Universidade Federal de Uberlândia

Instituto de Ciências Biomédicas

Programa de Pós-Graduação em Imunologia e Parasitologia
aplicadas
Disciplina: Seminários de Imunologia II

Projeto de pesquisa:
ANÁLISE EM REDES DE BIOMARCADORES IMUNOLÓGICOS E
SUAS ASSOCIAÇÕES COM ASPECTOS CLÍNICOS DA
TOXOPLASMOSE CONGÊNITA EM CRIANÇAS DO ESTADO DE
MINAS GERAIS

Aluna: Thádia Evelyn de Araújo

Introdução
• Toxoplasmose: América do Norte x América do Sul;
• Europa e América do Norte: Toxoplasma gondii tipo I, II ou III.
• Variação dos sintomas clínicos por área geográfica.

Google: Imagens
Tipo II: população européia e norte-americana:
infecções geralmente assintomáticas e menos
propensos a resultar em toxoplasmose ocular.

Tipo I e "atípicos”: predominam na América do Sul:

toxoplasmose com mais grave progressão e
sintomas
 Colômbia Guiana Francesa

Casos oculares Infecções disseminadas em

mais graves (de-la- imunocompetentes (Darde
Torre et. al, 2009) et. al, 1998)

Franceses
Cepas atípicas;
Aumento IL-6 e IL-13 e
diminuição de níveis
Cepas tipo II de IFN-γ e IL-17 (de-la-
Torre et. al, 2013)
Escassez de dados sobre os efeitos da toxoplasmose sobre
a RI em humanos infectados e se estas respostas podem
ser diferentes entre os indivíduos na América do Norte e
América do Sul

Análise de citocinas de sangue periférico de

mulheres grávidas infectadas provenientes
dos EUA e da Colômbia
Metodologia
Grávidas EUA COLÔMBIA
Nº total 144 113
Não infectadas 48 (17-43) 50 (17-46)
Infectadas cronicamente 49 (16-47) 50 (16-43)
Infectadas de forma aguda 47 (18-43) 13 (18-36)
Diagnóstico sorológico ELISA MEIA

• HIV negativas;
• Nenhum tratamento administrado antes das coletas;
Baseado no diagnóstico sorológico:

• Negativo: IgG/IgM negativos

• Crônico: IgG positivo/IgM negativo
• Aguda: IgG/IgM positivos
• Medição de citocinas;
• Citometria de fluxo: kit Luminex Human 51-plex;

CD40L, ENA78, eotaxina, FGF-β, GCSF, GMCSF, CXCL1, HGF, IFN-α,

IFN-β, IFN-γ, IL1-α, IL1-β, IL1R-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-
10, IL12p40, IL12p70, IL-13, IL-15, IL-17, IL17F, CXCL10, Leptina,
LIF, CCL2, CCL7, MCSF, CXCL9, CCL3, CCL4, NGF, PAI-1, PDGF-β-β,
CCL5, RETN, SCF, FasL, ICAM-1, VCAM-1, TGF-α, TGF-β, TNF-α,
TNF-β, TRAIL, e VEGF
Resultados e discussão
Infecção aguda x não-infectadas

• 51 citocinas: 23 tiveram decréscimo.

• CXCL1, IL-17, IL-1α, IL-2, IFN-γ, IL-4
• CCL5 e CCL7;

MCSF: fator estimulador de colônia de macrófago

Grávidas
norte-americanas
 Infecção crônica x não-infectadas

• 9 das 24 citocinas que decaíram na infecção aguda;

Fator inibidor da leucemia (LIF)

O mecanismo para a depressão de níveis de citocinas não é

conhecida o resultado de vias de regulação negativa ativados
na tentativa de neutralizar a imunopatologia potencial em vários
órgãos, incluindo o placenta.
 Respostas imunológicas inflamatórias mediadas pela
elevação de diversas citocinas, incluindo IL-12, IFN-γ, IL-6,
IL-10 e TNF-α em camundongos, e CD40L durante
infecção humana.

• Polarização de resposta TH2 nas grávidas;

• Citocinas GCSF e TNF-α são frequentemente
elevadas durante a gravidez;
• Efeitos de longo prazo de uma infecção crônica por Toxoplasma em
grávidas americanas;

Infecção crônica pode ter profundas

implicações para a forma como o
sistema imunológico da grávida
responde a outras infecções, alérgenos,
ou vacinas;
Grávidas colombianas
• Diferenças claras nos perfis de citocinas de coortes geograficamente
distintas;

• IL-1α e TRAIL: pacientes colombianas

• Diferentes cepas de T. gondii.

 de-la-Torre et al. (2013)

• Toxoplasmose ocular na América do Sul e Europa;

• Colombianos: IFN-γ e IL-17 e IL-6
IL-13 • Estado do parasita
infectante;
• Status de co-infecção;
• Dieta;
Diferenças encontras no • Medicamentos
microambiente local x • Genética do
Resposta imune sistêmica hospedeiro
• Limitações do estudo:

• Não inclusão de mulheres não-grávidas;

• Não conhecimento da idade gestacional das grávidas;
• Não conhecimento da data da infecção;
• A hora do dia da coleta de sangue não foi gravado: ritmos
cardíacos, refeições, exercícios e outros fatores;
O conhecimento da rede de citocinas durante
infecção nos permitirá projetar estratégias
terapêuticas direcionadas?

