Leucemiile acute

Etapele de diagnostic si
tratament
- Curs studenti -

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Definitie leucemii acute
• Leucemiile acute sunt un grup heterogen de boli
• Etiopatogenie - proliferarea clonala a celulelor
hematopoietice stem blocate in maturatie la
diferite nivele
• Mecanism – mutatie a ADN la nivelul unei
singure celule stem pluripotente:
• Translocatii
• Deletii
• Inversiuni

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Baza genetica a leucemogenezei

• La majoritatea leucemiilor acute la copil si

• la 54-78% dintre leucemiile acute ale
adultului

• sunt detectate modificari citogenetice la

analiza cariotipului din sangele periferic si
maduva osoasa

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Etiopatogenie LAM
Defecte congenitale
• Down syndrome
• Bloom syndrome
• Monosomy 7 syndrome
• Klinefelter syndrome
• Turner syndrome
• Neurofibromatosis
• Congenital dysmorphic
syndromes
Sindroame de insuficienta
medulara
• Fanconi anemia
• Dyskeratosis congenita
• Schwachman-Diamond syndrome
• Amegakaryocytic thrombocytopenia
• Blackfan-Diamond syndrome
• Kostmann agranulocytosis
• Familial aplastic anemia
• Familial platelet disorder

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Etiopatogenie LAM
- factori de mediu -
• Solventi organici • Chimioterapie
(benzen) – Agenti alchilanti
• Radiatii ionizante – Topoisomerase II
– Fumat • Alte medicamente
– Expunere la explozii – Chloramphenicol
nucleare – Phenylbutazone
– Iradiere medicala
• Radiatii neionizante (?)

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Aparitia leucemiei dupa expunerea
la agentul leukemogen

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
• Leucemia acuta limfoblastica – incidenta
bimodala (copil si varstnic)

• Leucemia acuta nonlimfoblastica

(mieloblastica) – incidenta unimodala
(adult)

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Leukemia model
B o n e m a rro w pluripotent Stem Cell
CD34, CDw90, Thym us
C F U -G M
CD13, CD34, CD33, CD38, CD117

Morphology
CFU-G
Lymphoblast CD13
CD33
Plasmocyte
CD34, TdT

CDw65
CD117
cMPO prä-prä-B-Zelle subkortikaler Thymozyt
CD19 cCD3
CFU-M
Myeloblast cCD22 CD5
CD13
CD13 CD34 CD7
CD33
Immunology
CDw65
CD117
CD33
CDw65
CFU-Meg
CD34
CFU-E
CD34
cCD79a
TdT
CD34
TdT
CD117 CD33 CD33
Pro-B cell
Monoblast
cMPO
Megakoryblast Erythroblast
Plasmocyte
prä-B-Zelle
CD19
cortiklaer Thymozyt
CD1
Myelozyt CD34 CD22 +/-CD2
CD13 CD34
CD15
CD33
CD13
CD33
CD61 CD36
?
Y Y CD24
cCD79a
cCD3
CD5
CDw65 CD15 Y cm CD7
CDw65
cMPO
Megakoryzyt
CD41
Retikulozyt
CD36 unreife B-Zelle
CD10
Y medullärer Thymozyt
CD2
unreifer Monozyt CD42 Glyko A
CD13 Metamyelozyt CD61 CD19 CD3
CD33 CD13 CD20 CD5
CD64 CD33 CD22 CD7
Maturation blocking
CDw65 CD15
CD65s
cyMPO
Thrombozyt
CD41 Erythrozyt
NK-Zelle
+/-CD2 Leukemia CD24
CD79a
IgM
+/-CD4
+/-CD8

Proliferation
Monozyt
CD13
CD15 Granulozyt
CD42
CD61
Glyko A CD7
CD8
B-Lymphozyt
T-Lymphozyt
CD2
CD16 CD3
CD64 CD15 CD19
CD56 CD5
CDw65 CD16 CD20
+/-CD57 CD7
CD65s CD22
cyMPO CD24 +/-CD4
CD79a +/-CD8

Blood IgM/IgD

Clinica de Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta
Incidenta leucemiilor acute in
functie de varsta

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Model pentru
leucemie
Morfologie
Limfoblast Plasmocit

Imunologie
Celula Pro-B Plasmocit
Y Y
Y
Y

Maturatia se blocheza Leucemie

Proliferare

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Genele de fuziune in leucemiile
acute

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clasificarea leucemiilor acute
• Capacitatea restanta de diferentiere a stat la baza
clasificarii fenotipice
• Leucemiile acute se impart in 2 mari clase:
– Mieloide (nonlimfoide)
– Limfoide
• Acestea difera prin:
– Prezentare clinica
– Raspuns la tearpie si evolutie
• Diferentierea in cele 2 clase – fundamentala
• Subclasificarea acestora a devenit esentiala –
tratamentul a evoluat pe fiecare grup specific genetic si
patogenic.

