Explorați Cărți electronice
Categorii
Explorați Cărți audio
Categorii
Explorați Reviste
Categorii
Explorați Documente
Categorii
Introducere
• EPS este o analiza ce se realizeaza pentru a
identifica pacientii cu mielom multiplu si alte
patologii corelate de modificari ale proteinelor
serice
• Principiul de baza consta in separarea
proteinelor datorita proprietatilor lor fizice
Introducere
• Proteinele plasmatice demonstreaza modificari caracteristice in raspunsul
inflamator, stare maligna, trauma, necroza, infarct, arsura sau injurie chimia
• O crestere de tip peak omogena in regiunea focala a gama-globulinelor indica o
gamapatie monoclonala
• Gamapatiile monoclonare se asociaza cu procese maligne sau cu potential malign
incluzand mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenstrom, plasmocitomul
solitar, amiloidoza, gamapatia monoclonala de importanta nedeterminata
• Serul este pozitionat pe un mediu specific si apoi o sarcina electrica este aplicata
• Electroforeza este o metoda analitica si preparativa de separare a particulelor/
ansamblurilor de particule incarcate electric sub actiunea unui camp electric
uniform, aplicat din exterior
• Metoda are la baza fenomenul fizic de orientare si migrare diferentiata a
particulelor, catre polii de semne opuse ale sursei de curent continuu
• Dupa modul de realizare, electroforeza poate fi:
– In mediu liber
– Intr-un mediu fixat zonala)
– Continua sau discontinua
Introducere
• In electroforeza sunt posibile separari ale
componentelor unui amestec in absenta unei
repartitii diferite intre faze
• Electroforeza zonala se desfasoara in medii
heterogene, depuse pe suporturi solide
• Masele moleculare ale sistemelor supuse analizei
sunt variabile, iar cantitatile de proba luate in lucru
sunt foarte mici, acestea reprezentand avantaje ale
electroforezei zonale tinand cont de diversitatea
moleculelor prezente in lichidele biologice, dar si de
dificultatile de recoltare ale acestora in cantitati mari
Introducere
• Suportul utilizat pentru stabilirea zonelor trebuie sa posede
proprietati mecanice favorabile manipularii: sa fie stabile fizic
si chimic, sa fie accesibil si netoxic
• Se pot utiliza:
– Hartia de filtru de calitate cromatografica
– Membrane de acetat de celuloza
– Silicagel
– Agar
– Amidon
– Alcoolul polivinilic
– poliacrilamida
Introducere
• Schema de principiu a unui aparat de electroforeza zonala:
– Aparat sub forma de caseta cu 2 santuri laterlae
despartite, care au rolul de rezervor de electrolit
– In acestea se imerseaza cate un electrod al sursei de curent
continuu si cate un capat al suportului
– Dupa efectuarea electromigrarii si separarea
componentelor amestecului, suportul se trateaza cu
reactivi specifici de vizualizare ( etapa de colorare)
– Densitatile proteinelor sunt calculate electronic pentru a
aduce date despre valorile absolute si relative ale
diferitelor tipuri de proteine ( densitometrie)
Metoda de lucru
• Vizeaza migrarea in camp electric continuu a
particulelor incarcate electric fara a se descarca
la nivelul electrozilor
• Mod de lucru:
• Se degreseaza cu metanol lamele de sticla
• Se decupeaza hartia de filtru de dimensiunile
placutei: 2.5-7.5cm
• Se realizeaza o solutie de agar 1% in sistem
tampon barbital: agar polizaharid capabil sa
formeze legaturi de hidrogen
Metoda de lucru
• Se depun 4-4.5ml de gel fierbinte pe suport,
se lasa sa se raceasca si se introduc placutele
in camera de electroforeza
• Se realizeaza contanctul intre solutia tampon
si placuta cu ajutorul unor hartii de filtru
• Pe centrul placutei se adauga o hartie de filtru
de 15-25 mm umezita in serul de cercetat
• Electromigrarea: se inchide circuitul extern
reglandu-se intensitatea la 4-4,5mA/lama
Metoda de lucru
• Procesul dureaza 3 ore
• Observatie: pentru vizualizarea migrarii pe linia
de start se adauga o picatura de solutie de
albastru de brom fenal colorant ce are o viteza
aproximativ egala cu cea a albuminelor
• Etapa de fixare:
Fixarea presupune scoaterea placutelor si
introducerea in bai care contin solutie de fixare ( solutie
de acid acetic plus metanol); procesul dureaza 3 ore
Metoda de lucru
• Etapa de spalare:
• solutia diluata de acid acetic in bai de spalare: 3
spalari timp de 10 minute
• Etapa de colorarea
• cu solutie de albastru de brom fenol timp de 3 ore
• Etapa de spalare:
• de 3 ori timp de 10 minute in solutia diluata de acid
acetic; se obtine o coloratie bruna neconvenabila
• Virajul de culoare:
• se realizeaza cu o solutie de acid acetic si acetat de
sodiu astfel incat culoare se schimba in albastru verzui
Metoda de lucru
• Etapa de spalare:
• Se spala de trei ori timp de 10 minute
• Etapa de uscare:
• prin incalzire la 80-90 grade C in etuve,
• prin tamponare succesiva cu hartie de filtru
• Analiza este:
• calitativa: cu (+) in sus
• cantitativa: direct pe placuta, fara hartie: Se adauga peste fiecare fractie proteica 3
mL de NaOH 4% deoarece colorantul de pe hartie este solubil in mediu bazic
• Dupa 20 de minute fiecare soluie se analizeaza spectral determinand extinctia fata de apa distilata
• Ea+Eα+Eβ+Eγ……………..100%
• Ea………………………………….x%
Concluzii
Concluzii
Concluzii
Concluzii
Erori posibile
Rezultate
Rezultate
Evaluarea fractiilor proteice
obtinute
• Rezultatul EPS se prezinta sub forma a 2 tipuri
majore de proteine: albumine si globuline
• Hiperalbuminemia
– Apare in stari de scadere a
continutului de apa
precum deshidratarea
Evaluarea fractiilor proteice
obtinute
• Fractiunea alfa: contine antitripsina, globulina de legare a
tiroxinei si transcortina
– este crescuta in stari maligne si in raspunsul de faza acuta
• Fractiunea beta: prezinta 2 peak-uri: beta 1 si beta 2
– contine in principal transferina, betalipoproteine
– uneori Ig M, Ig A si Ig G se pot identifica in fractiunea beta
• Fractiunea gama: mult din interesul clinic este concentrat
asupra fractiei gama deoarece imunoglobulinele prezinta
migratie marcata catre aceasta zona
– proteina C reactica se situeaza intre fractiunea beta si gama
Indicatii pentru realizarea EPS
Cazuri particulare 1
Cazuri particulare 2
Cazuri particulare 3
Imunoelectroforeza