ESTERILIZACIÓN EN

MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

• Dr. Tomás Galicia García

• Dr. Rubén Márquez Meléndez

1
La esterilización es un proceso que sirve para destruir
o inactivar microorganismos viables en un medio de cultivo
líquido, sólido, gas (aire) o en el equipo de fermentación.

En la práctica no es posible matar o inactivar «todos» los

organismos viables.

Por lo tanto, la esterilización comercial tiene como objetivo

reducir el riesgo de contaminación a un nivel aceptable.

Los factores que determinan el grado de esterilización

incluyen seguridad, costo y efecto en el producto.

2
Por qué la esterilización ?:

• La mayor parte de las fermentaciones deben estar

completamente libres de microorganismos extraños o
contaminantes.

• De lo contrario, el microorganismo de interés debe

competir con los microorganismos contaminantes por
los nutrientes.

• Los microorganismos contaminantes pueden generar

productos nocivos (o no deseados) que pueden inhibir
el crecimiento de los microorganismos de producción.

3
•Las pérdidas económicas son grandes cuando existe
contaminación en el proceso.

•Las vacunas deben contener únicamente microorganismos

muertos o atenuados.

•En los bioprocesos de producción de ADN recombinante –

los efluentes deben ser esterilizados.

4
Métodos de esterilización:
• Térmico:
Es el mas utilizado en procesos a nivel industrial para
medios de cultivo y equipo.

• Químicos:
Preferido para equipos sensibles al calor
→ Óxido de etileno (gas) para equipos
→ Etanol- agua 70:30 (pH=2) para superficies y equipo
→ Hipoclorito de sodio (3%)

• Radiaciones:
→ Rayos ultravioleta para superficies
→ Rayos X para líquidos (costo/seguridad)

5
• Sonicación (ultrasonidos)

• Ultracentrifugación

• Filtración:
Para material sensible al calor y esterilización del aire

6
Esterilización Batch con aplicación
de calor

- Este método de esterilización consiste en esterilizar

el volumen completo del medio de cultivo.

- Siempre vamos a tener una fase de calentamiento,

una fase de sostenimiento y una fase de enfriamiento.

-La fase donde se destruyen mayor cantidad de microorganismos

es la fase de sostenimiento.

7
Esterilización Batch con calor:
• Se puede usar aire seco o vapor como agente de calor.

• También se puede utilizar calor húmedo ( vapor) .Por

ejemplo: 121oC a 2 bar.

• La tasa de mortalidad de las células es mayor con

calor húmedo que con calor seco , ya que el agua
conduce más rápido el calor que un sistema seco,
(aire).

• Por lo tanto, el vapor húmedo es más eficaz que el aire

seco.

• El calor no contamina el medio de cultivo o equipo

(como en el caso de los agentes químicos).
8
Esterilización con calor seco

- Flama directa

- Incineración

- Estufa de aire caliente

170 °C por 1 hora
140 °C por 3 hora
.
9
Esterilización con calor húmedo
- Pasteurización ( menor a 100oC)
Destruye patógenos sin alterar el sabor del alimento.
Método clásico: 63oC; 30 min
Alta Temperatura/Tiempo corto (HTST) : 71.7oC; 15-20 seg
Ultra Alta Temperatura (UHT) : 135oC; 1 seg
- Ebullición (a 100oC)
Mata la mayoría de las células vegetativas
Requiere 10 min ó mas
El virus de la Hepatitis sobrevive 30 min y las endosporas 20 h
- Autoclave ( mayor de 100oC)
- mata endosporas y y microorganismos en su
forma vegetativa 121-132oC; 15 min ó mas

10
 Cinética de Muerte Térmica :

dnt
= - kd nt (1)
dt
dónde
nt número de organismos vivos presentes
t tiempo de esterilización
kd velocidad específica de muerte térmica (1er. orden)

kd depende del tipo de especie, el estado fisiológico de la

célula, así como de la temperatura.

kd para células vegetativas > kd para esporas > kd para virus

(10 a 1010/min) (0.5 a 5/min)

11
 Crecimiento de la Hifa

Producción
Germinación de la
de esporas
espora

Esporas

Las esporas forman parte de los ciclos de vida de muchas

bacterias, plantas, algas, hongos y algunos protozoos. (Hay
esporas bacterianas viables que se han encontrado que tienen
40 millones de años en la Tierra y que están muy endurecidas
por la radiación )
12
Una espora es una estructura reproductiva que se adapta a la
dispersión y sobrevive durante largos períodos en
condiciones desfavorables.