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Diagnosticul leucemiilor acute
• Diagnosticul initial al leucemiei acute este crucial,
necesita o serie de tehnici de laborator variate si
sofisticate, unele disponibile doar in centrele
specializate

• Necesita cooperarea dintre hematolog si morfopatolog,

citometrist si genetician

• Consta in urmatoarele etape:

1. Dg. Clinic
2. Dg. Morfocitochimic
3. Dg. Imunofenotipic
4. Dg. Citogenetic si molecular

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Diagnostic clinic
• Triada clinica:

1. Sindrom anemic: paloare, astenie, fatigabilitate

2. Sindrom infectios: febra, infectie documentata
3. Sindrom hemoragipar / trombocitopenie – purpura trombocitopenica,
echimoze

• Alte simptome/semne
– Scadere ponderala
– Transpiratii
– Hepatosplenomegalie usoara
– Limfadenopatii – sugereaza LAL
– Hipertrofie gingivala – sugereaza leucemia mielomonocitara/monocitara
– Masa tumorala mediastinala prin expansiunea timusului – sugereaza LAL cu
celula T
– Sindrom hemoragipar cu CID – sugereaza LAP
• Varsta – copii – predomina LAL, la adult, LAM
• Mase tumorale cu celule leucemice (sarcom mieloid, clorom, sarcom
granulocitic) afecteaza frecvent regiunile faciale si intracraniene, mai
frecvente in LAM – in 2-14%
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
LEUCEMIA ACUTA MIELOBLASTICA

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
LEUCEMIA ACUTA MIELOBLASTICA

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Elemente de laborator in
leucemiile acute
• Hiatus leucemic: lipsa maturatiei sau nivelului
imatur de maturatie – pe frotiul de sange
periferic se gasesc doar celule blastice si celule
mature
• Cresterea LDH – in special in LAM 4,5
• Modificari ale timpilor de coagulare, asociata cu
trombocitopenie si schizocite in CID
• Hipopotasemie, cresterea lizozimului seric (in
LAM 4,5)
• Leucopenie sau Leucostaza – in formele
hiperleucocitare > 100.000/mmc – cu dispnee,
detresa respiratorie
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Sistemul Hematopoietic
B o n e m a rro w pluripotent Stem Cell
CD34, CDw90, Thym us
C F U -G M
CD13, CD34, CD33, CD38, CD117

CFU-G
CD13 CD34, TdT
CD33
CDw65
CD117
cMPO prä-prä-B-Zelle subkortikaler Thymozyt
CD19 cCD3
CFU-M
Myeloblast cCD22 CD5
CD13
CD13 CD34 CD7
CD33
CD33 CFU-Meg cCD79a CD34
CDw65 CFU-E
CDw65 CD34 TdT TdT
CD117 CD34
CD117 CD33 CD33
cMPO prä-B-Zelle cortiklaer Thymozyt
Megakoryblast CD19 CD1
Monoblast Erythroblast
Myelozyt CD34 CD22 +/-CD2
CD13 CD34
CD15 CD13 CD61 CD24 cCD3
CD36
CD33 CD33 ? cCD79a CD5
CDw65 CD15 cm CD7
CDw65 Megakoryzyt Retikulozyt
cMPO CD41 unreife B-Zelle medullärer Thymozyt
CD36
unreifer Monozyt CD42 CD10 CD2
Glyko A
CD13 Metamyelozyt CD61 CD19 CD3
CD33 CD13 CD20 CD5
CD64 CD33 CD22 CD7
CDw65 CD15 Thrombozyt CD24 +/-CD4
NK-Zelle CD79a +/-CD8
CD65s CD41 Erythrozyt +/-CD2
Monozyt cyMPO CD42 IgM
Glyko A CD7
CD13 CD61 T-Lymphozyt
CD8 CD2
CD15 Granulozyt B-Lymphozyt
CD16 CD3
CD64 CD15 CD19
CD56 CD5
CDw65 CD16 CD20
+/-CD57 CD7
CD65s CD22
cyMPO CD24 +/-CD4
CD79a +/-CD8

