Universidad del Valle

Diplomado en Inmunología Celular y Molecular

Producción de anticuerpos
recombinantes utilizando bacteriófagos
Elaborado por:
Dra. Peralta Sánchez Cecilia
Dra. Pinto Zarco Sonia
Dra. Quispe Rocha Grecia

Docente:
Dra. Natalia Nuñez del Prado

La Paz – Bolivia
2018
European Journal of Microbiology and Immunology 4 (2014) 2,
pp. 91–98 DOI: 10.1556/EuJMI.4.2014.2.1

PRODUCTION OF RECOMBINANT ANTIBODIES USING

BACTERIOPHAGES
A. M. Shukra*, N. V. Sridevi*, Dev Chandran and Kapil
Maithal**
Indian Immunologicals Limited, Rakshapuram, Gachibowli,
Hyderabad, Andhra Pradesh, India
Received: November 26, 2013; Accepted: April 10, 2014

ARTICULO DE REVISION
Formado:4 cadenas, 2 ligeras y 2
pesadas, cada una de ellas
idéntica, unidas por puentes
disulfuro que forman una
estructura espacial similar a una
Y. Los anticuerpos tienen 2
funciones fundamentales, de
reconocimiento y unión a
antígenos, que llevan a cabo
mediante los extremos
aminoterminales de las cadenas,
RVCH y RVCL hay 3 segmentos
hipervariables de 10 AA
yuxtapuestos que forman el sitio
de unión al antígeno,
ANTICUERPOS MONOCLONALES
• En 1975 Kolher y Milstein fueron los primeros en
obtener anticuerpos con una sola especificidad
HISTORIA promedio de una celula hibrida generada de forma in
vitro. Premio Nobel de la medicina 1984.

• Derivan de un solo clon de cel linfocitos B son

DEFINICION específicos para un epitope determinado,
constituyendo una población homogénea

• La expresión de estos anticuerpos es una herramienta

muy importante en el desarrollo tratamiento :de Ac
APLICACION terapéuticos y profilácticos, inmunodiagnostico:
identificaciones de marcadores fenotípicos,
OBTENCION DE ANTICUERPOS
MONOCLONALES
 Proceden de los ratones Se obtiene, RV del raton 90% Ac de origen Totalidad de Ac de origen
genera apartar de con las RC de los Ac humano y 10%de la region humano
inmunización de los animales humanos CDR proceden del raton Rechazo S.I. es inexistente
 Anticuerpos recombinantes
• Están formados por fragmentos de anticuerpos en ausencia de
inmunización de animales, donde se manipulan, producen
DEFINICION ,identifican y se conjugan los fragmentos recombinantes dando
lugar a otros anticuerpos multivalentes y multiespecificos

CLASIFICACION • Fab, scFv, diacuerpos, triacuerpos, y minicuerpos

• Uso terapéutico,paara diferentes tipos de cancer, leucemias,

APLICACION adenocarcinomas,tumores melanomas
 TIPOS DE ANTICUERPOS
RECOMBINANTES

scFv-monovalente • Contiene un Paratope funcional, están unidos por un pequeño peptido flexible(15 residuos de
AA),entre la cadena N-terminal de VH y con la N-termnal de la VL, monoclonacidad

Divalentes-dimero • Contiene dos Paratope funcional, estan unidos por un pequeño peptido flexible(5 residuos de
AA),entre la cadena N-terminal de VH y con la N-termnal de la VL, diclonacidad

Trivalente-trimero • Contiene dos Paratope funcional, estan unidos por un pequeño peptido flexible(3 residuos de
AA),entre la cadena N-terminal de VH y con la N-termnal de la VL, triclonacidad
 BACTERIOFAGOS
gos contiene 11genes que codifica a las proteinas III y VIII, nos permite
xpresar proteínas recombinantes de interés

Se empleo fagos filamentosos de Escherichia coli que se utilizo como

vehiculo para expresar diversas proteínas o péptidos

Esta es una herramienta poderosa para identificar y caracterizar

interacciones polipeptidicas recombinantes con sus blancos de uniónes,
su aplicación es de uso terapéutico como anticuerpos bloqueadores.
Bibliotecas de anticuerpos
 Las bibliotecas son principalmente de cuatro tipos e incluyen

(a) bibliotecas de anticuerpos simples

(b) bibliotecas de anticuerpos inmunizados
(c) bibliotecas de anticuerpos sintéticos
(d) bibliotecas de anticuerpos recombinados in vivo
Bibliotecas de anticuerpos naive
 La información genómica que codifica los dominios variables
de anticuerpos se deriva generalmente de células B de
donantes "inocentes" (no inmunizados).

