UCV 2018.

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 1. Prepárate para el trabajo de
laboratorio.
Colócate guantes y amárrate el cabello si lo
tienes largo para evitar contaminar la muestra
de bacteria que vayas a analizar.

Desinfecta un espacio de trabajo debajo de la

campana extractora o en otra área bien
ventilada.

Antes de comenzar, revisa que el mechero

Bunsen y el microscopio estén operativos.

Parte1
Preparar el portaobjetos
 2. Esteriliza un portaobjetos de vidrio para
microscopio.
Si el portaobjetos está sucio, lávalo con agua
jabonosa para eliminar la grasa y la suciedad.

Desinféctalo con etanol, limpiador de vidrios o

el método que recomiende tu laboratorio.

Parte1
Preparar el portaobjetos
 3. Coloca la muestra en el portaobjetos.
Puedes usar el método de la tinción de Gram
para ayudar a identificar las bacterias
presentes en muestras médicas o en cultivos
de bacterias en una placa de Petri.

Para que la tinción de Gram sea útil, coloca

una capa delgada de la muestra sobre el
portaobjetos.

Es recomendable una muestra que tenga

menos de 24 horas, ya que las bacterias más
antiguas pueden tener paredes celulares
dañadas que responderán de forma menos
predecible a la tinción de Gram.

Parte1
Preparar el portaobjetos
  Si vas a usar una muestra de tejido, coloca de 1 a 2 gotas de la muestra en el portaobjetos de
vidrio.
 Extiéndela uniformemente sobre el portaobjetos para formar una mancha delgada usando el borde
de un segundo portaobjetos de vidrio esterilizado.
 Deja que se seque con el aire antes de continuar.
 Si vas a tomar bacterias de una placa de Petri, esteriliza un asa bacteriológica en la llama de un
mechero Bunsen hasta que brille, luego deja que se enfríe.
 Úsala para colocar una gota de agua esterilizada sobre el portaobjetos y luego esteriliza y enfría el
asa otra vez antes de transferir una pequeña muestra de bacteria al portaobjetos y revolverla
suavemente en el agua.
 Las bacterias en un medio de cultivo deben mezclarse en un agitador de vórtice y luego colocarse
en el portaobjetos con un asa bacteriológica, como se indica anteriormente, pero sin agregar el
agua adicional.
 Si tienes una muestra en un hisopo, pásalo ligeramente por encima del portaobjetos

Parte1
Preparar el portaobjetos
 4. Fija la muestra por calor.
El calor fijará las bacterias al portaobjetos de
forma que no se enjuaguen tan fácilmente
durante la tinción.
Pasa rápidamente el portaobjetos dos o tres
veces por la llama de un mechero Bunsen o
caliéntalo sobre un calentador de portaobjetos
eléctrico.
No lo sobrecalientes o las muestras podrían
distorsionarse. Si vas a usar un mechero
Bunsen, la llama debe ser un cono pequeño y
azul, no uno alto y anaranjado.
Alternativamente, la muestra puede fijarse con
metanol, agregando 1 o 2 gotas sobre la
mancha seca, drenando el exceso de metanol
y dejando que se seque con el aire.

Este método minimiza el daño a las células

huésped, dándoles un fondo más limpio.
Parte1
Preparar el portaobjetos
 5. Posiciona el portaobjetos en una bandeja
para tinción.
Una bandeja para tinción es una bandeja poco
profunda de metal, vidrio o plástico con una
pequeña malla o soporte de alambre a lo largo
de la parte superior.

Coloca el portaobjetos sobre este soporte de

forma que los líquidos que vayas a usar
puedan drenarse sobre la bandeja.

Si no tienes una bandeja para tinción, el

portaobjetos puede colocarse directamente
sobre una cubeta de plástico para hielo.

Parte1
Preparar el portaobjetos
 1. Empapa la muestra con cristal
violeta.
Usa una pipeta para empapar la muestra de
la bacteria con varias gotas de tinte cristal
violeta, a veces llamado violeta de
genciana.
Espera de 30 a 60 segundos.
En una solución acuosa, el cristal violeta
(CV) se disocia en CV+ e iones de cloruro
(Cl-).
Estos iones penetran a través de la pared
celular y la membrana celular de células
tanto Gram positivas como Gram negativas.
El ion CV+ interactúa con los componentes
con carga negativa de las células
bacterianas para mancharlas de violeta.