La principal diferencia entre las esporas y las semillas como

unidades de dispersión es que las esporas tienen muy pocos
recursos de alimentos almacenados en comparación con las
semillas.

13
Cinética de Muerte Térmica (continuación):
Integrando (1) teniendo como condición inicial n = no a t = 0 nos
da: t

ln
nt
no = -
0
 kd dt (2)

t
nt
no
= exp - ( ) 0
kd dt (3)

Factor de sobrevivencia

1 no
Factor de Inactivation꞊ Factor sobrev. = nt

14
Cinética de Muerte Térmica (operación isotérmica):
kd es una función de la temperatura, y es una constante
para condiciones isotérmicas.

(2) por lo tanto nos da:

nt (4)
ln = - kd t
no

nt
= exp(- kd t) (5)
no

15
Cinética de Muerte Térmica
(operación no-isotérmica):
kd Es expresada por la Ecuación de Arrhenius :

kd = kdo exp -
( ) Ed
RT
(6)

dónde
kdo Constante de Arrhenius para muerte celular térmica
Ed Energía de activation para muerte celular térmica
R Constante universal de los gases
T Temperatura absoluta

16
Cinética de Muerte Térmica
(operación no-isotérmica):
Cuando kd de (6) se sustituye en (2), tenemos la siguiente
expresión:
t

 ( )
n Ed
ln t
= - kdo exp - dt (7)
no RT
0

Para llevar a cabo la integración anterior, necesitamos saber

cómo cambia la temperatura (T) con el tiempo (t).

17
Determinación de las constantes de
Arrhenius:
kd = kdo exp - ( )
E
RT
d
(6)

Ed
ln(kd) = ln(kdo) - (7)
RT

ln(kd) ln(kdo)

Ed
R

1/T 18
Ejemplo1:
Un medio de fermentación contiene una concentración inicial de
esporas de 8.5 x 1010. El medio se esteriliza térmicamente a 120
° C y se observa la evolución del número de esporas con
respecto al tiempo como se indica a continuación :

Tiempo 0 5 10 15 20 30
(min)
Densidad de 8.5 x 4.23 x 6.2 x 1.8 x 4.5 x 32.5
esporas (m-3) 1010 109 107 106 104

a) Determine la velocidad específica de muerte térmica.

b) Calcule el Factor de sobrevivencia a los 40 min.

19
Solución al Ejemplo 1:
Datos : no = 8.5 x 1010
datos de nt vs. t son proporcionados
operación isotérmica a 120oC.

a) Dado que es una operación isotérmica, la velocidad

específica de muerte térmica(kd) es una constante. Por lo
tanto, (10.4) se puede utilizar como sigue:
nt
ln = - kd t
no

Graficando ln(nt /no) contra el t y encontrando la

pendiente dará el valor numérico de kd .

20
Solución al Ejemplo 1:
t (min)
0 10 20 30
0
-5
ln(nt/no)

-10

-15
y = -0.7201x
-20 2
R = 0.9988
-25

kd = -pendiente = 0.720 por min

21
Solución al Ejemplo 1:

1
0.8
0.6
nt/no

0.4
0.2
0
0 10 t (min) 20 30

22
Solución al Ejemplo 1:
b) Dado que se conoce kd a partir de (a), el factor de
supervivencia a los 40 min se puede calcular usando (5) como
sigue:
nt
= exp (- 0.720 por min x t)
no
= exp (- 0.720 por min x 40 min)

= 3.11 x 10-13 = factor de supervivencia

nt = 3.11 x 10-13 no = 3.11 x 10-13 x 8.5 x 1010 = 0.026

Sabemos que nt no puede ser menor a 1. El número

encontrado (0.026) se interpreta como que las
posibilidades de supervivencia para el organismo vivo
son de 26 en 1000.
23
Solución al Ejemplo 2:
Los datos cinéticos de muerte térmica de Bacillus
stearothermophilus (que es uno de los microorganismos más
resistentes al calor) son los siguientes a tres temperaturas
diferentes:
Temperatura (oC) 115 120 125
kd (min-1) 0.035 0.112 0.347

a) Calcular la Energía de Activación (Ed) y la Constante de

Arrhenius (kdo) .
b) Encuentre el valor de kd a 130oC.