 Mientras que las bibliotecas nativas tienen la ventaja de que

teóricamente pueden usarse para diferentes antígenos.
 La construcción de estas bibliotecas implica técnicas de
biología molecular relativamente sencillas como la
transcripción inversa de ARNm seguido de PCR con
cebadores específicos de la línea germinal para amplificar los
segmentos del gen VH y VL del molde de ADNc y la
clonación basada en la restricción para incorporar los
segmentos de anticuerpos reorganizados en un vector de
presentación del fago apropiado.
Bibliotecas de anticuerpos
inmunizados
 Las bibliotecas de anticuerpos inmunizados se construyen a
partir de cadenas pesadas y ligeras de genes de anticuerpos de
células B que se derivan de varios tipos de animales
inmunizados como ratones, ovejas, camellos y también de
humanos.
 Los anticuerpos derivados de bibliotecas inmunes están
predispuestos hacia un antígeno diana particular que se ha
usado para la inmunización. Aunque se pueden obtener
anticuerpos específicos y de alta afinidad como resultado de
la maduración de afinidad in vivo por el sistema inmune del
huésped, se deben construir nuevas bibliotecas de
anticuerpos para cada antígeno individual, lo que lo convierte
en un proceso muy laborioso.
Bibliotecas de anticuerpos sintéticos
 La construcción de bibliotecas sintéticas implica reorganizar
segmentos de genes VH y VL in vitro e introducir una región
determinante de complementariedad artificial (CDR) de
longitudes de bucle variables usando PCR y cebadores de
oligonucleótidos aleatorizados. Uno de los primeros
repertorios sintéticos utilizó un repertorio diverso de
segmentos de genes VH humanos emparejados con una
región constante de cadena ligera.
 Las bibliotecas sintéticas contienen secuencias artificiales de
CDR. Algunos de los repertorios sintéticos recientemente
construidos han optado por restringir el número de marcos
utilizados. La biblioteca HuCAL es una biblioteca de
anticuerpos completamente sintética que produce
anticuerpos con afinidades nanomolares para varios antígenos
e incluyen factor estimulante de colonias de granulocitos
macrófagos, receptores tirosina quinasas, moléculas del
complejo principal de histocompatibilidad (MHC), citocinas
y proteasas, etc.
Bibliotecas de anticuerpos
recombinados in vivo
 Para eludir los límites anteriores impuestos por la etapa de
transformación, se han construido algunas bibliotecas usando
recombinación in vivo o infección combinatoria para generar
repertorios altamente diversificados de fragmentos de
anticuerpos sintéticos o ingenuos. Se construyó una
biblioteca de Fab sintética usando dos vectores, cada uno con
un marcador seleccionable de antibiótico diferente.
Ventajas de la producción de
anticuerpos en fagos
 Los anticuerpos recombinantes son idénticos a los
anticuerpos monoclonales tradicionales en su
funcionalidad básica.
 Se pueden fabricar utilizando procesos completamente in vitro ,
ofreciendo mayor flexibilidad durante su producción y mayores
oportunidades de optimización después de su creación que los
típicos anticuerpos monoclonales, ya que este tipo de tecnologías
también facilita la producción, cribado y maduración de
aglutinantes seleccionados, permitiendo la selección en
conformaciones y formatos objetivo que no son posibles
por rutas más tradicionales basadas en la inmunización.
Anticuerpos como reactivos
terapéuticos
 El primer anticuerpo monoclonal murino terapéutico
aprobado se lanzó en el año 1986 con el nombre comercial
Orthoclone OKT3®, que se utiliza durante los trasplantes de
órganos.
 Siguieron varios otros anticuerpos, algunos de los cuales eran
quiméricos en los que los dominios constantes de un
anticuerpo eran humanos y los dominios variables eran
murinos con los nombres comerciales Remicade® y
Erbitux®, que se usan para el tratamiento de la artritis
reumatoide y el cáncer colorrectal, respectivamente.
 Más tarde, los anticuerpos se humanizaron por completo,
como en el caso de Herceptin®, que se usa para el
tratamiento del cáncer de mama. En 2002, el primer
anticuerpo completamente humano bajo el nombre
comercial Humira® se ha aislado usando la presentación del
fago de anticuerpos que se dirige contra el TNF-α
ANTICUERPOS COMO REACTIVOS DE
DIAGNÓSTICO

Diversos ensayos

Grandes cantidades
VENTAJAS
de bacterias
ANTICUERPOS
RECOMBINANTES
Económicas
ANTICUERPOS
MONOCLONALES
Rvo inmunológico
FRAGMENTO VARIABLE DE UNA SOLA
CADENA (scFv)
Fusión de regiones VH y VL

Mantiene la especificidad de una

Ig completa a pesar de la
eliminación de las regiones ctes.

