Sunteți pe pagina 1din 26

BIOCHIMIA MATERIILOR

FECALE
Materiile fecale

De la naştere şi până la moarte, organismul uman este nevoit să


consume energie pentru a supraviețui.
Aportul energetic se asigură prin alimente, dar până la
transformarea în nutrienţi absorbabili, acestea suferă o serie de
transformări.
Randamentul organismului uman în producerea de energie nu este
de 100%, astfel rămân resturi nedigerate şi alte deşeuri pe care
organismul le elimină în mediul exterior sub formă de materii
fecale.
Volum şi număr
La o alimentaţie mixtă, atât vegetale cât şi carne, se elimină la
24 de ore aproximativ 200 g de materii fecale.

În mod normal această cantitate se elimină prin unul sau două
scaune.

 Volumul materiilor fecale eliminate scade dacă alimentaţia este


insuficientă şi creşte la cei cu tranzit intestinal accelerat,
tulburări de digestie sau de absorbţie.
Culoare
În mod normal culoarea materiilor fecale la eliminare este brună şi se datorează stercobilinei, un pigment
provenit din metabolizarea bilirubinei (rezultă din degradarea hematiilor). Modificările de culoare pot fi
fiziologice (consumul unor alimente) sau pot trăda prezenţa unor afecţiuni mult mai grave:

Scaune albe, decolorate – apar fiziologic după un examen radiologic cu bariu (o substanţă albă) sau,
patologic, în obstrucţii biliare. Dacă bila nu se elimină, lipidele nu vor mai fi emulsionate în vederea digestiei şi
absorbţiei, dar nici pigmenţii biliari ce colorează scaunul nu vor fi eliminaţi – apar scaune alb-gălbui.

Scaune verzi – fiziologic apar după consumul unor cantităţi mari de alimente verzi (salată, spanac).
Patologic pot apărea în tranzit intestinal accelerat sau, uneori, în disbioze (bilirubina nu mai este metabolizată).

Scaune roşii – fiziologic apar în consumul alimentelor roşii (sfeclă roşie) sau a unor medicamente
antihelmintice. Scaunele roşii patologice conţin sânge. Sursa hemoragiei este la nivelul colonului descendent sau
a rectului – cancer de colon. Uneori scaunele roşii se pot datora unor fisuri anale sau hemoroizilor.

Scaune negre – apar foarte rar datorită alimentaţiei (afine), de obicei se datorează unor hemoragii la nivelul
tubului digestiv superior (scaunele conţin sânge digerat şi sunt comparate cu păcura la aspect – melenă) sau în
cazul intoxicaţiei cu plumb, doar dacă acesta pătrunde prin ingestie în organism.
 Formă

În mod normal scaunele au formă cilindrică şi un diametru de 2 – 4 cm. Forma lor se


schimbă în diverse situaţii patologice: devin subţiri – formă de creion în cazul unei stenoze
rectale (diametrul rectului este micşorat), se elimină sub forma „excrementelor de capră”
în colon spastic sau sub formă de fecaloame în constipaţii rebele.

Consistenţă

Consistenţa scaunului normal este păstoasă. Se modifică în diaree – devin lichide,


steatoree – spumoase, grăsoase, constipaţie – devin dure. Consistenţa scaunului mai
poate fi modificată de prezenţa puroiului sau a mucusului în materiile fecale (pot proveni
din toxiinfecţii alimentare).