24
Solución al Ejemplo 2:

Se conocen los Datos de kd contra temperatura :

a) La energía de Activación (Ed) y la Cte. De Arrhenius (kdo)

pueden ser determinadas partiendo de (7) como sigue:

Ed
ln(kd) = ln(kdo) -
RT

Graficar ln(kd) contra 1/T ( la T está en 0 K).

La pendiente es (–Ed/R) y el intercepto ln(kdo).

25
Solución al Ejemplo 2:
1/T (per K)
0.0025 0.00252 0.00254 0.00256 0.00258 0.0026
0
-0.5 y = -35425x + 87.949
-1 R2 = 1
-1.5
ln(kd)

-2
-2.5
-3
-3.5
-4
Pendiente = –Ed/R = –35425 K
Intercepto = ln(kdo) = 87.949
26
Solución al Ejemplo 2:
Pendiente = –Ed/R = –35425 K

Ed = (35425 K) (R) = 35425 x 8.314 kJ/kmol = 294.5 kJ/mol

Energía de Activación
Intercepto = ln(kdo) = 87.949

kdo = exp(87.949) = 1.5695 x 1038 por minuto

= 2.616 x 1036 por segundo

Constante de Arrhenius
27
Solución al Ejemplo 2 :

b) Dado que la Energía de Activación (Ed) y la Cte. de Arrhenius

(kdo) de la gráfica de velocidad específica de muerte térmica
(kd) se conocen a partir de (a), el valor de kd a 130oC (6) es
determinado como sigue:

kd = kdo exp - ( ) Ed
RT

= (2.616 x 1036 por s) exp ( -

294.5 x 103
8.314 (273+130) )
= 0.0176 por s = 1.0542 por min

28
Solución al Ejemplo 2 :
1/T (per K)
0.00245 0.0025 0.00255 0.0026
0.5
0
y = -35484x + 88.101
-0.5
-1 R2 = 1
ln(kd)

-1.5
-2
-2.5
-3
-3.5
-4

Valor calculado a 130oC

29
Criterio de diseño para la esterilización:
t

 = ln
no
nt = 
0
kd dt (8)

 ( ) Ed
= kdo exp - dt (9)
RT
0

Factor Del o Nabla : Medida de la reducción fraccional

en el conteo de los organismos vivos sobre el número
inicial presente.

30
 Determinación del Factor Del para reducir el número de
células iniciales viables en un fermentador de 1010t a 1:

 = ln
no
nt
= ln
1010
1
= 23 =
0
 kd dt

Incluso si un organismo se deja vivo, el fermentador entero

puede estar contaminado.

Por lo tanto, ningún organismo debe dejarse vivo.Es decir, n = 0

infinito

 = ln
no
nt
= ln
1010
0
= infinito =
0
 kd dt

Para lograr este factor, necesitamos un tiempo infinito, lo cual

no es posible.
31
Por lo tanto, n no debe ser 1, y no puede ser 0.

Vamos a elegir n = 0.001

(Significa la posibilidad de 1 en 1000 para sobrevivir):
t

 = ln
no
nt
= ln
1010
0.001
= 30 =
0
 kd dt

Usando la ley de Arrhenius:

t

 ( )
Ed
= kdo exp -
RT
dt = 30
0
El perfil de temperatura durante la esterilización debe
elegirse de tal manera que el Factor Del pueda llegar a
ser 30.
32
Perfil típico, de tiempo temperatura durante la
esterilización
calentamiento
sostenimiento

enfriamiento

33
Métodos y equipos de esterilización

34
Esterilization Batch (Tipo de calentamiento):

Eléctrico Vapor directo aspersión Vapor

35
Para calentamiento eléctrico con flujo de calor
constante: Calor total perdido por el serpentin al medio
= calor ganado por el medio

