Sunteți pe pagina 1din 41

Electroforeza proteinelor serice

Introducere
• EPS este o analiza ce se realizeaza pentru a
identifica pacientii cu mielom multiplu si alte
patologii corelate de modificari ale proteinelor
serice
• Principiul de baza consta in separarea
proteinelor datorita proprietatilor lor fizice
Introducere
• Proteinele plasmatice demonstreaza modificari caracteristice in raspunsul
inflamator, stare maligna, trauma, necroza, infarct, arsura sau injurie chimia
• O crestere de tip peak omogena in regiunea focala a gama-globulinelor indica o
gamapatie monoclonala
• Gamapatiile monoclonare se asociaza cu procese maligne sau cu potential malign
incluzand mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenstrom, plasmocitomul
solitar, amiloidoza, gamapatia monoclonala de importanta nedeterminata
• Serul este pozitionat pe un mediu specific si apoi o sarcina electrica este aplicata
• Electroforeza este o metoda analitica si preparativa de separare a particulelor/
ansamblurilor de particule incarcate electric sub actiunea unui camp electric
uniform, aplicat din exterior
• Metoda are la baza fenomenul fizic de orientare si migrare diferentiata a
particulelor, catre polii de semne opuse ale sursei de curent continuu
• Dupa modul de realizare, electroforeza poate fi:
– In mediu liber
– Intr-un mediu fixat zonala)
– Continua sau discontinua
Introducere
• In electroforeza sunt posibile separari ale
componentelor unui amestec in absenta unei
repartitii diferite intre faze
• Electroforeza zonala se desfasoara in medii
heterogene, depuse pe suporturi solide
• Masele moleculare ale sistemelor supuse analizei
sunt variabile, iar cantitatile de proba luate in lucru
sunt foarte mici, acestea reprezentand avantaje ale
electroforezei zonale tinand cont de diversitatea
moleculelor prezente in lichidele biologice, dar si de
dificultatile de recoltare ale acestora in cantitati mari
Introducere
• Suportul utilizat pentru stabilirea zonelor trebuie sa posede
proprietati mecanice favorabile manipularii: sa fie stabile fizic
si chimic, sa fie accesibil si netoxic
• Se pot utiliza:
– Hartia de filtru de calitate cromatografica
– Membrane de acetat de celuloza
– Silicagel
– Agar
– Amidon
– Alcoolul polivinilic
– poliacrilamida
Introducere
• Schema de principiu a unui aparat de electroforeza zonala:
– Aparat sub forma de caseta cu 2 santuri laterlae
despartite, care au rolul de rezervor de electrolit
– In acestea se imerseaza cate un electrod al sursei de curent
continuu si cate un capat al suportului
– Dupa efectuarea electromigrarii si separarea
componentelor amestecului, suportul se trateaza cu
reactivi specifici de vizualizare ( etapa de colorare)
– Densitatile proteinelor sunt calculate electronic pentru a
aduce date despre valorile absolute si relative ale
diferitelor tipuri de proteine ( densitometrie)
Metoda de lucru
• Vizeaza migrarea in camp electric continuu a
particulelor incarcate electric fara a se descarca
la nivelul electrozilor
• Mod de lucru:
• Se degreseaza cu metanol lamele de sticla
• Se decupeaza hartia de filtru de dimensiunile
placutei: 2.5-7.5cm
• Se realizeaza o solutie de agar 1% in sistem
tampon barbital: agar polizaharid capabil sa
formeze legaturi de hidrogen
Metoda de lucru
• Se depun 4-4.5ml de gel fierbinte pe suport,
se lasa sa se raceasca si se introduc placutele
in camera de electroforeza
• Se realizeaza contanctul intre solutia tampon
si placuta cu ajutorul unor hartii de filtru
• Pe centrul placutei se adauga o hartie de filtru
de 15-25 mm umezita in serul de cercetat
• Electromigrarea: se inchide circuitul extern
reglandu-se intensitatea la 4-4,5mA/lama
Metoda de lucru
• Procesul dureaza 3 ore
• Observatie: pentru vizualizarea migrarii pe linia
de start se adauga o picatura de solutie de
albastru de brom fenal colorant ce are o viteza
aproximativ egala cu cea a albuminelor

