Tehnici speciale utilizate in biologia

celulara si moleculara

CULTURI CELULARE
 Ce sunt culturile celulare?

• Culturile celulare reprezinta cultivarea in

vitro a unor fragmente de tesut sau a
unor suspensii celulare;naturale sau
obtinute prin tehnici de laborator ,in
scopul muliplicarii celulare.
 Tipuri de culturi de
celule
• Dupa felul substratului
• Dupa modul de initiere a culturii
• Dupa tipul de material biologic
cultivat
 A.Dupa felul substratului

• Pe suport organic nutritiv

• Pe suport organic nenutritiv
• Pe suport anorganic
• In suspensie in mediul lichid
B.Dupa modul de initiere al culturii
Culturi initiate cu fragmente de tesut
a)pe suport nutritiv:
-culturi in picatura suspendata
-culturi in flacoane
-culturi in tuburi rotate
b)pe suport nenutritiv
c)in suspensie in mediu lichid(dar in acestcaz se
obtine numai supravietuirea celulelor)
B.Dupa modul de initiere al culturii
Culturi initiate cu celule dispersate
• Culturi de celule libere in mod
natural(culturi de leucocite din sangele
periferic,de elemente hematopoietice din
maduva osoasa sau de celule recoltate din
exudat)
• Culturi de celule obtinute prin dispersia
celulelor din fragmente de tesut
 C.Dupa tipul de material biologic
cultivat
Culturi de organe
-reprezinta scoaterea din organism a unui
fragment de organ si introducerea acestuia
intr-un mediu nutritiv
Culturi de celule
-cultura de tesuturi
-cultura celulara propriu-zisa(asocierea
factorilor chimici-enzime etc)
 MATERIALE DE LUCRU
• Cultrile celulare se prepara intr-un spatiu
de lucru steril,amenajat special ce include:
-instalatie de apa curenta
-gaze
-electricitate
 Nevoile de baze:
• Arie de lucru sterila
• Sticlarie ,instrumente fine
• Dispozitive de curatat si sterilizat
• Recipiente de stocare pentru
mediu,ser,sticlarie
• Incubator si hota cu flux laminar
• Sursa de apa
• Mocroscop,agitator magnetic,
balanta analitica
• Substante chimice
 Regulile tehnicilor aseptice
• Accesul limitat in zona de culturi celulare
• Suprafetele se decontamineaza cu etanol 70%inainte si
dupa utilizare
• Nu se pipeteaza cu gura, nu se mananca,fumeaza in
zona de lucru
• Hainele de protectie se folosesc numai in cadrul
incintei,fiind interzisa purtatrea lor si in afara ei
• Se spala mainile inainte si dupa peratii,iar parul se leaga
• Se controleaza emisiile de aer, se sterilizeaza incinta cu
lampi UV
 MEDIILE DE CULTURA
CELULARA
Aceste medii trebuie sa asigure:
• Echilibru ionic(obtinut cu substante izotone)
• pH optim(mentinut cu substante tampon)
• Temperatura optima
• Elemente nutritive indispensabile metabolismului
(proteine animale ,aminoacizi esentialai si grasimi)
• Evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin
adaugarea de antibiotice si antifungice
• Stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin
adaugare de extracte embrionare
 Medii de cultura celulara
CLASIFICARE:
• Dupa consistenta: -lichide
-semilichide
• Dupa compozitie: -naturale
-semisintetice
-sintetice
• Dupa valoarea urmarita si dupa scopul nutritiv:
-medii de crestere
-medii de mentinere
 Medii de cultura celulara

CONTINUT:
• O solutie salina
-solutie tampon + indicator
• Elemente proteice
-ser,plasma,lichid amniotic,aminoacizi
• Elemente stimulatoare ale cresterii
• Vitamine
• Antibiotice
 Tehnica culturii celulare