M - masa de medio
T0 - temperatura inicial del medio
T - temperatura final del medio
c - calor específico del medio
.
q -Velocidad de transferencia de calor
del intercambiador al medio

Calentamiento eléctrico
.
q t = M c (T - T0) (10)
36
Calor por vapor directo - aspersión:
M - mas inicial del medio
T0 - temperatura inicial del medio
.
ms - flujo másico de vapor
t - duración de la aspersión de vapor
H - entalpía de vapor relativa a la
entalpía de la temperatura inicial
del medio (T0)
T - temperatura final de la mezcla
c - calor específico del medio y del agua
. . st) c T
(ms t) (H + cT0) + M c T0 = (M + m
Vapor directo-aspersión
. .
ms t H = (M + ms t) c (T – T0) (11)
37
Calentamiento con fuente de calor isotérmica:
M - masa de medio
T0 - temperatura inicial del medio
TH - temp. de la fuente de calor(vapor)
T - temperatura final del medio
c - calor específico del medio
t - duración del calentamiento
U - coeficiente de trasferencia de calor
A - área de transferencia de calor

T0 - TH
Vapor U A t = M c ln ( T - TH ) (12)

38
Calentamiento con fuente de calor isotérmica :

T0 - TH
U A t = M c ln ( T - TH )

(
T = TH + (T0 - TH) exp - U A t
cM )
Vapor

39
Ejemplo con calentamiento por vapor directo-aspersión:
Un fermentador conteniendo 40 m3 de medio a 25oC es
esterilizado por inyrcción directa de vapor saturado. El vapor
con 350 kPa de presión absoluta con un flujo de 5000 kg/hr,
el cual es detenido cuando la temperatura del medio alcanza
122oC. Determine el tiempo de calentamiento del medio.
Solución:
. .
Utilizar ecuación ms t H = (M + ms t) c (T – T0)

Datos requeridos:
Entalpía de vapor saturado a 350 kPa = ?
Entalpía del agua a 25oC = ?
Densidad del medio = ?
Capacidad calorífica del medio = ?
40
Ejemplo con calentamiento por vapor directo-aspersión :
Un fermentador conteniendo 40 m3 de medio a 25oC es
esterilizado por inyección directa de vapor saturado. El vapor
con 350 kPa de presión absoluta con un flujo de 5000 kg/hr,
el cual es detenido cuando la temperatura del medio alcanza
122oC. Determine el tiempo de calentamiento del medio.
Solución:
. .
Utilizar ecuación ms t H = (M + ms t) c (T – T0)
Datos requeridos:
Entalpía de vapor saturado a 350 kPa = 2732 kJ/kg
Entalpía del agua a 25oC = 105 kJ/kg
Densidad del medio = 1000 kg/m3
Capacidad calorífica del medio = 4.187 kJ/kg.K

41
 . .
ms t H = (M + ms t) c (T – T0)

(5000 kg/h) (th) (2732-105) kJ/kg

= [(40 m3)(1000 kg/m3) + (5000 kg/h)(th)](4.187 kJ/kg.K)(122-25)0K

Tomando el tiempo de calentamiento (th) en hs , tenemos

(5000 th) (2627) kJ = [40000 + 5000 t](4.187)(97)kJ

(5000 th) [2627 – 4.187 x 97] = 40000 x 4.187 x 97

th = 1.463 hs

Por lo tanto, el tiempo de calentamiento del medio será de 1.463 horas.

42
Ejemplo de calentamiento con una fuente de calor
isotérmica:
Un Fermentador con 40 m3 de medio a 25oC va a ser
esterilizado con una fuente de calor isotérmica, que es
vapor saturado a 350 kPa de presión absoluta. El
calentamiento se detiene cuando se alcanzan los 122oC.
Determine el tiempo de calentamiento del medio.
Datos adicionales: La temperatura de vapor saturado a 350 kPa
es de 138.9oC. La capacidad calorífica y la densidad del medio
son 4.187 kJ/kg.0K y 1000 kg/m3, respectivamente. U = 2500
kJ/hr.m2.0K y A = 40 m2