Mirosul

Mirosul este caracteristic şi se schimbă în funcţie de alimentaţie – slab mirositor în regimul


bazat pe vegetale şi puternic mirositor în alimentaţia bazată pe carne. Mirosul se schimbă
şi în anumite afecţiuni, devine rânced în steatoree sau fetid în cancer de colon.
BIOCHIMIA MATERIILOR FECALE

 Componente:
-alimente nedegradate: celuloza, amidon, clorofila, grasimi, fosfati;
-produsi de catabolism: - acizi( butiric, palmitic, acetic, formic),
-substante azotate( aminoacizi, amoniac, hematina etc),
-din procesul digestiei( mucusul, celule, lecitina, colesterol,
pigmenti biliari,microbi),
-apa( 75%).
 Examenul materiilor fecale:
• examenul parazitologic = prin care se depisteaza parazitii si ouale lor;
• examenul fizico-chimic = se evidentiaza prin pigmenti biliari, calciu,lipide, enzime
proteolitice, acizi organici, amoniac, aminoacizi, proteine nedegradate;
• examenul microscopic = urmareste parazitii, hematiile, leucocitele,celulele epiteliale, flora
microbiana, reziduri digestive
 Scopul
Scopul acestei proceduri specifice este de a
prezenta modul de desfasurare a etapelor necesare
determinarii prezentei germenilor patogeni in materiile
fecale(Salmonella,Shigella,Escherichia coli
enteropatogen,Stafilococ coagulaza-pozitiv).

 Domeniu de aplicare
Procedura se adresează personalului din laborator, care
lucrează în compartimentul "Bacteriologie"

 Documente de referinta
-Tratat de Microbiologie Clinica de Dumitru Buiuc;Editura
Medicala 2009
 Definitii
Coprocultura –cultivarea materiilor fecale ceea ce presupune izolarea
agentului etiologic bacterian pe medii adecvate si identificarea lui pe baza
caracteristicilor morfologice,de cultivabilitate,biochimice, si antigenice.

 Abrevieri:
-ADCL-Leifson agar dezoxicolat citrat lactoza
-SS-Salmonella,Shigella Agar
-AABTL:Agar bila albastru de brom timol lactoza
-EPEC: Escherichia coli enteropatogen
-MIU:mediu pentru teste biochimice: mobilitate ,indol,uree
-MILF:mediu pentru teste biochimice:mobilitate,indol
,lizindecarboxilaza,fenilalanin dezaminaza
-TSI:mediu pentru teste biochimice:”triple sugar iron agar ”
Resurse

Echipamente de incercare
-termostat
-autoclav
-termometre de camera si de incinte
-bec de gaz
-anse
-stativ pentru eprubete
 Reactivi si materiale consumabile
 -mediu de cultura ADCL
 -mediu de cultura SS
 -mediu de cultura AABTL
 -mediu de cultura geloza simpla
 -mediu de cultura geloza sange
 -mediu Chapman
 -mediu Muller Hinton
 -medii pentru teste biochimice:MIU,MILF,TSI
 -benzi indol/reactiv Kovacs
 -ser fiziologic
 -plasma
 -placi Petri
 -eprubete
 -seruri aglutinante pentru Salmonella,Shigella,EPEC
 -solutie dezinfectanta
 -marker
Recoltarea probelor:
 Materiale necesare :
 coprocultoare tip din material plastic de unica intrebuintare prevazute cu lingurita sau tija,
 sonde Nelaton sterile nr 14 – 16.
 tampoane rectale cu tija lunga

 Pregatirea pacientului:
 psihica : - asistentul explica pacientului tehnica ce urmeaza a se efectua si modul de recoltare
a probelor de materii fecale
 fizica : pacientul este intrebat daca:
 - proba de scaun a fost sau urmeaza sa se recolteze
 - pentru probele recoltate la domiciliu nu a trecut mai mult de doua ore prelevare,
 - proba a fost pastrata si transportata la rece, imersata in mediu de transport Cary Blair
 - i s-au administrat antibiotice si sulfamide, deoarece toate acestea pot compromite rezultatul
analizei.
 OBS.: In caz contrar , analiza nu este concludenta si se recomanda pacientului sa revina cand
indeplineste toate conditiile cerute!
Procedura de recoltare
 Prelevarea probelor trebuie facuta cat mai aproape de debutul bolii si inaintea instituirii oricarui
tratament antimicrobian,
 Probele de materii fecale pot fi prelevate din scaunul emis spontan sau prin prelevare rectala