Creadas para facilitar la

confección LIBRERIAS DE
EXPRESIÓN EN FAGO.
 Anticuerpos utilizados:

Ensayo de competición
Forma inversa en donde Ag son detectados
Detección de Ag usando
detección de Ac en suero por Ac séricos, compiten
Ac
usando Ag con una preparación de
Ac definidos.
 ELISA DE DETECCIÓN
/CUANTIFICACION DE DIVERSOS AG
VIRALES UTILIZANDO AC
RECOMBINATES

Glicoproteína
Virus de la
Desarrollaron un del virus de la
Hepatitis A
formato ELISA para la rabia
detección y
cuantificación de varios
Ag virales, utilizando Detección del
Ac. Recombinantes:
Ig A bovina IFN-gamma
humano
 DESARROLLO DE UN ENSAYO PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE LA
GLICOPROTEÍNA DE LA RABIA
La glicoproteína del virus rábico es la única
proteína viral expuesta, encontrándose inserta
en la envoltura lipídica.

Principal antígeno inductor de la respuesta

inmune protectora siendo utilizado en vacunas
recombinantes comerciales

Es la principal responsable de la patogenicidad

viral.

Responsable de la inducción de anticuerpos

neutralizantes (los que neutralizan la infección in
vitro y protegen contra la infección
experimental).
Fabricantes de la Utilizando Consume tiempo.
vacuna determinan PRUEBA DE Costosa.
la potencia de ésta PROTECCIÓN
DEL RATON IN Gran número de
VIVO ratones.
Gran número de
virus virulento.
 DESARROLLO DE UN ENSAYO PARA LA
CUANTIFICACIÓN DE LA
GLICOPROTEÍNA DE LA RABIA

Desarrollado
métodos in vitro:
ELISA utilizando scFv Sensibilidad: 31,25 Simple, novedosa,
se purifico ng/ml de RV GP eficiente,
Inmunocromatografía cuantificación sin
de Afinidad de metal Especificidad: No pérdida de Ag, reduce
en una columna reactivo frebte otro costo…VACUNA DE
agarosa de níquel- Ag virales humanos. BUENA CALIDAD.
ácido
nitrilotriacético.
 DESARROLLO DE UN ENSAYO PARA LA
CUANTIFICACIÓN DEL VIRUS HEPATITIS A

Especificidad:
Seleccionó scFv No reactivo Verifican la
Usando la VENTAJAS :
a partir de una frente a otros potencia de la
tecnología de Económica,
librería de Ac. Ag virales. vacuna usando
presentación de simple, sin
Inmunizados scFv mediante
fagos Sensibilidad: pérdida de Ag
contra VHA. ELISA.
0,5 UI
 DESARROLLO DE UN ENSAYO PARA Ig A
BOVINA

Se construyó el scFv Se expresó, se purificó en

recombinante a partir de E. coli , usando como
un hibridoma que expresa Podría reemplazar el uso
reactivo potencial para la
un Ac monoclonal frente de Ig A comercial debido
detección de Ig A
a Ig A bovina a su mayor sensibilidad,
específica del virus de la
estabilidad y facilidad de
Fiebre Aftosa en muestras
producción.
salivales, mediante
ELISA.
DESARROLLO DE UN ENSAYO PARA LA
DETECCIÓN DE IFN-GAMMA HUMANO
Regulación de la RI y la inflamación

Hormona y ejerce efectos pleiotrópicos: actividades

proliferativas, antivirales y antimicrobianas .

Activa macrófagos para matar organismos

intracelulares.

Proteína dimérica y es un miembro de interferones

tipo II secretada por CD4, CD8 y NK.

Inhibe la replicación del virus por sus efectos

inmunoestimuladores e inmunoduladores.

Induce los antígenos MCH clase I y II.

 DESARROLLO DE UN ENSAYO PARA LA
DETECCIÓN DE IFN-GAMMA HUMANO

Se seleccionó un Biblioteca naive

fragmento Fab humana frente a IFN-
humano gamma humano

La actividad de unión
y especificidad falta
de reactividad frente
al IFN- gamma
humano mediante
IC-ELISA.
 CONCLUSIONES

Uso de la tecnología de presentación de fagos

Aplicaciones: Aislamiento de Ac recombinantes

con una ÚNICA ESPECIFICIDAD.

VENTAJAS

Inmunización de Manipulación
Función genética genética adecuada:
Menos tiempo animales Bajo costo.
estable mejor afinidad y
eliminada.
avidez.
GRACIAS POR SU ATENCION…!!!