Blood IgM/IgD

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Clasificarea fenotipica French
American British (1976)
- morfocitochimica -
Leucemia acuta limfoblastica (LAL)
1. LAL 1
2. LAL 2
3. LAL 3
Leucemia acuta nonlimfoblastica (LANL)
1. Leucemia acuta mieloblastica fara maturatie (LAM-M1)
2. Leucemia acuta mieloblastica cu maturatie (LAM-M2)
3. Leucemia acuta promielocitara (LAP, LAM-M3)
4. Leucemia acuta mielomonocitara (LAMMo, LAM-M4)
5. Leucemia acuta monocitara (LAMo, LAM-M5)
6. Eritroleucemia acuta (ELA, LAM-M6)
7. Leucemia acuta megacariocitara (LAMeg, LAM-M7)
Leucemia acuta nediferentiata (neclasificabila)

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clasificarea imunologica a
leucemiilor acute
- imunofenotipica -

• EGIL-Group (Leukemia 1995, 9: 1783-86)

– leucemia acuta limfoblastica (ALL)

– leucemia acuta mieloida (AML)

– leucemia acuta bifenotipica (BAL)

– leucemia acuta nediferentiata (AUL)

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Leucemia acuta limfoblastica (LAL)
1. LAL cu celula pro-B („early pre-B”)
2. LAL cu celula pre-B
3. LAL cu celula B
4. LAL cu celula T
Leucemia acuta nonlimfoblastica (LANL)
1. Leucemia acuta mieloblastica minim diferentiata
(LAM-M0)
2. Leucemia acuta mieloblastica fara maturatie (LAM-
M1)
3. Leucemia acuta mieloblastica cu maturatie (LAM-M2)
4. Leucemia acuta promielocitara (LAP, LAM-M3)
5. Leucemia acuta mielomonocitara (LAMMo, LAM-M4)
6. Leucemia acuta monocitara (LAMo, LAM-M5)
7. Eritroleucemia acuta (ELA, LAM-M6)
8. Leucemia acuta megacariocitara (LAMeg, LAM-M7)
Leucemia acuta bifenotipica / bilineala
Leucemia acuta nediferentiata (neclasificabila)
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clasificarea actuala a
leucemiilor acute OMS 2008-16
• Leucemiile acute limfoide
– leukemia/lymphoma limfoblastica cu precursori B
– leukemia/lymphoma limfoblastica cu precursori T
– lymphoma/leukemia Burkitt
• Sindrom mielodisplazic (SMD)
– SMD Low-grade
– SMD High-grade
• Leucemii acute mieloide (LAM)
– LAM de novo
– LAM post mielodisplazie (SMD)
– Leucemie acuta de linie ambigua
• LA bifenotipica (cel putin 2 linii celulare)
• LA nediferentiata
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clasificarea OMS
leucemii acute
Leucemii acute mieloblastice (LAM)*
I. Leucemii acute mieloblastice cu
translocatii citogenetice
– LAM cu t(8;21)(q22;q22),AML1(CBFa)/ETO
– Leucemia acuta promielocitara (LAM cu
t(15;17)(q22;q11-12)
Si variante, PML/RARa)
– LAM cu eozinofile medulare atipice
(inv(16)(p13q22)
sau t(16;16)(p13;q11), CBFB/MYH11X
– LAM cu modificari 11q23 (MLL)
– LAM cu t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL
– LAM cu t(6;9)(p23;q34);DEK-NUP214
– LAM cu inv(3)(q21q26.2) sau
t(3;3)(q21q26.2); RPN1-EVI1
– LAM (megacarioblastica) cu
t(1;22)(p13;q13);RBM15-MKL1
– LAM cu mutatie NPM1
– LAM cu mutatie CEBPA
II. Leucemii acute mieloblastice cu diplazie
multilineala
– Cu sindrom mielodisplazic anterior
– fara sindrom mielodisplazic anterior
III. Leucemia acuta mieloblastica si sindromul
mielodisplazic posterapeutic
– alchilanti
– inhibitori de topoizomeraza II
IV. Leucemia acuta mieloida neclasificata
in alta parte
• LAM minim diferentiata
• LAM fara maturatie
• LAM cu maturatie
• Leucemie acuta mielomonocitara
• Leucemia acuta monocitara
• Leucemie acuta eritroida
• Leucemia acuta megakarioblastica
• Leucemia acuta bazofilica
• Panmieloza acuta cu mielofibroza
• Sarcom mieloid
Leucemii acute limfoblastice
– leukemia/lymphoma cu Precursor B-
limfoblastic
– leukemia/lymphoma cu Precursor T-
limfoblastic
– lymphoma/leukemia Burkitt
Leucemii acute de linie ambigua
– leucemia acuta bifenotipica (BAL)
– leucemia acuta nediferentiata (AUL)
 Protocolul de analiza al
maduvei osoase
(Wintrobe’s Clinical Hematology 1998)

