazul

HIV1 s-a demonstrat, deşi inconstant, că nivelurile
ridicate ale ARN / HIV în plasma mamei cresc riscul
infecţiilor fetale.
• Scăderea riscului transmiterilor se poate face eficient
prin Zidovudină.
• Meta – analiză: a analizat 15 studii de cohortă
sugerând că naşterea prin cezariană reduce riscul
transmiterii HIV pe cale verticală, indiferent de
utilizarea Zidovudinei.
• Nivelurile crescute de HIV1 apar mai frecvent în
timpul relaţiilor heterosexuale.
 Metode cantitative

• Real Time pCR (LP cu demonstratii

practice)
 METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - CULTIVARE

• Metodă standard – permite

 stabilirea semnificaţiei izolatului
 testarea sensibilităţii la antivirale
 izolarea unor virusuri noi
• laborioasă, necesită infrastructură complexă
şi personal calificat
• accesibilitate redusă şi costuri mari
 METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - CULTIVARE

• Prelucrarea produsului patologic

• Medii de cultură celulare
 culturi de celule (primare, diploide, linii celulare)
 ouă embrionate
 animale de laborator
 METODE DIRECTE DE DIAGNOSTIC
VIROLOGIC - CULTIVARE

• Evidenţierea replicării virale

 efect citopatic
 incluzii
 hemadsorbţie
 hemaglutinare
 imunofluorescenţă, metode imunoenzimatice
 transformare malignă
 interferenţă
CULTIVAREA VIRUSURILOR –
EFECT CITOPATIC - sincitii
Virus urlian : CC- sincitii (se confunda cu cele
ale VRS – diferentiere prin testul de
hemadsobtie)
CULTIVAREA VIRUSURILOR – INCLUZII
VIRALE