TEHNICI DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

UTILIZATE ÎN STUDIUL CELULEI

TEHNICI GENOMICE

LP 8
Biologie Celulara si Moleculara
 Tehnici de biologie moleculară
•Metode de cercetare fundamentală în care
comportamentul celular este investigat în legătură
cu nivelul de expresie sau gradul de activitate al
unei anumite molecule (gena sau proteina)
•GENOMICA : totalitatea metodelor de studiu al
acizilor nucleici (ADN, ARN)
•PROTEOMICA: totalitatea metodelor de studiu al
proteinelor
 Tehnici de biologie moleculară
•Metode calitative: evidenţiază prezenţa
unei molecule într-o probă (ser, ţesut,
cultură celulară)
•Metode semi-cantitative: rezultatele
reprezinta valori relative raportate la un
control
•Metode cantitative: pot cuantifica nivelul
unei molecule într-un amestec/produs
biologic (ser); rezultatul este raportat in
μg/ml, ng/ml, etc
Tehnici de biologie moleculară
Tehnici de genomică Tehnici de proteomică

PCR şi qRT-PCR ELECTROFOREZE ŞI

TRANSFERURI PE
MEMBRANE
ELECTROFOREZĂ ÎN GEL IMUNOHISTOCHIMIE
DE AGAROZĂ
HIBRIDIZARE IN SITU ELISA
(PENTRU ACIZI NUCLEICI) SPECTROMETRIE DE MASA
SECVENŢIERE GENICĂ MULTIPLEXARE
GENE MICROARRAYS CRISTALOGRAFIE
 Tehnici de genomică
 PCR – folosită pentru obtinerea unui numar mare de copii a unei
anumite secvente de ADN

 qRT-PCR (PCR cantitativ) – cuantificarea expresiei diverselor

gene prin determinarea cantitatii de ARNm

 SECVENTIERE GENICA – permite descifrarea secvenţei de

nucleotide care intră în structura unei gene

 MICROARRAY – evaluarea simultana a expresiei mai multor gene

(ARNm) intr-o proba - permite screeningul pentru determinarea
polimorfismelor genice (SNP), evaluarea supra/subexpresiei unor
gene, studii de hibridizare genomica comparata etc.
 EXTRACTIE ADN - PRINCIPIU

1. Recoltarea probei biologice de interes (celule, tesut,

plasma, ser, etc)
2. Distrugerea membranelor celulare (liza celulară).
- Lipidele din membrana celulară și nucleul sunt
descompuse cu detergenți și surfactanți.
- Liza proteinelor se realizeaza prin adăugarea unei
proteaze
- Liza ARN se realizeaza prin adăugarea unei RNase
3. Soluția este tratată cu sare concentrată pentru a face
ca fragmentele de proteine, lipidele și ARN să precipite.
 EXTRACTIE ADN - PRINCIPIU

4. Centrifugarea soluției pentru a separa resturile

celulare de ADN.
5. Purificarea ADN de detergenți, proteine, săruri și
reactivi utilizați în timpul etapei de lizare a celulei cu
etanol răcit cu gheață sau izopropanol. Deoarece ADN-
ul este insolubil în acești alcooli, acesta se va agrega
împreună, dând o peletă la centrifugare.
6. După izolare, ADN-ul este dizolvat în tampon ușor
alcalin, de obicei în tampon TE (Tris-EDTA) sau în apă
ultra-pură.
 Tehnica PCR = polymerase chain reaction
 Reactie de copiere si amplificare a informatiei ADN →
AMPLICON
 Acest lucru se poate face numai dacă sunt cunoscute
părți din secvența de interes.
 Necesita: proba ADN, primeri (secvente de
oligonucleotide, 20-25 baze, complementare celor
doua capete de interes ale lantului de ADN), ADN-
polimeraza, nucleotide, solutie tampon (TRIS, HCl,
KCl), ioni divalenti (MgCl2) 8
 Tehnica PCR = polymerase chain reaction

 Etape PCR (cicluri termice):

1. Denaturarea ADN / separarea catenelor
complementare (~950C)
2. Alinierea primerilor (50-600C) – legarea primerilor la
secventele omologe
3. Elongarea – sinteza de noi secvente de ADN sub
actiunea Taq-polimerazei (~720C)
9
Ciclurile PCR – 3 pasi repetati de mai multe ori pentru a asigura o cantitate mare de ADN
 Electroforeza acizilor nucleici
• Tehnica analitica folosita pentru separarea fragmentelor de
ADN/ARN pe baza dimensiunii acestora

• Acizii nucleici sunt incarcati intr-un gel in care se aplica un

camp electric si vor migra spre anod datorita sarcinii
negative a catenei glucid-fosfat

• Se folosesc geluri de agaroză sau poliacrilamidă la

concentraţii mici (până în 5%), care asigură spaţii largi de
migrare

• Metodă de validare pentru PCR si de verificare a integritatii

ADN/ARN
Electroforeză de acizi nucleici
 Identificarea unor mutatii prin tehnica PCR
 Ampliconii obtinuti dupa reactia de PCR sunt migrati in gel
de agaroza 2%/bromura de etidiu, sub actiunea unui voltaj
(120V/30 min)
Exemplu
 Identificarea mutatiei
V617F in gena JAK2
(fosfokinaza) la pacientii
cu neoplasme
mieloproliferative
 Aprox. 95% din pacientii
cu Policitemie Vera
prezinta aceasta
mutatie
Tehnica qRT-PCR – PCR cantitativ (Real – Time PCR)
Metodă foarte sensibilă de detectare şi cuantificare a ARNm -
metodă cantitativă de evaluare a transcripţiei genice
Permite monitorizarea amplificarii ADN in timp real
Etape:
1. Sinteza ADN complementar (ADNc) din ARN mesager (folosind o
revers transcriptaza)
2. Etapele de PCR (oligonucleotide marcate fluorescent)
ADNc este amplificat şi, pe măsura formării ADNului dublu-catenar,
marcat fluorescent, semnalul fluorescent devine vizibil