 Prelevarea din scaun emis spontan:

 Produsul care permite cele mai multe izolari (indiferent de forma clinica) este scaunul proaspat,
emis spontan.
 Pentru defecare se utilizeaza containere de unica utilizare din carton sau material plastic care
pot fi decontaminate si indepartate cu usurinta dupa efectuarea prelevarii,
 Recoltarea se face cu ajutorul linguritei sau tijei coprocultorului din portiuni din scaun cu mucus si
eventual urme de sange, iar cand lipsesc se recolteaza boluri fecale din 2-3 locuri diferite,
 Cantitatea este de 5 g (un volum minim de 3- 5 cm3) iar daca scaunul este lichid recoltorul trebuie
umplut in proportie de jumatate,
 La bolnavii cronici, purtatori, persoane nespitalizate, scaunul va fi provocat prin purgativ salin (amestec
de sulfat de Na si Mg).
 Pentru controlul purtatorilor de bacili tifici , prelevarea se face timp de 3 zile consecutive, dupa o
administrare mica de purgative
 Prelevare rectala:

 La bolnavii de dizenterie bacteriana si la investgarea purtatorilor de Salmonella si Shigella,


in cazurile in care nu poate fi obtinuta o proba de scaun ca atare, se poate proceda la
recoltarea cu sonda Nelaton sterila nr. 14 – 16 sau cu tampoane rectale sterile cu tija
lunga.

 La copii se poate utiliza si sonda de sticla sterila.

 La adult, cu sonda sau tamponul rectal umezit cu solutie fiziologica (nu se folosesc geluri
lubrifiante) se penetreaza in sfincterul anal prin rotare lenta si se introduce 15-20 cm, iar la
copii 10-12 cm, in colonul sigmoid.

 La sonda Nelaton se adapteaza o seringa de 10 ml cu care se fac 1- 2 aspiratii,

 Produsul recoltat se suspenda in 2 ml solutie fiziologica sterila sau in lichid conservant.

 Se introduce tamponul sau proba in recoltorul etichetat in prealabil, notandu-se codul


zilnic si analizor al pacientului si felul analizei:" corocultura”, “ex.microscopic”, “ex.
micologic”.
Transportul probelor

 Transportul la laborator al prelevatelor de materii fecale destinate examenelor


microbiologice se face in cel mai scurt timp (fara sa depasasca 2 ore de la
prelevare). Este indicata pastrarea la rece a probelor in acest interval pana in
momentul insamantarii.

