LOS MONOCITOS / MACRÓFAGOS QUE

EXPRESAN TIE2 REGULAN LA

REVASCULARIZACIÓN DE LA
EXTREMIDAD ISQUÉMICA

(TIE2 monocitos en la isquemia de extremidad)

ABSTRACT
CLI Critical Limb Ischemia (Isquemia critica de extremidades).

Objetivo de estudio del art. Examinar la cinética de TEMs en pacientes con CLI y si estas
células promueven la neovascularizacion de la extremidad isquémica.

1/3 con CLI necesitan amputación de miembro.

Monocitos/Macrofagos que expresan TIE2 (TEMs) son un subconjunto de células mieloides

que tienen una alta acción angiogenica en tumores.

Hay 10 veces mas TEM circulantes en pacientes con CLI. La eliminación de la isquemia
reduce su numero a niveles normales.

El numero de TEM en el musculo isquémico es doblemente mayor que en el musculo

normoxic (no isquémico, normal en O2) del mismo paciente.

TEMs de pacientes con CLI muestran mayor actividad proangiogénica que los monocitos
negativos a TIE2 in vitro.
MODELO DE RATON
Se utilizo modelo de ratón con isquemia de miembro posterior, basados en lentivirus Tie2
knockdown en TEMs, mostrando deterioro de la recuperación de la isquemia, mientras que
la entrega de macrófagos de ratón sobreexponiendo TIE2 o TEMs humanos aislados de
pacientes con CLI, rescataron miembros con isquemia.

Estos datos sugieren que el aumento del reclutamiento de TEM en el musculo isquémico
pueden y tienen el potencial de mejorar la neovascularización de miembros en pacientes
con CLI.
MARCO TEORICO

Bloqueo de genes:

Inactivación génica o desactivación génica (en inglés, gene knockout) es una técnica
genética que suprime la expresión de un gen específico en un organismo, sustituyendo el
gen original en su locus por una versión modificada del mismo, a la que se ha extraído uno
o varios exones para generar una versión que codificaba el gen original. Se obtienen
organismos que no expresan el gen diana en un tejido específico o en el organismo
completo (organismos knockout, ej: ratones knockout).
Knockdown: (expresión reducida de genes)

Se pueden introducir en el genoma de un organismo secuencias de ADN que expresen

moléculas de ARN interferente. Estas moléculas interfieren de forma específica con la
expresión del gen diana, produciendo generalmente una disminución de la expresión (que
se denomina "knockdown" por este motivo). Esta técnica es más rápida que la obtención
de un organismo "knockout", pero no produce una eliminación completa de la expresión y
además la secuencia introducida que codifica para el ARN interferente puede también
sufrir mutaciones, inactivando el efecto deseado.

Knockdown permanente = knockout

Metodología de la técnica de inactivación génica:

El gen modificado (que carece la mayor parte de la secuencia del gen original) se introduce
en un plásmido o un virus, para generar un vector direccionador (targeting vector).

Vector viral

Virus modificado que hace de vehículo para introducir material genético exógeno en el
núcleo de una célula. En terapia génica, el uso de virus como vectores requiere la
eliminación de los genes que dotan al virus de su capacidad infecciosa y patógena, dejando
únicamente aquellos que participan en la inserción del material genético, y su sustitución
por el gen terapéutico de interés.
Vectores lentivirales:

Lentivirus es un género en la familia de Retroviridae que es muy conveniente para utilizarlo

como vector de la transferencia del gen debido a su expresión estable del transgén, la
capacidad de alcanzar los núcleos de las células de no-división importantes y de su perfil
inmunogenético substancialmente inferior.

