1

1. GENERALITĂŢI

2. DECARBOXILAREA OXIDATIVĂ A PIRUVATULUI

3. DESCRIEREA SECVENŢIALĂ A ETAPELOR CICLULUI

4. REGLAREA PROCESULUI DE DECARBOXILARE

OXIDATIVĂ A PIRUVATULUI ŞI A CICLULUI KREBS

2
 1. GENERALITĂŢI

► loc de desfăşurare: matricea mitocondrială

► desfăşurarea a fost descrisă în 1937 de Hans Krebs

► este un ansamblu de 8 reacţii

► punct de convergenţă al principalelor căi metabolice degradative, dar şi

a unor importante căi anabolice

► substratul principal: acetil~CoA

► funcţia majoră: bioenergetică

3
► oxidarea metabolică a compuşilor organici se desfăşoară în 3 etape:
Piruvat
Aminoacizi Acizi grasi
CO2
e-
e- e-
1
CO2
Acetil-CoA
NH3

Oxal-acetat Citrat
e-
Malat
2
Izocitrat
Ciclul e-
citric CO2
Fumarat
e- -Ceto-glutarat
Succinat e-
CO2
ATP
Succinil-CoA

Cãrãusi de electroni
in stare redusã
(NADH, FADH2)
ADP Lant H + 1/2O2
respirator
ATP 3 H2O
Cãrãusi de electroni
in stare oxidatã 4
(NAD+, FAD)
 principalul substrat: acetil~CoA catabolizarea alcoolului
catabolizarea corpilor cetonici
piruvat

degradarea oxidativă a glucidelor -oxidarea acizilor graşi aminoacizi

şi alţi intermediari ai ciclului

celălalt substrat: oxalacetatul

regenerare prin fiecare parcurgere a suplimentat în permanenţă pentru

ciclului menţinerea fluxului metaboliţilor
carboxilare

piruvat acid aspartic

glucide transaminare
5
 Din glicolizã Din oxidarea
acizilor grasi Aminoacizi (Trp, Leu, Ile)
Alanină O CoA-SH
CH3 C COO-
Glicină CO2
Catabolizarea alcoolului
Piruvat
Cisteină NAD+ Piruvat O
dehidrogenazã
CH3 C S CoA
Serină NADH
Acetil-CoA
Catabolizarea corpilor cetonici
Treonină NADH + H+
O CoASH + H+
Malat- Citrat
Asparagină dehidrogenazã
C COO- sintetazã
Aspartat -OOC C H H
NAD+
H H C COO-
OH Oxalacetat H2O HO C COO-
H C COO- -OOC C H
-OOC C H
H Aconitazã
H
Citrat
Malat H
Fumarazã
H2O H C COO-
H H C COO-
Aspartat
C COO- Ciclul -OOC C OH
Tirozină -OOC C TCA H
Fenilalanină H Izocitrat
Fumarat CO2 NAD+
FADH 2 Izocitrat-
Succinat- dehidrogenazã
dehidrogenazã H
H H C COO- NADH
FAD CO2
H C COO- H
CoA-SH H C
-OOC C H -OOC C
H
Valină Succinat H
-Ceto-
Glutamat
H C COO- O glutarat
Metionină NAD+ Glutamină
Succinat- GTP H C H
GDP -Ceto-glutarat-
Treonină tiokinazã C S CoA dehidrogenazã Histidină
Izoleucină ADP O
NADH Prolină 6
Succinil-CoA
ATP
Arginină
 Decarboxilarea oxidativă a piruvatului
Conversia Swanson
în condiţii de aerobioză

la nivel mitocondrial

transportor membranar specific

reacţie ireversibilă

sistem enzimatic al piruvat-dehidrogenazei (PDH)

piruvat-dehidrogenaza TPP
dihidrolipoat-transacetilaza acid lipoic
dihidrolipoat-dehidrogenaza;
CoA
FAD
NAD+
5 etape:
7
 O Etapa I
H CH3 C COO-
C Piruvat
S
R CH2 N ..
CH2 R C
S
H+ R CH2 N
CH3 CH2 R
Portiunea tiazolicã activã CH3
din TPP
Carbanionul TPP-ului