Recoltarea se face din variate tesuturi provenite de

la om,animal,insecte,plante;in functie de aceasta
provenienta se impart in :
• Tesuturi normale:
-embrionare
-adulte
• Tesuturi tumorale
 Tehnica culturii celulare
Pentru recoltare sunt indeplinite anumite
conditii ,acestea sunt:
• Sa se evite contaminarea tesuturilor cu microorganisme
prin respectarea riguroasa a asepsiei
• Sa se evite traumatizarea in timpul recoltarii si in
cursul manevrelor ulterioare
• Sa se realizeze cat mai curand dupa deces
• De la recoltare si pana la prepararea culturii tesutul s
epastreaza la rece, intr-o solutie salina cu
antibiotice,timp de 3-4 ore
 1.Tesuturi embrionare umane
• In acest caz recoltarea se face de la embrioni de 1-3
luni.Acesta se depoziteaza intr-un cristalizor steril,cu
capac ce contine o solutie salina cu antibiotice
• Initial tegumentul embrionului este considerat
contaminat,iar sterilizarea se realizeaza cu alcool iodat
cu precautia ca acesta sa nu patrunda in cavitatile
embrionului.
• Fragmentele de tesut embrionar curate se in alta cutie
Petri sterila cu solutie alcalina dupa ce au fost inlaturate
cheagurile de sange prin intermediul unor pense sterile.
• Dupa ultima spalare fragmentele se aseaza intr-o
eprubeta de centrifuga sterila iar prin intermediul unor
foarfeci sterili bine ascutiti se obtine o masa cu aspect
omogen
• Sub actiunea tripsinei si a agitarii celulele se separa ,iar
actiunea acestora se sfarseste in momentul in care solutia
se raceste.Separararea celulelor de tripsina se realizeaza
prin centrifugare
• Cu o pipeta Pasteur se recolteaza o cantitate de
suspensie de tesut embrionar si se intinde pe un
recipient de cultura
• Recipientul se lasa cu suprafat ccu suspensie in jos la o
temperatua de 37˚,timp de 30- 60 de minute.
• Dupa aceasta perioada se introduce mediul nutritiv,iar
recipientele sunt astuparte cu dop de cauciuc si incubate
intr-un termostat la 37˚
• Pe perioada incubarii aceste recipiente nu trebuiesc
miscate pe o perioada minima de 3-4 zile
 2.Tesuturi adulte
• Aceste tesuturi provin prin interventie chirurgicala:
-piele
-mucoase
-tesut uterin
-rinichi
-splina si ganglioni etc.
• Fragmentele se introduc in solutie salina cu antibiotice
,unde se lasa 2-3 ore si apoi se efectueaza etapele de
prelucrare preliminara identice cu ale embrionului.
 Controlul culturii
Acesta este de doua feluri:
• Controlul mediilor:
-control pentru contaminatii
-control al constantelor fizico-chimice
-control de eficienta
• Controlul morfologic:
a)Tehnici de microscopie fotonica:
-examinarea celulelor in stare vie la microscopul cu contras defaza
-examinarea preparatelor fixate si colorate
b)Tehnici de histoautografie
c)Tehnici de microscopie electronica
 Cultivarea virusurilor
Cultivarea virusurilor pe culturi celulare
• Virusurile pot fi izolate pe celule vii, receptive.
• Cultura celulară: sistem biologic in vitro alcătuit din celule izolate
vii, care îşi păstrează
• capacitatea de multiplicare şi nu se organizează în ţesuturi.
• Condiţii necesare pentru păstrarea în viaţă a celulelor din cultura
celulară:
• - condiţii aseptice
• - mediu nutritiv (mediu de cultură lichid ce conţine substanţe
nutritive, sursă de
• energie, factori de creştere, vitamine, sistem tampon, indicator,
antibiotice şi
• antifungice) – mediile comercializate Eagle, Hanks, M199
• - pH adecvat
• - temperatură constantă
• - atmosferă cu 10% CO2
• În funcţie de provenienţa celulelor, culturile
celulare se clasifică în:
• - culturi de origine animală sau umană
• - culturi de celule embrionare sau adulte
• - culturi de celule normale sau tumorale
• Culturile celulare primare sunt culturi
realizate direct din ţesuturile sursă.
• Liniile celulare stabilizate derivă din
culturile primare, se menţin în viaţă timp
nelimitat prin
• subcultivări.
 Realizarea culturilor primare din
tesuturi solide
• - se prelevă ţesutul sursă în condiţii aseptice
• - se fragmentează ţesutul în bucăţi de aprox. 1 mm3, se spală cu
soluţie salină
• tamponată (SST) pentru îndepărtarea sângelui
• - disocierea enzimatică a celulelor: tripsinizarea fragmentelor tisulare
în soluţie de
• tripsină 0,25% (enzimă proteolitică, desface legăturile peptidice) pe
agitator
• magnetic – desfacerea legăturilor intercelulare
• - colectarea celulelor izolate în vas colector – se face prin filtrare
pentru a obţine
• numai celule izolate
• - repetare tripsinizării până la epuizarea ţesutului, în timpul
tripsinizării vasul
• colector se păstrează la temperatura de 4°C pentru inactivarea
tripsinei
• centrifugarea suspensiei de celule izolate, îndepărtarea
supernatantului (tripsina),
• spălare cu SST, în final suspendarea celulelor în mediu nutritiv
• - controlul viabilităţii celulelor cu coloraţie vitală albastru de tripan (se
colorează
• celulele moarte) – pentru a se realiza cultura, 90% din celule trebuie să
fie vii)
• - numărarea celulelor, ajustarea lor la concentraţie de 300000
celule/ml, repartizare
• volume egale în flacoane de culturi celulare
• -2-
• - incubare în poziţie culcată
• - urmărirea formării culturii cu microscopul invers
• Culturi provenite din celule:
• - normale: celulele se ataşează de peretele flaconului, se multiplică
până acoperă
• peretele flaconului, realizează o cultură monostrat (fenomenul
inhibiţiei de
• contact)
• - tumorale: se multiplic şi după acoperirea suprafeţei disponibile,
cresc în mai multe straturi şi în suspensie
 Subcultivarea culturilor celulare