14
 Tehnica MICROARRAY

• Tehnologie multiplex de analiză a transcriptelor

genice (ARNm) într-o cultură celulară (lizat celular)
sau proba biologica

• Permite determinarea simultană a prezenţei a mii de

gene transcrise/ARNm într-o probă
 Tehnica MICROARRAY
 Principiu: hibridizare specifică între un oligonucleotid
(un fragment de ADN monocatenar) şi fragmentul
complementar de ADN (ADNc) = gena de interes
 Fragmente de ADN/ARN sunt atasate pe un substrat si
sunt hibridizate cu sonde marcate (fragmente de
gene sau gene integrale)
 Complexele Sonda-Tinta sunt vizualizate si
cuantificate pe baza detectiei in fluorescenta a unui
fluorofor – marker fluorescent atasat tintei in vederea
cuantificarii relative a abundentei acizilor nucleici
existenti in proba tinta
 Tehnica MICROARRAY

Utilizări:

•Detectarea unor modificări în expresia genică

•Detectarea duplicaţiilor/deleţiilor genice

•Detectarea mutaţiilor – necesită plăci speciale,

pe care oligonucleotidele matrice sunt de fapt
variaţii cu diferite mutaţii ale aceleaşi gene
Tehnica MICROARRAY - APLICATII
Profilul genic pentru 20 de specimene: 10 probe tesut tumoral gastric
și 10 probe țesut normal adiacent tumorii (prin gene microarray)
SLC29A2
KIAA1688
SS18L1
ATP11A
ONECUT2
ETV4
C5orf16
F2R
EFNA4
S100A10
SALL4
LOC649828
TRAIP
SNX8
C1orf135
UPP1
KIAA1199
F12
NEK2
ANXA2
PRR16
TNFRSF11B
TNFRSF10B
TTYH3
RQCD1
SDS
CD3EAP
C1orf75
TRPM2
IL11
AI620901
LRFN4
MDFI
A_24_P273014
TREM2
MFAP2
TMEPAI
A_24_P375962
OXTR
FKBP10
SPHK1
TEAD4
TNFRSF12A
A_23_P123234
LZTS1
THY1
COL1A1
HOXC9
INHBA
AK001903
ARSI
PGM2L1
AK130099
ZNF469
CTHRC1
BMP1
COL10A1
MAL
C6orf204
ADRB2
MGC45438
GNG7
C9orf94
ERO1LB
BHMT
PNPLA7
PAIP2B
CYFIP2
SLC25A42
PDGFD 2
SEMA3D
GPX3
FIGF
CPAMD8
GFRA3
PTPRZ1
APOBEC2
EPHB6
AK094603
CADM3
FLJ22655
THC2522889
PLP1
SLC6A16
1.5

1 Crescut
0.5
MYOC
PHYHD1
H15635
CD36
C21orf51 0
A_24_P938006
ENST00000325900
AK123264
A_32_P3914
PLCXD3 -0.5
LIFR
ADHFE1
SCUBE2
AK093202
PRKACB -1
GPR30

Scăzut
CKMT2
FLJ41603
CKB
-1.5
HADH
ASTN2
SORBS2
KLF15
RGN -2
ELL2
WNT6
N001 N006 N002 N004 N010 N003 N005 N007 N009 T001 T004 T003 T002 T007 T006 T008 T005 T009 T010

Normal Tumoral
Confirmarea datelor de gene microarray
prin qRT-PCR
 Secvenţierea genică – Metoda Sanger – metoda
dye-terminator
permite descifrarea secvenţei de nucleotide care intră în
structura unei gene

Necesita: un lant simplu de ADN (single-stranded), un primer

(secventa de ADN care serveste ca punct de plecare a
polimerizarii), ADN-polimeraza si nucleotide marcate
fluorescent

Fragmentele sintetizate sunt denaturate termic si separate

prin electroforeza capilara
 Secvenţierea genică – Metoda Sanger –
metoda dye-terminator

•Principiu: blocarea sintezei catenei

complementare de ADN prin legarea unei
nucleotide modificate, în locul nucleotidei
normale şi generarea de fragmente intermediare

•Rezultă astfel fragmente intermediare care vor fi

puse cap la cap ca bucăţile unui puzzle
Secventierea ADN - Metoda Sanger
– metoda dye-terminator
Aplicatii/Exemplu:
Identificarea deletiei de 52 de baze in gena Calreticulinei la
pacienti cu neoplasme mieloproliferative
Hibridizarea in situ

•Principiu: utilizarea unei secvenţe

complementare de ADN/ARN, marcate
fluorescent, care să evidenţieze prezenţa in
situ a secvenţei căutate

•Deoarece foloseşte un preparat fluorescent,

metoda e cunoscută sub denumirea de FISH
(fluorescent in situ hybridization)
ADN - FISH

(Bilello et al. Journal of Virology, April 2006, p. 3644-3649, Vol. 80, No. 7)