H+

OH
O
CH3 C C
O-
C
S
R CH2 N
CH2 R
CH3
Compus de aditie

Etapa formării compusului de adiţie

adiţia unui atom de carbon de pe TPP pe carbonul carbonilic al
piruvatului cu formarea unui intermediar reactiv 8
 OH
Etapa II
OH CH3 C
O Formarea hidroxi-etil-TPP
CH3 C C C
S
O- R CH2 N:
C CH2 R

S
R CH2 N CO2
CH2 R CH3
CH3 Intermediar
Compus de aditie H+

OH
CH3 C H

C

S
R CH2 N
CH2 R
CH3
Hidroxi-etil-TPP
acetaldehidã activatã

decarboxilarea neoxidativă a intermediarului

sub acţiunea catalitică a piruvat-decarboxilazei
şi se generează hidroxi-etil-tiamin-pirofosfat (HETPP) 9
Etapa III: transferul grupării de doi atomi de carbon pe acidul lipoic
CH3 R1
CH3
N
C
C C OH
C
S O
H+ R2 C
-
CO2
O
Piruvat
CH3 R1 decarboxilazã
N CH3
C
C:
C C O H+ B Enz
S
R2 C O R1
Inelul tiazolic CH3 R1 CH3 CH3
- CH3 N
din tiamin O N C
Piruvat C C C OH
pirofosfat C C OH
.. C
C S
S R2
R2 H+ HETPP
H+ S S
H
N
Enz
R1 O
CH3 :B Enz Acid lipoic
CH3
N
C Dihidro-lipoil-
C C O H trans-acetilazã
C NADH+H+
S S SH
R2
H Dihidro-lipoil-
N dehidrogenazã
Enz
CH3 O NAD+
C O

S SH SH SH
H H
N N
Enz Enz
O O
Acid acetil lipoic Acid dihidrolipoic
O
CoASH 10
CoA S C CH3
Acetil-CoA
transferul grupării acil pe coenzima A, concomitent cu reducerea acidului lipoic
CH3 R1
CH3
N
C
C C OH Etapa IV:
C
S O
H+ R2 C
CO2
O-
Piruvat
CH3 R1 decarboxilazã
N CH3
C
C:
C C O H+ B Enz
S
R2 C O R1
Inelul tiazolic CH3 R1 CH3 CH3
- CH3 N
din tiamin O N C
Piruvat C C C OH
pirofosfat C C OH
.. C
C S
S R2
R2 H+ HETPP
H+ S S
H
N
Enz
R1 O
CH3 :B Enz Acid lipoic
CH3
N
C Dihidro-lipoil-
C C O H trans-acetilazã
C NADH+H+
S S SH
R2
H Dihidro-lipoil-
N dehidrogenazã
Enz
CH3 O NAD+
C O

S SH SH SH
H H
N N
Enz Enz
O O
Acid acetil lipoic Acid dihidrolipoic
O
11
CoASH
CoA S C CH3
Acetil-CoA
 Etapa V: oxidarea dihidrolipoatului înapoi la forma disulfidică

echivalenţii reduşi sunt captaţi succesiv pe FAD şi NAD+,

rezultând în final NADH + H+;

energia chimică a unui echivalent reducător NADH + H+

este eliberată pentru sinteza a 3moli ATP, la nivelul lanţului respirator mitocondrial

reacţia globală:

piruvat + NAD+ + CoA  acetil-CoA + NADH + CO2

sistemul enzimatic este reglat prin fosforilare / defosforilare, aflată sub

control endocrin

12
Reacţia 1: ►este o condensare aldolică care are loc între acetil-CoA şi
oxalacetat sub acţiunea citrat-sintetazei

► în reacţie, carbanionul rezultat la C-2 al grupării acetil

(consecutiv pierderii unui proton de pe carbonul metilic)
se adiţionează prin atac nucleofil la gruparea carbonil a oxalacetatului

►rezultă astfel acidul citric (6 atomi de carbon),

primul din seria celor trei acizi carboxilici;

►reacţia decurge printr-un intermediar puternic reactiv, citril-CoA,

care hidrolizează spontan;

► în finalul reacţiei coenzima A este eliberată;

►reacţia este ireversibilă

►reacţia se constituie într-un prim punct de reglare al întregii căi

13
 H O
H O
H C- C S CoA
•• H C
Acetil-CoA C S CoA
carbanion
+
H
HO C COO-
O C COO- Citrat-sintetazã
H C COO-
H C COO- H
H Citril-CoA
Oxalacetat