Muchos laboratorios usan el cristal violeta

de "Hucker", el cual agrega oxalato de
amonio para evitar la precipitación.
Parte2
Realizar la tinción de Gram
 2. Enjuaga suavemente el cristal violeta.
Inclina el portaobjetos y usa un matraz de
lavado para rociar un pequeño chorro de agua
destilada o de grifo sobre la parte superior del
portaobjetos.

El agua debería escurrirse sobre la superficie de

la mancha pero no estar apuntada
directamente a ella.

No enjuagues excesivamente, lo cual puede

quitar la tinción de las bacterias Gram
positivas.

Parte2
Realizar la tinción de Gram
 3. Empapa la mancha con yodo y luego
enjuaga. Usa una pipeta para cubrir la
mancha con yodo. Déjala reposar por lo
menos por 60 segundos, luego enjuágala
cuidadosamente con el mismo método.
El yodo, en la forma de iones con carga
negativa, interactúa con los iones CV+ para
formar grandes compuestos de cristal violeta
y yodo (compuestos CV-I) dentro de las capas
interiores y exteriores de la célula.
Esto atrapa el color del cristal violeta en la
célula, en el lugar en el que la haya teñido.

El yodo es corrosivo. Evita su inhalación,

ingestión o contacto con la piel.

Parte2
Realizar la tinción de Gram
 4. Agrega un decolorante y luego enjuaga
rápidamente. Para este paso crítico, se usa
normalmente una mezcla de acetona y etanol
en una proporción de 1:1. La realización de
este paso debe calcularse cuidadosamente.
Sujeta el portaobjetos en ángulo, luego
agrega el decolorante hasta que nada del
color violeta sea visible en la escorrentía.
Esto normalmente toma menos de 10
segundos o incluso menos tiempo si el
decolorante contiene una alta concentración
de acetona. Detente inmediatamente o el
decolorante retirará la tinción de cristal violeta
de células tanto Gram positivas como Gram
negativas y la tinción tendrá que repetirse.
Parte2 Enjuaga inmediatamente el exceso de
Realizar la tinción de Gram decolorante usando la técnica mencionada
anteriormente
Puede usarse acetona pura (95%+) en su lugar. Mientras más acetona haya, el decolorante trabajará más
rápido, lo que requerirá un cálculo más preciso del tiempo.
•Si estás teniendo problemas para calcular la realización de este paso, considera agregar el decolorante gota
a gota.
 5. Empapa la mancha con un colorante
secundario y luego enjuaga.
Se usa un colorante secundario, normalmente
safranina o fucsina, para agregar un contraste
adicional entre las bacterias Gram positivas y
Gram negativas, tiñendo las bacterias
decoloradas (Gram negativas) de rosado o
rojo.
Deja el colorante en la muestra por lo menos
por 45 segundos, luego enjuágalo.
La fucsina teñirá muchas bacterias Gram
negativas de forma más intensa, como las
especies Haemophilus y Legionella.
Esto puede convertirla en una mejor opción
para principiantes.

Parte2
Realizar la tinción de Gram
 6. Seca el portaobjetos.
Puedes dejar que el portaobjetos se seque
con el aire o secarlo usando papel
absorbente que se venda para este
propósito.
La tinción de Gram está terminada.

Parte2
Realizar la tinción de Gram
 1. Prepara el microscopio óptico.
Coloca el portaobjetos bajo el microscopio
óptico.
Las bacterias varían en gran medida en tamaño,
así que la magnificación total requerida variará
de 400x a 1000x.
En el extremo más alto de estas
magnificaciones, se recomienda usar una lente
objetiva con aceite de inmersión para una mayor
claridad.
Coloca una gota de aceite de inmersión en el
portaobjetos, evitando el movimiento durante la
aplicación para evitar las burbujas.
Mueve el revólver del microscopio de forma que
la lente objetiva se posicione en su lugar con un
clic, tocando el aceite.
El aceite de inmersión solo puede usarse en
lentes diseñadas especialmente, no en una
lente "seca".

Examinar el resultado
 2. Identifica las bacterias Gram positivas y
Gram negativas.
Examina el portaobjetos bajo el microscopio
óptico.