Fuentes
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3206600/
http://www.bloodjournal.org/content/95/8/2499?sso-checked=true
http://www.nature.com/mt/journal/v18/n3/full/mt2009319a.html
http://www.hindawi.com/journals/scientifica/2012/694137/
Tolmachov OE, Tolmachova T, Al-Allaf FA. Diseño de Vectores del Gen de Lentiviral. En: Xu K
(Ed). Terapia Génica Viral. InTech, 2011; págs. 263-284.
Desport M. Lentiviruses y Macrófagos. Prensa Científica del Horizonte, 2010; págs. 1-24.
RATÓN TRANSGÉNICO. (Es diferente a ratones knockout).

Son ratones modificados genéticamente portadores de un transgén (material genético

externo) integrado al azar en su genoma.

Son generalmente modelos de ganancia de función: conducen a la expresión de un nuevo

gen o a la sobre-expresión de un gen ya existente.

Diferencia: En este tipo de modelos se puede controlar con total precisión la estructura del
"transgén" pero no la posición del genoma en éste que se integra.

En el bloqueo de genes la integración del ADN que se introduce en el genoma se dirige a

una posición concreta del mismo, con el objetivo de generar una mutación intencionada y
previamente diseñada en dicha posición

Además de diferentes técnicas.

¿ALOGÉNICO Y XENOGÉNICO?

Son términos muy usados en cuestión de trasplantes.

Alogénico: Individuos, tejidos, células, etc, de la misma especie pero con diferencias
antigénicas. (Alotrasplante).

Xenogénico: (del griego ξένος -xenos: extranjero).

Individuos o tipos de células procedentes de diferentes especies y diferentes genotipos.
Donante xenogénico: Trasplante efectuado con órganos o tejidos procedentes de un
donante de una especie diferente a la del receptor. Ej. conejo a rata, cerdo al hombre.
(Xenotransplante).

Sinegico: Donador y receptor son gemelos identicos.

Autologo - Autogenico: Yo con yo.
Las principales limitaciones trasplantes xenogenicos son la barrera inmunitaria, la
posibilidad de que determinados tipos de enfermedades que afectan a otras
especies se transmitan a humanos (xenozoonosis).

Xenotransplante ej. Remplazo de válvulas del corazón humano con tejido de cerdo
(transgénicos).
RESPUESTA XENOGENOGENICA

XENOANTICUERPO (anticuerpo xenogénico)

Subgrupo de anticuerpos naturales que reaccionan, además de con agentes infecciosos,
con antígenos expresados en células y tejidos de otras especies.

Tras exposición a un xenoinjerto el titulo de xenoanticuerpos aumenta rápidamente.

Ej. Xenotrasplante de órganos o tejidos de hámster a rata, este alcanza en 2-3 días un titulo
que es capaz de causar el rechazo del xenoinjerto.

Esta dinámica de producción de xenoanticuepos explica los requerimientos de

inmunosupresión para prevenir el rechazo de lo xenogenico. Estos inmunosupresores
deben actuar exclusivamente sobre los linfocitos T para evitar el rechazo xenogenico.

La unión de xenoanticuerpo con el xenoantegino activa complemento = destrucción.

“Desarrollan ratones con modificaciones genéticas que los hacen tolerantes a ciertos
xenoantigenos, como también ratones que mimifican el sistema inmune humano –
ratones humanizados” Investigadores del Hospital General de Massachusetts, del
Instituto Tecnológico de Massachusetts y de la Universidad de Harvard.

FUENTES:

• “Estudios de inmunomodulación xenogénica y sus posibles aplicaciones biomédicas”

Tesis adscrita a la facultad de medicina, universidad de Barcelona. 2012.

• “Del alotransplante al xenotransplante: la compatibilidad antigénica donante-receptor por medio del

Complejo Mayor de Histocompatibilidad CMH”
Artículo de revisión, Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca. 2006.
Receptor de angiopoyetina: TIE-1 y TIE-2

TIE-1 y TIE-2 comprenden los receptores de la superficie celular que se unen y son
activados por las angiopoyetinas , (Ang1, Ang2, Ang3, Ang4). Las angiopoyetinas son
factores de crecimiento proteico necesarios para la formación de vasos sanguíneos (
angiogénesis ).