Citrat-sintetazã CoA - SH

H
H C COO-

HO C COO-

H C COO-

H
Citrat 14
 Reacţia 2:
►izomerizarea citratului la izocitrat sub acţiunea aconitazei

► izomerizarea generează o grupare alcoolică secundară, susceptibilă la oxidare

► reacţia se desfăşoară în două etape,

implicând formarea intermediară a cis-aconitatului
şi rehidratarea ulterioară a acestuia cu formare de izocitrat

15
 H
H C COO-

HO C COO-

O C C H
O- H
Citrat

Aconitazã
H2 O H2 O
H
H C COO-

C COO-

C
H C O

O-
cis-Aconitat
H2 O H 2O
Aconitazã

H
H C COO-

H C COO-

HO C COO-

H 16
Izocitrat
Reacţia 3: ► prima conversie oxidativă a ciclului Krebs;
este catalizată de isocitrat-dehidrogenază
(preponderent forma mitocondrială),
în prezenţa coenzimei NAD+ şi a ionilor de Mg2+ sau Mn2+

► conversia are loc în două etape: oxidarea alcoolului secundar

cu formarea unei cetone
(oxalo-succinat, intermediar puternic instabil),
urmată de -decarboxilare spontană cu formare de -cetoglutarat

► reacţia eliberează prima moleculă de dioxid de carbon

şi de asemenea prima moleculă de NADH + H+

► reacţia implică prin urmare dehidrogenare cu formare de oxalo-succinat,

un intermediar instabil, legat de enzimă,
care se decarboxilează spontan eliberând produsul

17
 O
CH2 C O-
O

H C C O-
O
:B Enz
O- C C O H
R H Izocitrat
N
NAD+

Izocitrat
H dehidrogenazã
R
N
NADH

H H
O O

CH2 C O- CH2 C O-
O Izocitrat
dehidrogenazã
H C C O- CH2
O CO2 O
H+
- -
O C C O O C C O 18
Oxalo-succinat -Ceto-glutarat
Reacţia 4:
► este cea de a doua decarboxilare oxidativă a ciclului

► este o reacţie multifazică

► este catalizată de complexul multienzimatic al α-ceto-glutarat-

dehidrogenazei

► secvenţa de reacţii este analoagă cu decarboxilarea oxidativă a

piruvatului

► prima reacţie a seriei decarboxilează substratul

► urmează transferul consecutiv al unităţii de 4 atomi de carbon pe

acidul lipoic, apoi pe CoA şi final, reoxidarea aciduluidihidrolipoic, prin
FAD şi NAD+

► este eliberată a doua moleculă de CO2 şi o nouă moleculă de NADH + H+

19
 COO-

C O
CH2

CH2
COO-
-Ceto-glutarat

H+
E1 TPP
CO2

E1 TPP CH OH

CH2

CH2
COO-

20
 ► reacţia eliberează cea de a doua moleculă de dioxid de carbon
şi o nouă moleculă de NADH + H+

prin transferul de pe acidul lipoic pe HS-CoA se va genera un derivat

încărcat energetic, succinil-CoA

COO-
+
CoA-SH NAD NADH COO-
CH2
CH2
CH2 -Ceto-glutarat
dehidrogenazã CH2
C O CO2
C O
-
COO
-Ceto-glutarat S CoA
Succinil-CoA

21
Reacţia 5:

► conversia succinil-CoA în succinat, sub acţiunea succinat-tiokinazei

COO- ATP ADP COO-

CH2 CH2
GDP GTP
CH2 CH2
Succinat-
C O tiokinazã COO-

S CoA CoA-SH Succinat

Succinil-CoA

► reacţia este un exemplu de fosforilare la nivel de substrat

22
► concomitent are loc formarea unei legături fosfat macroergice (GTP) prin
recuperarea energiei rezultată prin desfacerea succinil-CoA

► GTP are aceeaşi încărcare energetică ca şi ATP (în care de altfel şi este
imediat convertit)

► o parte din succinil-CoA este folosit în biosinteza hemului

► majoritatea este însă reţinută la nivelul ciclului, servind la regenerarea

oxalacetatului (necesar menţinerii operante a acestuia)

23
Reacţia 6:
dehidrogenarea FAD-dependentă a succinatului cu generare de fumarat

COO- COO-

CH2 CH
+ E - FAD + E - FADH2
CH2 succinat-dehidrogenază HC

COO- COO-
Succinat Fumarat

► enzima este o flavoproteină localizată la nivelul membranei

mitocondriale interne, reprezentând totodată Complexul II al L.R.M.