A partir de quais tipos de células e

tecidos estas citocinas estão sendo
feitas durante a infecção?

Abordando estas questões podemos aprender mais sobre:

• o que molda a resposta imunológica durante a infecção inicial e expansão
de Toxoplasma;
• como influenciar este ambiente pode ditar a progressão e patogênese
da infecção em gestantes .
 Projeto de pesquisa:
ANÁLISE EM REDES DE BIOMARCADORES IMUNOLÓGICOS E SUAS ASSOCIAÇÕES
COM ASPECTOS CLÍNICOS DA TOXOPLASMOSE CONGÊNITA EM CRIANÇAS DO
ESTADO DE MINAS GERAIS

Aluna: Thádia Evelyn de Araújo

Orientador: Olindo Assis Martins Filho
Co-orientadora: Eloísa Amália Vieira Ferro
Introdução
• Toxoplasmose e Toxoplasma gondii: epidemiologia;
• Formas de T. gondii;

Taquizoíta Bradizoíta Esporozoítas

http://www.ufrgs.br/para-site/siteantigo/Imagensatlas/Protozoa/Toxoplasma.htm
• Vias de infecção para os seres humanos:

• ingestão de carne crua ou mal cozida

contendo cistos com a forma bradizoíta ;

• ingestão de água e alimentos contaminados

com oocistos excretados nas fezes de felídeos infectados;

• transmissão congênita, por meio da transferência

de taquizoítas da mãe para o feto através da placenta
• Transmissão via placentária;
• Placenta tem papel importante na transmissão materno-fetal: células
trofoblásticas;
• A imunomodulação: cria mecanismos que favorecem o escape de T.
gondii;
O aumento da susceptibilidade de células
do trofoblasto para T. gondii
• As manifestações clínicas da infecção congênita variam de acordo
com a fase da gestação em que ocorre a transmissão do parasito para
o feto.

• aborto espontâneo e morte fetal no interior do útero;

• ou nascimento de crianças com hidrocefalia;
• Microcefalia;
• calcificações intracranianas;
• coriorretinite;
• estrabismo;
• cegueira;
• epilepsia
Melamed, Dornelles and Eckert, 2001
• retardamento mental e motor;
• trombocitopenia e/ou anemia.
 Quiomiocinas e citocinas são moléculas extremamente
importantes na luta do hospedeiro contra a infecção
por T. gondii.

• adesão e quimiotaxia de leucócitos,

• maturação e ativação celular
• regulação da duração e intensidade das respostas específicas contra
patógenos e doenças não infecciosas
BIOMARCADORES FUNÇÃO
IL-2 ativação de células natural killer (NK) e proliferação
de células T CD4+ e TCD8+
IL-12 desenvolvimento de uma resposta imune Th1

IFNγ controle da infecção aguda e crônica por T. gondi

TNFα: produção da moléculas microbicidas

IL-10, IL-4 e IL-5: regulação da resposta inflamatória à infecção por T.

gondii
TGFβ controle da patologia intestinal após a infecção oral
pelo parasito

IL17A associada com imunopatologia apresentada pelo

hospedeiro durante a infecção pelo parasito ;
IP-10, MIG, MCP-1, RANTES e IL8, adesão e quimioatração celular para o sítio
inflamatório da infecção e fagocitose celular

IL-21 produção de IgG específico

Objetivo
• Analisar o perfil de produção dos biomarcadores imunológicos,
citocinas e quimiocinas, de recém-nascidos com a doença congênita
causada por T. gondii no Estado de Minas Gerais.

• Correlacionar o perfil destes biomarcadores, citocinas e quimiocinas,

com achados clínicos importantes da toxoplasmose congênita como:
comprometimento oftalmológico, auditivo e neurológico.
Metodologia
• 80 crianças recém- nascidas que apresentarem resultado positivo
para IgM anti-T. gondii em um período de 30 a 60 dias após o
nascimento.