ASPIRAT MEDULAR

FROTIU TUB

· CITOCHIMIE · GENETICA MOLECULARA

· IMUNOLOGIE · CITOGENETICA

FILTRARE

· IMUNOLOGIE PRIN CITOMETRIE IN FLUX

· EX. HISTOLOGIC · MICROSCOPIE ELECTRONICA
· GENETICA MOLECULARA

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Diagnosticul morfo-citochimic
• Chiar morfologii cu experienta pot clasifica leucemiile
acute cu o sensibilitate de maximum 70 - 80% ca LAL
sau LAM
• Elemente de diagnostic morfologic:
– cromatina (fina in mieloblasti, deseori in gramezi in limfoblasti)
– nucleolii (distincti in mieloblasti, variabili in limfoblasti)
– citoplasma (moderata sau abundenta, deseori cu granulatii in
mieloblasti; putina sau moderata, foarte rar cu granulatii in
limfoblasti) – SPECIFIC: corpi Auer in mieloblasti
– Minim 20% blasti in maduva osoasa sau sangele periferic
• Coloratii speciale:
– Mieloperoxidaxa, Sudan black, Esteraze specifice (CAE) -
mieloida
– Esteraze nespecifice (ANAE) - monocitara
– PAS - limfoblastica Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
A: mieloperoxidaza, B: Sudan black, C: esteraze nespecifice, D: PAS

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Limfoblasti Mieloblasti

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
LAL 1
• Blasti cu talie mica-
medie cu raport
nucleocitoplasmatic
mare, cromatina fina
si nucleoli mici
• Frecventa la copii

• Linie B, fenotip tânăr,

CD19+ CD10+ CD20-
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
LAL 2
• Blasti de talie medie-
mare, polimorfi, cu
citoplasma bogata si
nucleoli proeminenti
• Distinctia intre LAL1 si
LAL2 nu este de
importanta majora
• Distinctia intre LAL2 si
LAM0 sau LAM1 poate fi
dificila
• Testele imunofenotipice
sunt definitorii
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 LAL 3
• Blasti cu citoplasma intens
bazofila si vacuole, nucleoli
proeminenti
• Apare la toate varstele
• Poate fi de novo sau
secundara infectiei cu
Epstein-Barr virus (EBV) in
locurile cu endemie de
malarie sau cu HIV.
• Distinctia intre LAL 3 si
LAL1/2 este cruciala.
• Se asociaza cu 3 translocatii • Linie B, fenotip matur,
cromozomiale specifice care
implica oncogena MYC CD20+, tip Burkit-like
• Necesita tratament intensiv si
au prognostic prost
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
Evaluarea riscului in LAL

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
LAM slab diferentiata (M0 FAB)
• Blasti fara granulatii in
citoplasma
• Negativi pentru coloratii
citochimice cu
mieloperoxidaza, Sudan
black B si esteraze
• Blasti > 20% dintre celulele
nucleate din maduva osoasa
• Blasti > 20% dintre celulele non-
eritroide din maduva osoasa
• <3% blasti positivi la Sudan
black B sau mieloperoxidaza
la microscopia optica
• Necesita imunofenotipare pentru
markeri de linie mieloida