• După 5-7 zile de la realizarea culturii se epuizează

substanţele nutritive, sursele de energie, se
• acidifică mediul. Pentru menţinerea celulelor în viaţă,
acestea trebuie pasate, subcultivate. Se
• realizează prin versenizare. Celulele se detaşează de pe
peretele flaconului cu soluţie de
• EDTA (versen), se centrifughează, se spală cu soluţie
SST şi se resuspendează în mediu
• nutritiv. Se verifică viabilitatea celulelor, se numără
celulele şi se ajustează la concentraţia optimă. Se
repartizează volume egale în flacoane de cultură
celulară.
• Culturile primare realizate din celule normale adulte
pot fi subcultivate de câteva ori (4-6)
• după care celulele mor (apoptoză)
• Cele realizate din ţesuturi embrionare pot fi
subcultivate de mai multe ori (celule
• nediferenţiate), 60-80x, după care mor.
• Liniile celulare pot fi subcultivate nedefinit. Aceste se
obţin din ţesuturi tumorale (HeLa, KB,
• Detroit 6, etc) sau din culturi celulare efectuate din
ţesuturi normale care au suferit
• transformare malignă spontană (Vero). Liniile celulare
sunt bine caracterizate, se manevrează
• uşor, pot fi folosite pentru izolarea virusurilor.
 Inocularea suspensiilor virale în culturile
celulare, identificarea izolatelor
virale
• Se îndepărtează mediul nutritiv şi se introduce în flacon
suspensia virală pregătită în prealabil.
• După o incubare de 1 oră (penetrarea virusurilor în
celulele receptive) suspensia se
• decantează, se adaugă mediu de întreţinere (mai sărac în
substanţe nutritive decât mediul
• nutritiv, dar care permite supravieţuirea celulelor), se
incubează. În zilele următoare se
• urmăresc modificările survenite în cultura celulară.
• Identificarea izolatelor se face prin metode nespecifice şi
specifice.
• Metode nespecifice:
• - urmărirea efectelor citopatice (desprinderea celulelor de pe suprafaţa
pereţilor,
• rotunjirea celulelor, agregarea lor în ciorchine, formarea sinciţiilor)
• - detectarea incluziilor virale
• - hemadsorbţia – se foloseşte la detectarea replicării virale în cazul în care
virusul nu
• produce efect citopatic (virusul ifluenza): membrana celulelor în care se
replică
• virusul are structura modificată, hematiile adăugate aderă de acestea
• - interferenţa: se bazează pe faptul, că o celulă deja infectată cu un virus
nu poate fi
• infectată cu un alt virus – se foloseşte pentru detectarea virusurilor
neproducătoare
• de ecp
• - formarea plajelor
• - transformarea spontană
• - microscopia electronică
• Metode specifice
• - detectarea antigenelor virale prin reacţii antigen-anticorp
• - detectarea acizilor nucleici virali – reacţii de hibridizare, PCR
Izolarea virusurilor pe oul de
gaina embrionata