Solución:
Utilizar la ecuación:
T0 - TH
U A t = M c ln ( T - TH )
43
 T0 - TH
U A t = M c ln ( T - TH )
(2500 kJ/h.m2.K) (40 m2) (tc)
= (40 m3) (1000 kg/m3) (4.187 kJ/kg.K) ln[(25-138.9)/(122-138.9)]

Tomando el tiempo de calentamiento (th) en hs, tenemos

(2500 kJ/K) (40) (th) = (40) (1000) (4.187 kJ/K) ln[113.9/16.9]

(2500 kJ/K) (40) (th) = (40) (1000) (4.187 kJ/K) (1.908)

th = 3.1955 hs

Por lo tanto, el tiempo de calentamiento del medio es de 3.1955 horas.

44
Explicar el porque cuando el calentamiento se
hace con una fuente de calor isotérmico se toma
el doble de tiempo que cuando se hace por
calentamiento con vapor directo asperjado,
aunque se utilice la misma cantidad de vapor.

45
Esterilización batch (método de enfriamiento):

Enfriamiento con agua fría

46
Para enfriamiento batch, con un intercambiador de calor
no isotérmico continuo (ej: pasar agua fría a través de una
chaqueta (camisa):
UA mt
T = TC0 + (T0 - TC0) exp{- [1 – exp( )] }
cm M
(13)
T – temperatura final ( en grados kelvin)
T0 – temperatura inicial del medio (en kelvin)
TC0 – temperatura inicial del intercambiador(en kelvin)
U – coeficiente de transferencia de calor
A – area de transferencia de calor
c – calor específico del medio
m – flujo másico del enfriador
M – masa de medio inicial
t – tiempo requerido

47
Ejemplo 3: Estimación del tiempo requerido en una esterilización batch
- La cuenta de bacterias típica en un medio son 5 x 1012 por m3, la
cual será reducida por esterilización de tal manera que tenemos una
probabilidad de supervivencia de 1 en1,000.
- El volumen del medio es de 40 m3 a 25oC. Es esterilizado por
inyección directa de vapor saturado, dentro del fermentador. El
vapor tiene una presión de 345 kPa (absoluta) y es inyectado a un
gasto de 5,000 kg/hr, hasta alcanzar los 122oC.
- El medio se mantiene durante un tiempo a 122oC. La pérdida de
calor durante el sostenimiento es despreciable.
- El medio es enfriado pasando 100 m3/hr de agua a 20oC a través
de un serpentin de enfriamiento hasta que el medio alcanza 30oC. El
área de transferencia de calor del serpentin es de 40 m3, y el U =
2500 kJ/hr.m2.K.
- Para las esporas bacterianas resistentes al calor :
kdo = 5.7 x 1039 por hr Ed = 2.834 x 105 kJ / kmol
- Para el medio: c = 4.187 kJ/kg.K y la ρ = 1000 kg/m3
48
Solución al ejemplo 3:
Enunciado del problema: El conteo bacteriano típico en un
medio es de 5 x 1012 por m3, , que debe reducirse
mediante esterilización de tal manera que la probabilidad
de que un contaminante sobreviva al tratamiento térmico
sea de 1 en 1,000.

n0 = 5 x 1012 por m3 x 40 m3 = 200 x 1012 = 2 x 1014

nt = 1/1000 = 0.001
t

 = ln
n0
nt
= ln
2x1014
0.001
= 39.8 =
0
 kd dt

La integral anterior debe dar 39.8.

49
Solución al ejemplo 3:
El proceso de esterilización implica una etapa de calentamiento
de 25oC a 122oC, una de sostenimiento en 122oC y después
una de enfriamiento hasta alcanzar 30oC . Por lo tanto:
t
 =
0
 kd dt

t1 t2 t3
=

0
kd dt
cal
+
t1
 kd dt
sost
+

t2
kd dt
enf

cal sost enf

50
Solución al ejemplo 3:
El diseño del problema es,

 = cal + sost + enf = 39.8 (14)

Dado que la etapa de sostenimiento tiene lugar en condiciones

isotérmicas,
t2

sost = 
t1
kd dt
sost
= kd (t2-t1)
sost
(15)

 
Para determinar cal y enf, necesitamos tener los
perfiles de temperatura del calentamiento y enfriamiento,
respectivamente.