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 LAM fara maturatie M1 FAB
• Blasti hipogranulari > 20%
din maduva osoasa
• Blasti> 90% dintre
celulele noneritroide din
maduva osoasa
• > 3% positivi la
mieloperoxidaza sau
Sudan black B
• Componenta medulara
monocitica matura
(promonocite si monocite)
<10% dintre celulele non-
eritroide
• Componenta medulara
mieloida matura
(promyelocites pana la
polimorfonucleare) <10%
dintre celulele non-eritroide
• Fara alterari cromozomiale
specifice
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta cu maturatie LAM2
FAB
• Blasti mieloizi cu corpi
Auer
• Blasti > 20% dintre
celulele medulare
• Componenta de maturare
meduara granulocitica
(promielocite spre
polimorfonucleare) >10%
dintre celulele noneritroide
• Componenta medulara
monocitica matura (monoblasti
si monocite) <20% dintre
celulele noneritroide medulare
si fara criterii de M4

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Leucemia acuta
promielocitara LAM3 FAB
• Promielocite
hipergranulare, unele cu
granulatii mari
• Criteriu de diagnostic este
inlocuirea maduvei osoase
cu Promielocite
hipergranulare atipice, care
au citoplasma plina cu
granulatii primare, unele
gigante si manunchiuri de • In M3 varianta
corpi Auer sunt
caracteristici
• Elemente clinice distincte nucleii bilobati,
prin asocierea cu CID –
in “haltera /
petesii, echimoze, uneori
fundita”, rare
hemoragii cerebrale.
granulatii fine in
Clinica Hematologie Spitalul citoplasma
Universitar de Urgenta Bucuresti • Rari corpi Auer
 Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta
mielomonocitara LAM4 FAB
• monoblasti si mieloblasti
• Blasti > 20% din maduva osoasa
• Componenta de maturare meduara
granulocitica (promielocite spre
polimorfonucleare) >20% dintre
celulele noneritroide
• Componenta medulara monocitica
matura (monoblasti si monocite) in
una din situatiile:
– >20% dintre celulele noneritroide
medulare si > 5 × 109/l in
sangele periferic sau
– > 20% dintre celulele
noneritroide medulare si
citochimic lizozim pozitiv sau
cresterea lizozimuliui seric sau • M4Eo cu
urinar sau diferentiere
eozinofilica
– Maduva osoasa cu aspect de M2
dar cu componenta monocitara in
sangele periferic > 5 × 109/l si
citochimic lizozim pozitiv sau
cresterea lizozimuliui seric sau
urinar
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Leucemia acuta monocitara LAM5
FAB
• Monoblasti de talie mare, care inlocuiesc
celulele maduvei osoase
• Blasti > 20% dintre celulele maduvei
osoase
• Componenta monocitara >80% dintre
celulele noneritroide:
– Leucemia acuta monoblastica (M5a)
• Monoblasti > 80% din componenta
monocitara medulara
– Leucemia acuta monocitara (M5b)
• Monoblasti <80% din componenta
monocitara medulara

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta eritroida LAM6 FAB
• Eritroblasti displazici si
mieloblasti
• Eritroblasti > 50%
dintre celulele nucleate
medulare
• Blasti > 20% celulele
noneritroide medulare
• Daca displazia este
prezenta in > 50% in
seria mieloida sau
megacariocitara – LAM cu
displazie multilineala

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta megacariocitara
LAM7 FAB
• Blasti > 20% dintre celulele
nucleate medulare
• Blastii demonstrati a fi megacarioblasti
prin imunofenotipare, analiza
ultrastructurala sau citochimie
ultrastructurala
• Pot fi esterazo si PAS pozitivi
• Linia megacariocitara definita
imunologic prin anticorpi monoclonali
CD61
• Syndromul Down (trisomia 8) se
asociaza frecvent cu M7 AML cu
splenomegalie tumorala si punctie alba

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta bazofilica

• Blasti vacuolati cu
granulatii bazofile
proeminente
• Diagnostic diferential
cu criza blastica din
leucemia
granulocitara cronica

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta eozinofilica

• Eozinofile atipice

• Pozitive la
chloracetatesteraze si
PAS

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta cu mastocite
• Mastocitele se coloreaza
metacromatic cu Giemsa
(granulatii rosii) si
toluidine blue (roz-rosu).
• chloroacetate esterase
pozitiva.
• Identificare cu anticorpi
monoclonali anti triptaza
mastocitului.