 In cazul in care acest interval nu poate fi asigurat este obligatorie folosirea unui
lichid conservat, de ex: solutie salina glicerinata tamponata ( in raport de 1-3 g
materii fecale la 10 ml solutie) sau cel mai indicat mediul de transport Cary- Blair.
Acestea mentin vibilitatea microorganismelor timp de 24 ore la temperatura
ambianta.
Tehnica de lucru propriu-zisa.
 EXAMENUL BACTERIOLOGIC
 Pentru stabilirea diagnosticului de laborator se vor cerceta caracterele culturale, morfologice pe
frotiuri colorate dupa metoda Gram si albastru de metilen, comportamentul biochimic si structura
antigenica.
 Examinarea macroscopica
 Se efectueaza din scaunul emis spontan si se inregistreza:
 Mirosul: fecaloid (salmoneloze, shigeloze, campilobacterioze),
 fetid (caracteristic V. cholerae. E. coli enteropatogen),
 Culoarea: - verzuie (V. cholerae),
 - galbena caracteristica (E. coli, Salmonella),
 - hemoragica,
 - rosu viu (Serratia),
 Aspectul: - moale, fecaloid neformat (Salmonella, Campylobacter),
 moale cu grunji fecaloizi (Yersinia, Aeromonas)
 lichid ca “apa de orez” (Vibrio, E. coli enterotoxigena),
 muco-purulent :sciupat rectal” (Shigella),
 hemoragic ± lambouri de mucoasa epiteliala (E. coli enterohemoragica),
 muco-sanguinolent ( Shigella),
 scaun inglobat in mucus (Shigella, E. coli enteroinvaziv),
Examinarea microscopica directa
Microscopia optica include examinarea de preparate umede si fixate
Preparate umede
Preparate native intre lama si lamela
- o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se omogenizeaza cu o picatura de solutie salina izotona,
se acopera cu o lamela evitand formarea de bule
se examineaza cu obiectivul de 40X si se observa:
oua si larve de helminti,
protozoare.
Preparate colorate
- Coloratia cu albastru de metilen
o ansa cu materii fecale (preferabil mucus, sange) se omogenizeaza cu 2 picaturi solutie de albastru de metilen pe o lama,
se acopera cu o lamela evitand formarea de bule de aer,
se astepta 2 min,
se examineaza cu obiectivul de 40X,
se evidentiaza:
- polimorfonucleare ≥50/camp in shigeloze
- polimorfonucleare ≤20/camp in salmoneloze, dizenterie amoebiana
- polimorfonucleare ≥2-5/camp in holera, infectii cu ETEC
- polimorfonucleare, macrofage si eritrocite in shigeloze,
- polimorfonucleare si hematii in campilobacterioze,
 Preparate fixate

 se urmaresc microorganismele
 frotiul se prepara din portiuni nemucoase ale probei prim omogenizarea unei
anse putin incarcate intr-o picatura de solutie salina izotona
 dupa uscare se fixeaza timp de 3 – 4 min cu metanol
 se coloreaza dupa metoda Gram
 se evidentiaza flora gram-negativa dominanta si cea gram-pozitiva (toxiinfectii
alimentare cu stafilococ, Bacillus, Clostidium)
 dominanta fungilor
 Examenul cultural
 Tehnica insamantarii prin epizarea inoculului cu ansa bacteriologica pe placi cu mediu
selectiv agarizat:
 Initial se evapora condensul de pe suprafata mediului prin mentinerea placilor cca 30
minute la 37o C (in termostat) cu capacul intredeschis – “uscarea placilor”,
 Se noteaza pe placa cu mediu de cultura numarul de identificare al probei,
 Tamponul cu prelevat se descarca pe aprox ¼ din placa prin striuri paralele suprapuse ,
 Ultimele 3 – 4 striuri se reiau apoi cu ansa si se descarca in trei grupe de striuri paralele
nesuprpuse,
 Ansa nu se flambeaza intre grupele de striuri,
 Din suspensiile de materii fecale omogenizate in mediu de transport sau in solutie salina
izotona, se depun 2 – 3 picaturi la marginea placii Petri,
 Cu ansa se realizeaza grupe de striuri partial suprapuse,
 Din mediile de imbogatire, agitate in prealabil se procedeaza ca mai sus.
 Proba se insamanteaza ca atare in caz ca scaunul este lichid, preferandu-se
portiunile cu striuri cu mucus si sange.
 Scaunul consistent se omogenizeaza in mediile de transport in care au fost
transportate sau in 5 ml solutie salina fiziologica tamponata. Este foarte util sa se verifice
pH- ul lichidului conservat in care produsul a fost suspendat sa nu fie sub
 Prelucrare ulterioara este diferentiata in functie de examenul solicitat (Shigella,
Salmonella, E. coli enteropatogen, Yersinia etc).
Coprocultura pentru germenii grupului Salmonella
 Probele recoltate se insamanteaza in mod obligatoriu:
 Pe mediul de imbogatire selenit acid de sodiu – trece ulterioara dupa 16 ore incubare la
37ºC pe un mediu selectiv
 Pe mediul ADCL ( sau Leifson) – o placa pentru o proba
 Sau pe mediul Istrate Meitert
 Sau pe mediul Hektoen enteric
 Este indicata si insamantarea directa pe aceste medii de izolare
 In suspiciunea de febra tifoida, se va efectua o insamantare abundenta pe mediul
Wilson-Blair
 Concomitant se insamateaza pe aceleasi medii culturi Salmonella ca atare sau in
suspensii de materii fecale, pentru controlul de calitate.
 Dupa descarcare se disperseaza inoculul prin tehnica epuizarii ansei
bacteriologice, prin striuri apropiate pentru obtinerea de colonii izolate
 Incubarea
 Insamantarile efectuate pe mediul selenit acid de sodium si pe mediile de izolare
se examineaza dupa incubare timp de 18-24 ore la 37ºC iar pentru culturile insuficient
dezvoltate se va proceda la o incubare prelungita de 48 ore, perioada de incubare
obligatorie pentru mediul Wilson-Blair.
Citire si interpretare
 Pe mediul ADCL (sau Leifson) dupa incubare 24 ore la 37 ºC:
 Coloniile de Salmonella apar transparente, de culoare roz-galbui (ca si alte bacterii lactozo-negative)
 Germenii care produc H2S (Proteus, Salmonella) pot prezenta dupa 24 sau 48 ore colonii cu centru negricios
 Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta sub forma unor colonii rosii, fara transparenta,
cu o zona de opacifiere a mediului in jurul coloniei
 Pe mediul cu bila uscata (Istrate Meitert) :
 Coloniile de Salmonella apar de culoare verde-albastruie
 Germenii lactozo-pozitivi (E. coli) pot dezvolta colonii de culoare galbena
 Pe mediul Hektoen enteric:
 Coloniile de Salmonella apar de culoare albastra
 Germenii care produc H2S (Proteus, Salmonella) pot prezenta dupa 24 sau 48 ore colonii cu centru negricios
 Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta sub forma unor colonii rosii, cu o zona de virare
in rosu a mediului in jurul coloniei
 Coloniile suspecte dezvoltate pe mediile de etalare directa sau dupa imbogatire se repica
pe:
 Mediul Mac Conkey