• Factori ce influenteaza viteza de migrare:


– Particulele: masa, dimensiunea acestora, incarcarea
electrica
– ! In conditii de pH 8,6 toate proteinele sunt incarcate
negativ si vor migra catre (+) datorita impuritatilor
Metoda de lucru
– Factori ce influenteaza viteza de migrare:

– Gelul : gelul de agar prezinta impuritati, ce in


deplasarea lor antreneaza si sistemul tampon
– Conditii exterioare: curentul electric continuu:
intensitatea reglata la 4-4.5 mA/lama; mentinerea
constanta a temperaturii; timpul de migrare se
realizeaza in functie de colorantul specific
Metoda de lucru
• Cand colorantul ajunge spre marginea placutei se
opreste experimentul

• Etapa de fixare:
Fixarea presupune scoaterea placutelor si
introducerea in bai care contin solutie de fixare ( solutie
de acid acetic plus metanol); procesul dureaza 3 ore
Metoda de lucru
• Etapa de spalare:
• solutia diluata de acid acetic in bai de spalare: 3
spalari timp de 10 minute
• Etapa de colorarea
• cu solutie de albastru de brom fenol timp de 3 ore
• Etapa de spalare:
• de 3 ori timp de 10 minute in solutia diluata de acid
acetic; se obtine o coloratie bruna neconvenabila
• Virajul de culoare:
• se realizeaza cu o solutie de acid acetic si acetat de
sodiu astfel incat culoare se schimba in albastru verzui
Metoda de lucru
• Etapa de spalare:
• Se spala de trei ori timp de 10 minute
• Etapa de uscare:
• prin incalzire la 80-90 grade C in etuve,
• prin tamponare succesiva cu hartie de filtru
• Analiza este:
• calitativa: cu (+) in sus
• cantitativa: direct pe placuta, fara hartie: Se adauga peste fiecare fractie proteica 3
mL de NaOH 4% deoarece colorantul de pe hartie este solubil in mediu bazic
• Dupa 20 de minute fiecare soluie se analizeaza spectral determinand extinctia fata de apa distilata
• Ea+Eα+Eβ+Eγ……………..100%
• Ea………………………………….x%
Concluzii
Concluzii
Concluzii
Concluzii
Erori posibile
Rezultate
Rezultate
Evaluarea fractiilor proteice
obtinute
• Rezultatul EPS se prezinta sub forma a 2 tipuri
majore de proteine: albumine si globuline

• Albumina este proteina ce se regasete


majoritar in ser, produsa in ficat

• Globulinele reprezinta o fractie mult mai mica


a proteinelor serice
Evaluarea fractiilor proteice
obtinute
Evaluarea fractiilor proteice
obtinute
• Hipoalbuminemia
– Hemodilutie
– Raspuns de faza acuta
– Sinteza scazuta
– Sarcina
– Boala cronica consumptiva
– Malnutritie
– Boala hepatica
– Terapie hormonala
– Arsuri

• Hiperalbuminemia
– Apare in stari de scadere a
continutului de apa
precum deshidratarea
Evaluarea fractiilor proteice
obtinute
• Fractiunea alfa: contine antitripsina, globulina de legare a
tiroxinei si transcortina
– este crescuta in stari maligne si in raspunsul de faza acuta
• Fractiunea beta: prezinta 2 peak-uri: beta 1 si beta 2
– contine in principal transferina, betalipoproteine
– uneori Ig M, Ig A si Ig G se pot identifica in fractiunea beta
• Fractiunea gama: mult din interesul clinic este concentrat
asupra fractiei gama deoarece imunoglobulinele prezinta
migratie marcata catre aceasta zona
– proteina C reactica se situeaza intre fractiunea beta si gama
Indicatii pentru realizarea EPS
Cazuri particulare 1
Cazuri particulare 2
Cazuri particulare 3
Imunoelectroforeza