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Diagnosticul imunologic
Imunofenotiparea leucemiilor
acute
• Metode:
– Citometria in flux (flowcitometria)
• Analiza rapida (1-2 h)
• Multiparametrica, 4-5 markeri simultan
• Stocare digitala a datelor
• Analiza cantitativa si calitativa
• Identifica expresii aberante sau asincrone
• Permite monitorizarea bolii minime reziduale
– Imunohistochimia
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
Reproductibilitatea
diagnosticului leucemiilor
acute este de

• 60-70% in clasificarea morfologica,

• 89% in cazul clasificarii morfologice
asociate cu cea citochimica si de
• 99% in clasificarea morfologica
asociata cu cea citochimica si
imunofenotipica
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
Principiile citometriei in flux

Ingustare hidrodinamica
(“hydrodynamic focusing”)
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Principiile citometriei in flux

Forward Angle Light Scatter

Laser

FALS Sensor

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Principiile citometriei in flux
90 Degree Light Scatter

Laser

FALS Sensor

90LS Sensor

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Principiile citometriei in flux
Fluorescence Detectors
Laser

FALS Sensor

Freq
Fluorescence

Fluorescence detector
(PMT3, PMT4 etc.)
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
Principiile citometriei in flux
- calea optica -

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Principiul imunofenotiparii
Celulele au receptori de
membrana sau intracelulari
(glicoproteine) cu rol de
molecule de adeziune,
senzoriale, metabolice,
activare, etc.
Acesti receptori se pot identifica
prin anticorpi monoclonali

Y specifici, care se ataseaza prin

fragmentul Fab
Anticorpii monoclonali sunt
depistati prin conjugarea lor cu
un fluorocrom
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Side Scatter (SSC)
90° deflection
~ structura celulara

Forward Scatter
(FSC)
< 10° deflection
~ marimea celulara
Laser

Y Intensitatea Fluorescentei
Densitatea Antigenica

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Ontogenia seriei mieloide

MIELOBLAST MIELOBLAST MIELOBLAST

NEDIFERENTIAT SLAB DIFERENTIAT DIFERENTIAT PROMIELOCIT
LAM 0 LAM 1 LAM 2 LAM 3
HLADR HLADR HLADR
CD117 CD117
MPO CD13 CD13 CD13
MPO MPO MPO
CD33 CD33 CD33

CD34 CD34 CD15 CD15

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 ONTOGENIA SERIEI MONOCITARE

MONOBLAST PROMONOCIT MONOCIT MATUR

LAM 5a CD 14 LAM 5b
CD34 HLADR HLADR

CD13 CD13 CD13

CD33 CD33 CD33

CD14 CD15 CD14

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Utilitatea imunofenotiparii in
LAM

Utila in: Fara utilitate:

FAB M1
– FAB M0
FAB M5a
– FAB M7
FAB M5b
– FAB M3
FAB M6
– FAB M2
– FAB M4eo

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
LAM 0

CD33-PE
CD7-FITC

CD13-PE
CD15-PE

cyLF-PE
CD14-FITC HLA-DR-FITC MPO-FITC

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Leucemiile acute cu
celula B
Pro B-ALL Common B-ALL Pre B-ALL B-ALL
(BI) (BII) (BIII) (BIV)
IgM
CD19 CD19 CD19 Y CD19
CD10 CD10 CD20
TdT
CD22 CD22 CD22 CD22
CD79a
CD79a
m CD79a CD79a
CD65/15 CD24
CD34

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Leucemiile acute cu
celula T
Pro T-ALL Pre-T-ALL Cortical T-ALL Mature T-ALL
(TI) (TII) (TIII) (TIV)
CD7 CD7 CD7 CD7
CD5 CD5 CD5 CD5
TdT CD2 CD2 CD2
CD3 TdT
CD3 CD1a CD3