24
 Reacţia 7:

► conversia fumaratului la L-malat sub acţiunea fumarazei,

care catalizează adiţia stereosecifică a unei molecule de apă la dubla legătură

COO-
COO-
CH
HO C H
HC + H 2O CH2
fumarază
COO- COO-
Fumarat L-Malat

25
Reacţia 8:

► etapa oxidativă finală a ciclului Krebs şi

implică conversia malatului la oxalacetat sub acţiunea catalitică
a malat-dehidrogenazei

COO- COO-

HO C H O C
+
+ NAD
CH2 malat- CH2 + NADH + H+
dehidrogenază
COO- COO-
L-Malat Oxalacetat

26
 Reacţiile ciclului TCA

Nr. Reacţia Enzima

1 Acetil-CoA + oxalacetat + H2O citrat-sintetază

 citrat + CoA
2 Citrat  cis-aconitat  Izocitrat aconitază
3 Izocitrat + NAD+  -cetoglutarat + NADH+H++ izocitrat-dehidrogenază
CO2

4 -cetoglutarat + NAD+ + CoA  -cetoglutarat-

succinil-CoA + NADH + CO2 dehidrogenază
5 Succinil-CoA + GDP + Pi  succinat-tiokinază
succinat + GTP + CoA
6 Succinat + FAD  fumarat + FADH2 succinat-dehidrogenază
7 Fumarat + H2O  L-malat fumarază
8 L-malat + NAD+  oxalacetat + NADH + H+ malat-dehidrogenază

Reacţia globală:
Acetil-CoA + 2 H2O + 3 NAD+ + FAD + ADP + Pi 
 2 CO2 + 3 NADH + 2 H+ + FADH2 + CoA + ATP 27
28
29
• funcţia principală a ciclului TCA fiind cea energetică, reglarea procesului se
va face la nivel enzimatic funcţie de nivelul energetic al celulei

nivelul de utilizare al ATP

• semnale de informare asupra nivelului energetic sunt conferite de:

scăderea raportului ATP / ADP (acumulare de ADP, deci deficit energetic)

modificarea raportului NADH + H+ / NAD+

• enzimele la nivelul cărora are loc reglarea sunt:

► piruvat-dehidrogenaza controlează fluxul de acetil-CoA

PDH-kinază PDH-fosfatază activată de calciu

(inactivare) (activare) acțiune 30
(inhibată de creșterea conc.ADP) sinergică !!!
• factorii care inhibă activitatea PDH sunt de regulă produşii finali ai
reacţiei catalizate:

acetil-CoA şi NADH + H+

acţionează prin stimularea PDH-kinazei

• intrarea acetil-CoA în ciclul Krebs este controlată şi la nivelul

► citrat-sintetazei

inhibată de creşterea concentraţiei de citrat

stimulată de creşterea concentraţiei de oxalacetat

31
 ► izocitrat-dehidrogenaza

inactivată de creșterea
activată de creșterea conc.ADP
rap.NADH+H+ / NAD+

► α-cetoglutarat-dehidrogenaza

activată de creșterea conc.Ca2+ inactivată prin produșii de

reacție (NADH+H+, succinil-CoA)
eliberarea ionilor de calciu în timpul contracției musculare
semnalizează necesitatea regenerării de ATP

► malat-dehidrogenaza

inhibată prin creșterea raportului NADH+H+ / NAD+

32
 menținerea operantă a ciclului Krebs este dependentă nu doar de
disponibilitatea substratelor, ci și a formei oxidate a coenzimelor
NAD+, respectiv FAD;

 regenerarea acestora având loc la nivelul lanțului respirator

mitocondrial, ciclul Krebs va fi blocat sau încetinit în situațiile
caracterizate prin :

 anomalii ale respirației mitocondriale,

 în cazul unui deficit cronic de oxigen ,

 sau în prezența unor inhibitori specifici ai lanțului.

33