ESTABLECIMIENTO

DE CULTIVO DE
TEJIDOS VEGETALES
IN VITRO
LIZETH PAOLA ORTIZ
MICROBIOLOGÍA
INDUSTRIAL
El cultivo de tejidos vegetales in vitro, comprende en su acepción amplia
mediante las cuales un explante se cultiva asépticamente en un medio de
composición químicamente definida y es llevado a incubación a condiciones
controladas.

La utilización del cultivo in vitro logran ser numerosas y diferentes:

a. Estudios básicos de fisiología, genética, Bioquímica y ciencias afines.
b. Bioconversión y producción de compuestos útiles.
c. Incremento de variabilidad genética.
d. Obtención de plantas libres de patógenos.
e. Propagación de plantas.
f. Conservación de germoplasma.
 ASPECTO COMUNES AL
ESTABLECIMIENTO DE LOS CULTIVOS.

Normas de Medios de Condiciones

Explante.
asepsia. cultivo. ambientales.
 Callo+Regeneración indirecta
Para estudios básicos, para la
iniciación de suspensión celular,
bioconservasión y producción de
compuestos utilices.

 Regeneración directa
Ideales para micropropagar
plantas.
 EXPLANTE
La elección del explante, debe ser apropiada siendo
este el primer paso para el establecimiento de los
cultivos in vitro.

La producción de callos en condiciones ambientales

logran llegar a la proliferación callosa logrando ser
muy frecuente la utilización de (ápices, meristemos,
hojas, entrenudos, cotiledones, raíces y anteras,
tejidos provenientes del fruto).
Tallo Raíces Óvulos Embriones
 ASEPSIA
Evitar la contaminación con microorganismos es un aspecto básico que se debe tener en
cuenta para el éxito, no solo en el establecimiento de los cultivos sino su incubación y
manipulación.

Para lograr establecer cultivos asépticos es conveniente o necesario tener en cuenta las
siguientes recomendaciones:
a). Trabajar en ambientes adecuados.
b). Esterilizar los medios de cultivos.
c). Desinfectar superficialmente los explantes( Bacterias y hongos).
d). Realizar los cultivos respetando ciertas normas de asepsia.
Por asepsia en el establecimiento del cultivo y durante la manipulación
se debe es preciso adoptar algunas recomendaciones:

1. Antes de comenzar a trabajar desinfectar la mesa y las paredes de la

cámara con etanol al 70%
2. Es necesario que las manos sean desinfectados con etanol al 70% y el
uso de bata, gorro y tapabocas para reducir la contaminación.
3. Los instrumentos metálicos deben ser flameados previamente con
etanol al 95%
4. Y realizar las operaciones de transferencia lo mas cerca posible al
mechero y evitar exposiciones prolongadas de explantes o de
cultivos en recipientes abiertos.
 MEDIOS DE CULTIVO
Es necesario elegir un medio apropiado de cultivo, en el cual hay que considerar no
solo los componentes sino su preparación.

COMPONENTES DEL MEDIO:

a. Fuente de carbono
b. Nutrimientos minerales
c. Vitaminas
d. Agentes gelificantes
e. Sustancias reguladoras de crecimiento
f. Otros componentes.
 FUENTE DE CARBONO
La nutrición se desarrollo bajo condiciones in vitro a partir
de diferentes órganos y tejidos, ampliamente heterótrofos
por la ausencia o insuficiencia de la clorofílica, por lo cual
resulta indispensable añadir azúcares a los medios de
cultivos como fuentes de energía y reguladores
osmóticos. La sacarosa es el azúcar empleado
universalmente.

 Pueden reemplazar glucosa y en

menor medida por fructosa.
 La maltosa y la galactosa son menos
efectivas.
 NUTRIMIENTOS MINERALES
Se consideran esenciales
Macronutrientes: para el crecimiento
C,H,O,P,K,N,Ca y Mg de las plantas enteras:
 Nitrógeno se suministra en forma de
nitrato y amonio.
 Acido cítrico
 Succínico o málico.
 Otras fuentes: incluyen glutamina,
urea y caseína hidrolizada. Micronutrientes: B,Zn,Mn,Cu,MO.Fe y Cl
 Son esenciales para el funcionamiento de
varias enzimas, y deben estar incluidos en
el medio de cultivo.
 REGULADORES DE CRECIMIENTO
Son sustancias que tienen funciones variadas y
especializadas, que ordenan, aceleran o regulan la
intervención de los procesos vitales en el tiempo y el
espacio

En la mayoría de los casos se hace

necesario agregar al medio sustancias
reguladores de crecimiento,
generalmente de tipo auxinas o las
citoquininas.
 AUXINAS
Son un grupo de hormonas vegetales naturales que regulan muchos aspectos del
desarrollo y crecimiento de plantas.