CD34
CD4 or CD8

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
LAL B matur

CD19-PE
CD19-
SSC

PE
LAL pre-T
FSC Kappa- Lambda-
FITC FITC
CD1a-PE

CD19-PE

CD2-FITC CD10-FITC
CD5-PE

cyCD3-

CD20-FITC Clinica Hematologie Spitalul

cyMPO-FITC
Universitar de Urgenta Bucuresti
 CLASIFICAREA IMUNOLOGICA A
LEUCEMIILOR ACUTE
Tipul leucemiei Imunofenotip specific
Leucemia acuta limfoblastica (LAL)
1. LAL cu celula pro-B („early pre-B”) CD19+ CD20+ cCD22+ CD34+ CD10+ TdT+
2. LAL cu celula pre-B CD19+ CD20+ CD22+ CD10+/- cµ+
3. LAL cu celula B CD19+CD20+ CD22+ IgMs+
4. LAL cu celula T CD7+ CD2+ CD5+ TdT+ CD34+
Leucemia acuta nonlimfoblastica (LANL)
1. Leucemia acuta mieloblastica minim diferentiata CD13+ CD33+ CD34+ MPO- (<3%) CD7+ TdT+/- HLA-
(LAM-M0) DR+ CD117+
2. Leucemia acuta mieloblastica fara maturatie (LAM- CD13+ CD33+ CD34+ MPO+ (>3%) CD7+/- HLA-DR+
M1) CD117+
3. Leucemia acuta mieloblastica cu maturatie (LAM-M2) CD13+ CD33+ CD34+ MPO+ HLA-DR+ CD15+
4. Leucemia acuta promielocitara (LAP, LAM-M3) CD13+ CD33+ CD34+/- MPO+ HLA-DR- CD15+ CD2+
(in LAM3v)
5. Leucemia acuta mielomonocitara (LAMMo, LAM- CD13+ CD33+ CD34+ HLA-DR+ CD14+ MPO+ CD2+
M4) (LAM4Eo) CD64+
6. Leucemia acuta monocitara (LAMo, LAM-M5) CD13+ CD33+ CD14+ HLA-DR+ MPO-
7. Eritroleucemia acuta (ELA, LAM-M6) Glycophorin A+ CD33+ CD13+
8. Leucemia acuta megacariocitara (LAMeg, LAM-M7) CD61+ CD41+ CD42b+ CD34+
Leucemia acuta bifenotipica / bilineala Clinica Hematologie Spitalulscorul imunofenotipic
Se utilizeaza
Universitar de Urgenta Bucuresti
Leucemia acuta nediferentiata (neclasificabila) CD34+CD38+ CD7+ HLA-DR+
Scorul pentru leucemiile acute
bifenotipice
EGIL-Group, Leukemia 1995, 9: 1783-86
Puncte Linie B Linie T Linie mieloida
2 CD79a CyCD3/CD3 Mieloperoxidaza
CyIgM TCRα/β (Lizozim)
CyCD22 TCR γ/δ
1 CD19 CD2 CD13
CD10 CD5 CD33
CD20 CD8 CD65
CD10
0,5 TdT TdT CD14
CD24 CD7 CD15
CD1a CD64
CD117
Tip de leucemie Punctaj linie limfoida Punctaj linie mieloida
Leucemie acuta bifenotipica >2 >2
Leucemie acuta limfoblastica cu markeri mieloizi >2 <2
Leucemie acuta mieloida cu markeri limfoizi <2 >2
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Coexpresii imunofenotipice
aberante in leucemiile acute
Coexpresie Subtip

CD15/CD65 Pro-B-ALL
Detectarea
CD7 AML M0/M1/M2 sensibila a
bolii minime
CD2 AML FAB 4eo reziduale

CD19/CD56 AML FAB M2

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Diagnosticul citogenetic si
molecular
• Determina modificarile cromzomiale din
leucemiile acute – examenul de cariotip
citogenetic
• Determina genele de fuziune rezultate din
aberatiile cromozomiale in leucemiile acute
– examenul de biologie moleculara

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Aberatii cromozomiale specifice in leucemiile
acute
Subtip leucemie Translocatie
acuta specifica
Pro-B-ALL t(4;11)
C-ALL t(9;22)
AML FAB M2 t(8;21)
AML FAB M3 t(15;17)
AML FAB M4 eo inv16
AML FAB M5 t(9;11)

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Importanta prognostica a
modificarilor genetice in LAM:

1. Prognostic bun al subtipurilor de LAM:

– t(8;21)(q22;q22);(AML1/ETO)
– inv(16)(p13q22) sau
t(16;16)(p13;q22);(CBFb/MYH11)
– t(15;17)(q22;q12)(PML/RARa)
2. Prognostic prost pentru LAM cu:
– Cariotip complex
– Deletii partiale sau totale ale cromozomilor 5 si 7