 Coloniile de Salmonella apar semitransparente, necolorate (ca si alte bacterii lactozo-negative)


 Germenii lactozo-pozitivi, in general inhibati, se pot dezvolta sub forma unor colonii rosii, fara transparenta,
cu sau fara halou opalescent, uneori mucoide
 Sau mediul AABTL
 In mod obligatoriu pe mediile politrope TSI, MIU ( 2-4 colonii sunt insamantate prin intepare cu ansa in profunzimea portiunii
verticale a mediului si in striuri pe suprafata inclinata)
 Sau mediul SS agar
Mediile se incubeaza 18-24 ore la 37ºC.

Orice colonie care- pe mediul TSI: - produce H2S


- fermenteaza glucoza cu producere de gaz (partea
dreapta)
- nu produce acid din lactoza-zaharoza (partea
inclinata)
- pe mediul MIU - ureazonegativa
- indolnegativa
- mobile
- pe mediul MILF : - lizindecarboxilaza pozitiva
- fenilalanindezaminaza negativa

=> este suspecta de Salmonella

Culturile care – pe mediul TSI – produc cantitati minime sau nu produc H2S
- fermenteaza glucoza fara producere de gaz
+ celelalte caractere de mai sus
=> sunt suspectate a fi Salmonella typhi si se procedeaza imediat la identificarea serologica.
 Diagnosticul serologic