La angiogénesis es la formación de nuevos capilares a partir de vasos preexistentes,

mientras que la vasculogénesis es la formación capilar de novo
Angiopoyetinas

Son factores de crecimiento proteico que promueven la angiogénesis , la formación de

vasos sanguíneos.

Ang1, agonista o activador - Tie2

Ang2, antagonistas competitivos
Ang3, antagonistas competitivos
Ang4, agonista o activador - Tie2

Funcionan uniendo sus receptores fisiológicos, Tie-1 y Tie-2. Se trata de tirosina quinasas
receptoras, denominadas así porque median las señales celulares induciendo la
fosforilación de tirosinas clave, iniciando así la señalización celular .
TEK Gene (TEK es sinónimo de Tie-2)

Este gen codifica un receptor que pertenece a la familia de la proteína tirosina quinasa
Tie2.
 Requerido para la angiogénesis normal y el desarrollo del corazón durante la
embriogénesis. Requerido para la hematopoyesis post-natal.

Las enfermedades asociadas con TEK incluyen malformaciones venosas, múltiples

cutáneas y mucosas y glaucoma 3, congénito primario, E.
Desarrollos vasculares secuenciales están estrechamente regulados por una serie de
factores pro y anti-angiogénicos, incluyendo VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial
Vascular), bFGF (Factor de Crecimiento Fibroblástico básico), factor de crecimiento
epidérmico (EGF) trombospondina, angiopoyetinas y más recientemente Angptl
(Angiopoietin-like proteins)
MULTIMEDIA
CLASIFICACIÓN DE RUTHERFORD

Clasifica en 4 grados y 7 categorías la severidad de la enfermedad vascular periférica.

Grado 0, Categoría 0: Asintomático

Grado I, Categoría 1: Claudicación leve
Grado I, Categoría 2: Claudicación moderada
Grado I, Categoría 3: Claudicación severa
Grado II, Categoría 4: Dolor en reposo
Grado III, Categoría 5: Pérdida de tejido menor; Ulceración isquémica que no supera la
ulceración digital de los pies.
Grado IV, Categoría 6: Pérdida de tejido importante; Úlceras isquémicas severas o
gangrena franca.
PATRONES MOLECULARES ASOCIADOS CON DAÑO (DAMP)

DAMP, damage associated molecular patterns.

El sistema inmunitario innato también reconoce moléculas endógenas que producen o

liberan células dañadas o que se están muriendo. También pueden ser secretadas por las
células centinelas activadas.

Los DAMP pueden producirse como resultado del daño celular causado por infecciones,
pero también pueden indicar una lesión estéril de las células causada por alguna otra
razón, como toxinas químicas, quemaduras, traumatismos o reducción del riego
sanguíneo (alarminas). Los receptores están principalmente APCs (monocitos, macrófagos
y DC).

Juegan papel importante en la inmunidad innata y en la reparación de tejidos.

Alarminas (señales de alarma). Subgrupo de origen endógeno.

Para que sean alarminas

• Son liberadas rápidamente después de la muerte por apoptosis inmunogénica/necrosis,

pero no por apoptosis fisiológica. O cuando la célula esta muriendo.

• Reclutan células presentadoras de antígeno profesionales (APCs) e inducen en ellas su

maduración al estimular la expresión de moléculas de coestimulación.

• Son secretadas por células del sistema inmunológico como macrófagos y células
dendríticas, sin que esto implique su muerte

• Participan en el establecimiento de la homeostasis promoviendo la reparación del

tejido destruido por los efectos de la inflamación.
 Actúan como alarminas

Defensinas
Catelicidinas,
Anexinas,
Fibronectina
Neurotoxina derivada del eosinófilo
HMGB1 (high mobility group box 1)
IL-1,
Proteínas S100 (familia de proteínas de unión al calcio involucradas en el crecimiento
celular y en el daño tisular)
Proteínas del choque térmico sintetizadas por células estresadas ej Hsp60

Entre otras.