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Importanta prognostica a modificarilor
genetice in LAL:
1. LAL B precursor
– Prognostic bun
• t(12;21)(p13;q22) gena TEL/AML1
• hiperdiploidie >50
– Prognostic prost
• t(9;22)(q34;q11.2) cr Ph1 – gena BCR/ABL p190 kd la copii,
p210 kd la adulti; frecventa in peste 1/3 dintre LAL
bilineale/bifenotipice
• t(4;11)(4q21;11q23) gena MLL
• T(1;19)(1q23;19p13.3) gena E2A/PBX
• Hipoploidia<50
2. LAL B matur (Burkit like)
– t(8;14)(q24;q32) (IgH)
mai rar
– t(2;8)(q11;q24) (lant usor)
– t(8;22)(q24;q11)
Clinica(lant usor)
Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
t(8;14)(q24;q32)
in LAL3 Burkitt

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
t(4;11)(q21;q23)/MLL-AF4
in LAL pre-B

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
 Diagnosticul molecular
1. Sunt identificate genele de fuziune:
• BCR/ABL – in LAL cr Ph1
• PML/RARa – in LAP
• AML1/ETO – in LAM subtip favorabil
• TEL/AML1 – in LAL precursor B
• MLL - in LAL precursor B
• E2A/PBX - in LAL precursor B
• TAL1/SCL – frecventa in LAL-T – fara semnificatie
prognostica
Este foarte importanta in controlul bolii minime reziduale
2. Analiza prin microarray – analiza globala a mutatiilor
cromozomiale aparute in celulele maligne
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 SUMAR
Diagnosticul leucemiilor acute este complex si
include urmatoarele etape:

1. Etapa clinica – suspiciune de leucemie acuta

2. Etapa morfocitochimica – confirmare de
leucemie acuta
3. Etapa imunofenotipica –completarea incadrarii
in subtipul imunologic/fenotipic
4. Etapa citogenetica si moleculara – incadrarea
prognostica si in clasificarea OMS
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
 Tratamentul leucemiilor
acute
• Inducerea remisiunii si tratamentul post-remisiune
• Scopul initial al terapiei este inducerea remisiunii
complete (RC) – de obicei in 1-2 cicluri
• RC este definita prin normalizarea numarului de
neutrofile (> 1.5 × 109/L) si trombocite (>100 ×
109/L), si aspiratul/biopsia osoasa cu cel putin
20% celularitate, mai putin de 5% blasti, fara
corpi Auer, ca si absenta leucemiei extramedulare

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Fazele terapiei

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Terapia de inductie a remisiunii
• “7 + 3” ara-C cu adriablastin sau idarubicin in
LAM risc standard
• In LAP – chimioterapie (idarubicina/adriablastina
+ ara-C) cu acid retinoic
• Vincristin + adriablastina + dexametazona si L-
asparaginaza - luna1, ciclo, adriablastina,
purinethol - luna 2 in LAL
– Profilaxia determinarilor SNC – adm. intratecala
citostatic
– Imatinib (ITK) in LAL Ph1+
– Dasatinib (ITK) in LAL puseu blastic din LMC
Clinica Hematologie Spitalul
Universitar de Urgenta Bucuresti
Terapia postremisiune

• Terapie de consolidare si intensificare 2-4

cicluri – pentru reducerea incarcarii
tumorale cu High dose ara-C +
antracicline
• Mentinere – la varstnici care nu tolereaza
consolidarea (cu purinetol si metotrexat)
pana cca 1-2 ani

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Transplantul de celule stem

• Allogeneic SCT
• In LAM si LAL cu prognostic prost sau risc
inalt se recomanda dupa obtinerea
remisiunii complete (RC)
• In LAL cu risc standard este recomandat
dupa prima recadere in forma cu risc
standard

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Tratament suportiv
• Transfuzii:
– Masa trombocitara – trombocitopenie < 30000-
50000/mmc sau sdr. hemoragipar
– Masa eritrocitara – anemie
– Plasma proaspata congelata, crioprecipitat –
coagulopatie intravasculara diseminata
• Tratament antibiotic si antimicotic, antiviral:
– Neutropenie severa < 1500/mmc

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
Tratamente noi - imunoterapie

• Anticorpi monoclonali:
– Anti CD33, anti CD45, anti CD66, anti CD20
(utilizat standard in LAL Burkitt-like), etc.

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti
CAR-T cell therapy
aprobat in 2017 de catre FDA
Tratamente noi – inhibitori ai
semnalelor intracelulare

Clinica Hematologie Spitalul

Universitar de Urgenta Bucuresti