-anticoprii sunt produsi de sistemul imun ca raspuns la macromoleculele straine


organismului
-fiecare anticorp se leaga specific la un epitop specific al unui antigen
-aceasta caracteristica ne permite utilizarea anticorpilor pentru detechie si analiza
cantitativa a proteinelor specifice dintr-un complex
- atunci cand un potential electric este aplicat pentru a studia reactia Ac-Ag procesul
poarta denumirea de imunoelectroforeza
- Ac-ii sunt separati electroforetic si Ag-ele difuzeaza unele catre altele rezultand
arcuri de precipitare acolo unde se formeaza complexe Ag-Ac => imunoelectroforeza
- metoda este utilizata pentru detectia de Ac
- utilizata preponderent pentru detectia serica a IgG, IgM si IgA
Imunoelectroforeza
• Se toarna agar pe o placuta, se raceste si apoi se
realizeaza doua godeuri intre care se realizeaza
un sant paralel cu directia campului electric
• Se scoate gelul din godeuri si se introduc 40 mL
proba
• Lamele se introduc in camera de electroforeza la
o intensitate de 4-4,5 mA/lama si se realizeaza o
migrara electroforetica timp de 3 ore
• Se introduce o picatura de albastru de brom fenol
in godeu
• Nu se realizeaza fixarea
• In etapa a doua se realizeaza o imunodifuzia
dubla conform gradientului de concentratie
• Albuminele si alfa globulinele migreaza in
toate directiile in timp ce beta si gama
globunilele se excaveaza in gelul din regiunea
centrala
• Se introduc apoi anticorpii
• vor aparea linii de precipitare acolo unde
exista reactie specifica Ag-Ac
• in timpul electroforezei:
– moleculele plasate in curent electric capata
incarcare electrica si se misca catre electrodul
specific
– mobilitatea moleculelor este dependenta de o
serie de factori precum marimea moleculei de
separat, concentratia gelului de agar si voltajul
aplicat
• in timpul imunodifuziei:
– antigenele transportate conform electroforezei
sunt subiectul unei imunodifuzii cu antiserul
adaugat in godeul din agar
– complexul Ag-Ac se prezinta sub forma unui
precipitat de culoare alba: arc de cerc semiopac in
gel
Concluzii- imunoelectroforeza
Concluzii- imunoelectroforeza
Rol imunoelectroforeza
• Imunoelectroforeza este o tehnică analitică puternică, cu putere de
rezoluție ridicată, deoarece combină separarea antigenelor prin
electroforeză cu imunodifuzia împotriva unui antiser.
• Rezoluția crescută este benefică în examinarea imunologică a
proteinelor serice. Imunoelectroforeza ajută la diagnosticarea și
evaluarea răspunsului terapeutic în multe stări de boală care
afectează sistemul imunitar.
• De obicei, este solicitat atunci când EPS a indicat o creștere la
nivelul imunoglobulinelor.
• Imunoelectroforeza este, de asemenea, utilizată frecvent pentru a
diagnostica mielomul multiplu, o boală care afectează măduva
osoasă
Precautii- imunoelectroforeza
• Medicamentele care pot determina creșterea concentrațiilor de
imunoglobuline include: gamma globulină terapeutică, hidralazină,
izoniazid, fenitoină (Dilantină), procainamidă, contraceptive orale,
metadonă, steroizi și toxoid tetanic și antitoxină.

• Laboratorul trebuie notificat dacă pacientul a primit vaccinări sau


imunizări în cele șase luni înainte de test. Acest lucru se datorează în
principal faptului că imunizările anterioare conduc la creșterea nivelului
imunoglobulinelor, rezultând rezultate fals pozitive.

• Trebuie remarcat faptul că, deoarece imunoelectroforeza nu este


cantitativă, ea este înlocuită de o procedură numită imunofixare, care este
mai sensibilă și mai ușor de interpretat.