51
Solución al ejemplo 3:
El calentamiento se lleva a cabo por inyección directa de vapor
saturado dentro del fermentador.

El perfil de temperatura durante el calentamiento con vapor

asperjado esta dado por (10.11):
H ms t
T = T0 +
c (M + ms t)

52
Solución del ejemplo 3:
Datos proporcionados:
T0 = (25 + 273) K = 298 K
c = 4.187 kJ/kg.K
M = 40 x 1000 kg
ms = 5000 kg/hr
H = entalpía de vapor saturado a 345 kPa
- entalpía de agua a 25oC
= 2,731 – 105 kJ/kg = 2626 kJ/kg

Por lo tanto, tenemos

78.4 t
T = 298 +
1 + 0.125 t

53
Solución al ejemplo 3:

Para T = (122 + 273) K = 395 K

78.4 t
395 = 298 +
1 + 0.125 t

t = 1.46 h Es el tiempo requerido para

calentar el medio de 25oC a
122oC.

54
Solución al ejemplo 3:
1.46

cal = 
0
kd dt
calentamiento

Utilizar kd = kdo exp -

( ) Ed
RT

(
= 5.7 x 1039 exp -
2.834 x 105
8.318 x T )
78.4 t
dónde T = 298 +
1 + 0.125 t
55
 1.46

cal =
0
 kd dt
cal
= 14.8 (16)

250 Temperature (deg C)

kd (per hr)
200

150

100

50

0
0 0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5
tiempo (h) 56
Solución al ejemplo 3:
El enfriamiento se lleva a cabo utilizando agua fría transportada
a través de una doble chaqueta ( camisa ).

El perfil de temperatura durante el enfriamiento utilizando un

intercambiador de calor no isotérmico está dado por (10.13)

UA mt
T = TC0 + (T0 - TC0) exp{ [1 – exp( )] }
cm M

57
Solución al ejemplo 3:
Datos :
T0 = (122 + 273) K = 395 K
TC0 = (20 + 273) K = 293 K
U = 2,500 kJ/hr.m2.K
A = 40 m2
c = 4.187 kJ/kg.K
m = 100 x 1000 kg/hr
M = 40 x 1000 kg/hr

Por lo tanto, tenemos

1 t
T = 293 + 102 exp{ [1 – exp( )] }
4.187 0.4

58
Solución al ejemplo 3:
Para T = (30 + 273) K = 303 0K

1 t
393 = 293 + 102 exp{ [1 – exp( )] }
4.187 0.4

t = 3.45 h Es el tiempo requerido para el

enfriamiento de 122oC a 30oC.

59
Solución al ejemplo 3:
t2+3.45

cool = 
t2
kd dt
enfriamiento

kd = kdo exp -
( ) Ed
RT

(
= 5.7 x 1039 exp -
2.834 x 105
8.318 x T )
T = 293 + 102 exp{- 0.674 t}

60
 t2+3.45

enfr. = 
t2
kd dt = 13.9
enfriamiento
(17)

250 Temperature (deg C)

kd (per hr)
200
150
100
50
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
tiempo ( h)
61
Reuniendo los resultados:
1.46 3.45


0
kd dt + kd Δt
calentamiento
+
sostenim.0
 kd dt = 39.8
Enfriam.

cal = 14.8 sost enf = 13.9

hold = kd Δt = 39.8 -14.8 -13.9 = 11.1

sostenimiento

Δt = 11.1 / (kd at 1220C)

62
Reuniendo los resultados:

kd a 1220C

= 5.7 x 1039 exp -( 2.834 x 105

8.318 x T )
T = 395
= 197.6 por hr

Δt = 11.1 / 197.6 = 0.056 hr = 3.37 min

La esterilización se consigue principalmente

durante el calentamiento (14.8 h) y
enfriamiento (13.963h)
Reuniendo los resultados:

250 Temperature (deg C)

kd (per hr)
200

150

100

50

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5
tiempo ( h)

Desventaja: Mayor tiempo de calent. y enfriam. 64

Referencias :

Lee, M. J. (2009 ) Biochemical Engineering.Washington State

University. Pullman, WA.

65