 Serotipia - o efectuam dupa schema Kauffmann-White


 Se folosesc culturile de pe panta mediului TSI pentru aglutinari cu seruri anti
Salmonella polivalente si monovalente
 In eventualitatea unei culturi abundente pe mediile de etalare se va proceda la o
aglutinare directa cu serul antisalmonella polivalent Vi si de grup AO, BO, CO, DO, EO-
pentru un diagnostic prezumtiv.
 Culturile dezvoltate pe mediile politrope si pe mediile de repicare in placi vor fi
examinate, confruntandu-se cu aspectul culturii initiale. In cazul in care ele prezinta
spectrul biochimic caracteristic salmonellor (pe TSI, MIU), sau culture suspecte pe
repicari sa va trece la aglutinarea pe lama cu serurile antisalmonella: serurile Poli “O”
si Vi ca etapa screening; in caz pozitiv se vor face aglutinari pe lama cu serurile O de
grup (AO, BO, CO, DO, EO) si apoi cu cele flagelare H de tip.
 NOTA:
 In eventualitatea in care tulpina- desi mobila-nu aglutineaza cu serurile flagelare, se va
da rezultatul de grup Salmonella (AO, BO, CO, DO, EO)
 Acelasi rezultat este recomandabil si in cazul in care tulpina nu poate fi diagnosticata
ca un anume serotip
 Exceptie face Salmonella typhi, pentru care diagnosticul de serotip trebuie sa fie realizat
in prima etapa
 In cazul unei aglutinari negative cu serul Poli O si Vi ( dar cu spectru biochimic specific
ptr. Salmonella) se vor efectua teste biochimice suplimentare: cercetarea
lizindecarboxilazei, testul ONPG, retestarea serologica dupa termoinactivare.
 Tulpina de Salmonella izolata se trimite la Institutul Cantacuzino pentru
identificare de serotip si lizotip.
 OBS: Se inregistreaza in registrul pentru evidenta probelor de bacteriologie totalitatea
testelor de identificare efectuate si interpretarea acestora cat si mediile de cultura
folosite suplimentar fata de setul standard.

 Eliberarea rezultatului
 Un rezultat negativ va fi eliberat la 24-48 ore de la primirea probei.
 Un rezultat pozitiv va preciza taxonomia agentului patogen si va preciza testarea
pentru sensibilitatea la antibiotice si chimioterapice.
 Erori de diagnostic
 Surse de eroare
 numarul mic de unitati infectante/g materii fecale si eliminarea sporadica la cazurile de
portaj
 volum prea mic al recoltei
 depasirea intervalului de timp dintre momentul recoltarii si insamantarea prelevatului
 lipsa controlului de calitate al mediilor utilizate
 folosirea echipamentelor incorect monitorizate
 Evitarea erorilor
 folosirea unor proceduri de imbogatire a prelevatului si repetarea examenului negativ
 volumul prelevatului sa fie minim 3-5 cm3
 prelevatele care nu se insamanteaza pe medii de izolare(imbogatire sau selective) intr-
un interval de 2 ore trebuie supus unui proces de conservarer (conservare prin
refrigerare pentru cel mult 24 h la +4ºC).
 monitorizarea si intretinerea corespunzatoare a echipamentelor utilizate pentru
incercare
 controlul de calitate al mediilor folosite
 Exprimarea rezultatelor
 Descrierea softului de interpretare
 -interpretarea rezultatelor analizelor microbiologice se face prin aprecierea
caracterelor culturilor obtinute si interpretarea testelor biochimice si a reactiilor
de aglutinare
 Estimarea incertitudinii de masurare
 -in microbiologie incertitudinea de masurare se determina ca:
 repetabilitatea metodei,determinata pe esantioane alese de laborator
 acuratetea metodei sau exactitatea ,determinata pentru acele metode pentru
care exista materiale de referinta
 repetabilitatea:apropierea acordului dintre rezultatele masuratorilor succesive
ale aceleiasi probe,masuratori efectuate in aceleasi conditii de masurare
 reproductibilitatea:apropierea acordurilor dintre rezultatele masuratorilor
aceliuiasi produs,masurari obtinute in 2 sau mai multe laboratoare
 -controlul mediului cu ajutorul tulpinilor de control se face la fiecare lot de
mediu turnat