• Colaboração com o projeto “TRIAGEM NEONATAL PARA

TOXOPLASMOSE CONGÊNITA NO ESTADO DE MINAS GERAIS”;

• Tratamento: associação de sulfadiazina + pirimetramina + ácido

folínico durante o primeiro ano de vida e acompanhadas por um
período mínimo de cinco anos
Grupos de estudo:

• Grupo Controle: 20 crianças recém-nascidas - resultado positivo para IgM

anti-T.gondii na 1ª análise sorológica, realizada de 30 a 60 dias após o
nascimento, sem confirmação de resultado positivo para a imunoglobulina G
específica aos antígenos de T. gondii, a ser realizado 1 ano após o tratamento.

• Grupo Toxoplasmose Congênita: será composto por 60 crianças recém-

nascidas, que apresentarem resultado positivo para a pesquisa de IgM anti-
T.gondii na 1ª análise sorológica, realizada de 30 a 60 dias após o nascimento,
com confirmação de resultado positivo para IgG específica aos antígenos de T.
gondii, a ser realizado 1 ano após o tratamento.
• Grupo de Crianças com Toxoplasmose Congênita SEM lesão ocular
(n=20);
• Grupo de Crianças com Toxoplasmose Congênita COM lesão ocular
ativa (n=20);
• Grupo de Crianças com Toxoplasmose Congênita COM lesão ocular
cicatrizada
• (n=20);
• Amostra biológica:
• 4,5mL de sangue periférico, colhidos em heparina sódica.
• Separação do plasma por centrifugação;
• as amostras serão organizadas, identificadas e estocadas sob
refrigeração a -80ºC, no intuito de preservar os biomarcadores a
serem dosados.
• Biomarcadores imunológicos:
• A análise de citocinas (IL-2, IL-4, IL-6, IFNγ, TNFα, IL-17A, IL-10) e
quimiocinas (IP-10, MIG, MCP1, RANTES e IL-8);
• kit CBA (Cytometric Bead Array-Becton Dickinson), que utiliza
microesferas fluorescentes por citometria de fluxo para quantificação
dos analitos.
• Descongelar as amostras em banho-maria a 37ºC e centrifugar por 10
minutos a 14.000 rpm.
• Recolher o sobrenadante com cuidado para evitar contaminação de
micropartículas.
• Reconstituir o padrão 15 minutos antes com 200μL do tampão para uma
solução 10x concentrada.
• Manter o padrão reconstituído em repouso por pelo menos 15 minutos
até a sua utilização no ensaio, homogeneizando suavemente em
intervalos de 3 minutos.
• Diluir a solução concentrada de maneira a obter a curva padrão com as
seguintes diluições: TS, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128 e 1/256.
Adicionar 900μL de tampão na diluição da curva padrão TS e 300μL nas
demais diluições. Adicionar 100μL da solução padrão estoque 10x na
diluição TS. Fazer diluições sucessivas usando o volume de 300μL.
Utilizar o tampão como controle negativo ou branco.
• Para a mistura das beads fazer um pool dos reagentes (A1 até A6 – citocinas e A1
até A5 – quimiocinas) imediatamente antes do uso. Pipetar 3μL de cada beads
para cada ensaio. Utilizar 15μL do pool de beads para cada amostra, 25μL dos
padrões, nas respectivas diluições, e 25μL das amostras nos respectivos tubos.
Adicionar em todos os tubos 16μL do reagente de detecção marcado com PE e
incubar 3 horas, a temperatura ambiente (TA) e ao abrigo da luz. Adicionar 500μL
do tampão de lavagem em cada tubo e centrifugar a 1300rpm, 7 minutos, 18oC.
Aspirar o sobrenadante com bomba de vácuo e ressuspender as beads em
aproximadamente 150μL para a leitura em citômetro de fluxo.
• A análise dos dados deverá ser feita utilizando-se o software específico, por meio
da obtenção de curvas de calibração obtidas dos padrões de citocinas do kit. Após
a construção das curvas, a concentração dos analitos na amostra será
determinada em pg/mL, a partir dos valores de Intensidade Média de
Fluorescência (MFI) obtidos na leitura da fluorescência 2.
Resultados esperados

• Identificação de biomarcadores imunológicos associados aos

diferentes padrões clínicos da toxoplasmose congênita.

• Identificação marcadores que possam ser empregados na

monitoração precoce de recém-nascidos com suspeita de transmissão
congênita de toxoplasmose.
Resultados esperados
• Implementação de medidas de controle e tratamento da infecção
congênita, permitindo interceptar o desenvolvimento de formas
clínicas mais graves;

• identificar moléculas que caracterizem prognóstico de evolução clínica

e ainda servir como indicador laboratorial na monitoração do pós-
tratamento, visando o estabelecimento de eficácia terapêutica.
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