En el articulo las primeras alarminas pudieron ser Hsp60, HMGB1, IL-1

“Son alarminas presentes en áreas de desarrollo de arterias colaterales”

“Los monocitos a través de sus receptores TLR respondes a estos ligandos”
 Tales DAMP pueden activar una respuesta inmune o funcionar como una señal de
seguridad para restringir las respuestas inmunitarias potencialmente dañinas y promover
la integridad del tejido durante la isquemia (ejemplos de este último tipo de DAMP
catabólico son adenosina y el péptido derivado de fibrinógeno)

Ej. Una alarmina es el heparán sulfato generado por células rotas. Esta molécula está
normalmente restringida a la membrana celular y a la matriz extracelular, pero es
secretada a los fluidos tisulares tras una lesión. Se une a TLR4 en macrófagos activándolos.

Ej. El fibrinógeno, una proteína coagulante, también estimula a los macrófagos a través de
TLR4.
FACTOR INDUCIBLE POR LA HIPOXIA-1 (HIF-1)

La respuesta celular a la hipoxia que se presenta en muchas situaciones (procesos

tumorales, inflamación, isquemias, etc) es regulada por un “gen maestro” el cual codifica
para el factor de transcripción denominado HIF (hypoxia inducible factor).

Este factor de transcripción en condiciones de normoxia es hidroxilado (por una familia de

enzimas llamadas prolil hidroxilasas) y degradado por vía proteosoma, por tanto sus
niveles de expresión son inexistentes.

Condiciones de hipoxia, las prolil hidroxilasas no son funcionales (por ello han sido
consideradas los sensores celulares de oxígeno) y por tanto no son capaces de hidroxilar a
HIF, el cual escapa a la vía de degradación y se acumula, induciendo un programa génico
de angiogénesis, cambios metabólicos, etc.

La hipoxia en los macrófagos aumenta la producción de citoquinas, la secreción de

metaloproteinasas y reduce la migración in vitro, lo que posiblemente genere su
acumulación en la región inflamatoria.
FISIOPATOLOGIA DEL DOLOR EN CLI

El mecanismo de producción del dolor en la isquemia crónica es por la inadecuada

perfusión (isquemia produce hipoxia), cambios secundarios debido a úlceras y gangrenas,
espasmos arteriales, por la afectación del retorno venoso, acidosis, acumulación de
metabolitos. En la claudicación intermitente el dolor aparece con el ejercicio, depende del
nivel de la oclusión.
RECEPTORES DE DOLOR

Mecanosensibles

Termosensibles

Quimiosensibles : Bradicinina, serotonina, histamina, iones potasio, productos metabólicos

finales ácidos, prostaglandina, acetilcolina y enzimas proteolíticas (estas pueden dañar las
terminaciones nerviosas).

Se ha sugerido que una de las causas del dolor en la isquemia es la acumulación de

grandes cantidades de ácido láctico en los tejidos, que se forman como consecuencia del
metabolismo anaerobio (metabolismo sin oxígeno) que ocurre durante la isquemia. Sin
embargo, también es posible que se formen otros agentes químicos en los tejidos por
daño celular (por la respuesta inflamatoria), como bradicinina, enzimas proteoliticas, etc.
Bradicinina: estimula los nociceptores por un mecanismo calcio dependiente, en el que se
activa la fosfolipasa A2 y se sintetizan prostaglandinas.
SISTEMA DE LAS KININAS

En condiciones normales se encuentran en el plasma kininógenos, moléculas que en

casos de inflamación, son activados por la kalicreína, que a su vez es activada por
productos derivados de daño tisular, como colágeno, cartílago, componentes de las
membranas basales, endotoxinas y factor Hageman o XII del sistema de la coagulación,
activación que da origen a bradikinina y kalicreína, sustancias de gran actividad
biológica que aumentan la permeabilidad vascular, inducen vasodilatación, producen
dolor y en algunas circunstancias, activan el sistema del complemento