Sintéticas Naturales

Ácido naftalenacetico Acido indol butírico Diclorofenoxiacético ácido indolacetico

(ANA) (AIB) (2,4-D) (AIA)
• Estimula el • Promueve la • Promueve la • Promueve la
desarrollo de formación de formación de formación de
raíces. raíces laterales raíces laterales raíces laterales
• Termosensibles
(Susceptible a
cambios de
temperatura)
 CITOQUININAS
Son hormonas vegetales naturales que estimulan la división celular en tejidos es derivada de
la adenina. Favorece la formación de yemas laterales, y crecimiento de tubérculos,
alargamiento de frutos y semillas y la inhibición del amarilleo de las hojas.
6 BENZIL-AMINO-
Kinetina PURINA ZEATINA
( BAP)
• Facilita la nutrición • Promueve la • Miller y (1964)la
de las plantas, brotación de yemas Lethandescubren
mejora la brotación laterales y induce la en granos de maíz.
de yemas florales y división celular, • Retarda el
frutales incrementando el envejecimiento de
contenido de hojas y frutos
clorofila
 GIBERILINAS
Cumplen un importante papel fisiológico en la elongación de
semillas brotes y tallos y además promueve la floración, estas
hormonas promueven la biosíntesis (elaborar sustancias
orgánicas complejas) de auxinas e inhiben su degradación por
la AIA. La primera giberelina purificada y estructuralmente
identificada fue el ácido giberélico (GA3).

Las giberelinas (AG) fueron descubiertas en el Japón, en la

década de los 30, en plantas de arroz enfermas a causa del
hongo.
 VITAMINAS
Son necesarias para llevar a cabo una serie de reacciones catalíticas en el metabolismo
y son requeridas en pequeñas cantidades. Las vitaminas más empleadas son:

Tiamina (B1): Es una

Riboflavina (B2): Piridoxina (B6):
vitamina esencial
Ayuda en la Estimula el
para el crecimiento
respiración celular. Y crecimiento de las
de la célula vegetal
es necesario para el plantas actuando en
cataliza la oxidación
crecimiento de las las reacciones de
del acido pirúvico en
raíces. energía.
el ciclo respiratorio.

Termosensibles
Myo-inositol: No es
Acido nicotínico (B3): una vitamina, sino
Acido Ascórbico: Son
Participa como un azúcar-alcohol.
antioxidantes para
componente de co- Tiene un efecto
evitar el
enzimas que actúan sobre la proliferación
en las reacciones de oscurecimiento de
de tejidos y sobre la
determinados tejidos
energía. activación de la
organogénesis
 AGENTES GELIFICANTES
La efectividad de un cultivo depende tanto de los ingredientes básicos, nutricionales, azucares
como del agente gelificante. El agar comercial contiene muchas impurezas que pueden llegar a
alterar las características químicas y físicas del medio, afectando así directamente los tejidos
celulares cultivados ( Kohlembach y Wernicke).
 Agarosa: Son usados con frecuencia cuando se cultivan protoplastos o celular individuales. Este
es un extracto purificado en agar que deja atrás grupos de agaropectina y sulfatos.
 Alginato: Excelentes para cultivo de células en suspensión y de protoplastos
 Fitagel:Conocido también con el nombre gelrita, marca registrada de Merck; es de amplio uso.
 Ficoll: Es un derivado de polisacáridos que produce medios de cultivo de tipo coloidal.
Encuentra una aplicación importante en el cultivo de anteras.
 CARBON ACTIVADO
Tiene capacidad para remover sustancias inhibitorias o
tóxicas del medio de cultivo generadas durante el
autoclavado del medio o liberadas por el explante. Una
de las sustancias producidas durante el autoclavado es
el 5-(hidroximetil)-2-furaldehído (HMF).
 AGUA DE COCO

Overbeek, Conklin y Blakeslee ( 1942) mostraron que los

embriones en desarrollo de Dutara se podían cultivar in
vitro hasta su madurez, utilizando el endospermo liquido
del coco. Como suplemento de un medio de cultivo.

Caplin y Stewrd ( 1948) se dieron cuenta del potencial del agua

de coco para inducir la división celular, se observaron por
primera vez de la raíz de la zanahoria cultivada.
 COMPONENTES

Es un medio muy complejo con una amplia gama de componentes

orgánicos e inorgánicos con gran capacidad de amortiguación (Buffer). Rica
en magnesio y fosfato, el contenido de azúcar es de 2.4% y por ultimo se
pude encontrar nitrógeno no proteico soluble en forma de aminoácidos.
 CONDICIONES AMBIENTALES

La luz y la temperatura son dos factores que están relativamente

poco estudiadas, comúnmente es utilizado un ciclo de
fotoperiodo de 16/ 8 horas, t temperaturas entre 25 y 28 c son
las ideales para el establecimiento de cultivo.
 MEDIOS DE CULTIVOS
Los componentes del medio de cultivo y las formula salinas
basales de las soluciones de cultivo, actualmente como
debería ser mas que suficiente para suministrar un mínimo
de elementos requeridos.

 Murashige y Skoog
 White
 Nitsch
 B5
 Murashige y Skoog
Es el medio más conocido; se elaboró tomando el cultivo in vitro de tabaco como
modelo y siguiendo un procedimiento cuantitativo se determinaron las
concentraciones mas adecuadas de todos los nutrientes. Es apto para la mayoría de
las especies, por lo que es de amplia utilización, excepto para las más sensibles a la
salinidad ya que se caracteriza por tener una elevada concentración salina
 White
Es uno de los medios, si no el mas, diluido de que se dispone, y por lo tanto de
uso complementario al MS. Se elaboró para cultivo de raíces de tomate.
 Nitsch
Es un medio útil en el cultivo de partes de flores de tomate contiene mayor concentración de
sacarosa (5%) como fuente de hidrato de carbono. Este medio de cultivo posee menores
concentraciones de sales minerales que el medio propuesto por Murashige y Skoog (1962).
 B5
Gamborg trabajó activamente en la elaboración de medios, a los que dio
diferentes números. EL B5 fue formulado para cultivo de callo de soja.