Las bacterias Gram positivas se verán violetas

debido al cristal violeta atrapado en sus gruesas
paredes celulares.
Las bacterias Gram negativas se verán rosadas o
rojas, ya que el violeta se enjuagó a través de
las delgadas paredes celulares y luego ingresó a
ellas el colorante secundario rosado.

 Si la muestra es demasiado gruesa, puedes obtener falsos positivos. Tiñe una nueva muestra si todos tus
resultados son Gram positivos, para asegurarte de que el resultado sea correcto.
 Si el decolorante se escurrió por mucho tiempo, puedes obtener falsos negativos. Tiñe una nueva muestra si
todos tus resultados son Gram negativos para revisar los resultados dos veces.
 3. Identifica bacterias Gram positivas por su
forma.
Las bacterias se clasifican más a fondo por su
forma bajo el microscopio, más comúnmente
como cocos (esféricas) o varas (cilíndricas).

Estas son algunas bacterias Gram positivas

(teñidas de violeta) comunes clasificadas por
forma:

 Los cocos Gram positivos generalmente son ya sea estafilococos (que significa cocos en grupos) o
estreptococos (que significa cocos en cadenas).
 Las varas Gram positivas incluyen los bacilos y las bacterias Clostridium, Corynebacterium y Listeria. Las
varas de la especie Actinomyces a menudo tienen ramas o filamentos.
 4. Identifica bacterias Gram negativas.
Las bacterias Gram negativas (teñidas de
rosado) a menudo se clasifican en tres grupos.

Los cocos son las bacterias esféricas, las varas

son las bacterias largas y delgadas, y las varas
cocoides están en un punto intermedio.

 Los cocos Gram negativos son más comúnmente la especie Neisseria.

 Las varas Gram negativas incluyen las bacterias E.
coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Serratia, Proteus, Salmonella, Shigella, Pseudomonas y muchas
otras. La bacteria Vibrio cholerae puede aparecer como varas normales o varas curvas.
 Las varas Gram negativas "cocoides" (o "cocobacilos") incluyen
la Bordetella, Brucella, Haemophilus y Pasteurella.
 5. Evalúa los resultados mixtos.
Algunas bacterias son difíciles de teñir con
precisión debido a la fragilidad de sus paredes
celulares o a cuán cerosas sean. Pueden tener
una mezcla de una tinción violeta o rosada en
la misma célula o entre diferentes células en la
misma muestra.
Cualquier muestra de bacteria que tenga más
de 24 horas puede tener este problema, pero
algunas especies son difíciles de teñir a
cualquier edad.

Pueden requerir pruebas más especializadas

para reducir el número de posibilidades para
su identificación, como la tinción de Ziehl-
Neelsen, la observación del crecimiento de
cultivos, el agar TSI o pruebas genéticas.

 Las especies Actinomyces, Arthobacter, Corynebacterium, Mycobacterium y Propionibacterium se

consideran bacterias Gram positivas, pero a menudo aparecen teñidas de forma no concluyente.
 Las bacterias pequeñas y delgadas, como las especies Treponema, Chlamydia y Rickettsia, son difíciles de
teñir correctamente.
6. Desecha los materiales.
Los procedimientos para la eliminación de
desechos varían entre laboratorios y según
los materiales usados.

Normalmente, el líquido en la bandeja para

tinción se desecha como residuo peligroso
en botellas selladas.

Sumerge los portaobjetos en una solución

con un 10% de lejía y luego deséchalos en
recipientes para instrumentos afilados.
Consejos

•Recuerda que el rendimiento de la tinción de Gram es solo tan bueno como el espécimen. Es
importante enseñar a los pacientes a proporcionar buenos especímenes (por ejemplo, enseñarles la
diferencia entre un escupitajo y una tos profunda para muestras de esputo).

•Como decolorante, el etanol actúa con más lentitud que la acetona.

•Sigue las precauciones estándar para el laboratorio.

•Usa un frotis bucal para practicar, ya que la muestra debe contener bacterias tanto Gram positivas
como Gram negativas. Si solo ves uno u otro tipo de bacteria, es probable que hayas usado muy poco o
demasiado decolorante.

•Puedes usar una pinza para ropa de madera con resortes para sujetar el portaobjetos.