CURSUL NR.

3
LABORATORUL ÎN BOLILE
INFECŢIOASE
 OBIECTIVE

La sfârşitul cursului absolventul trebuie: să

cunoască rolul laboratorului în stabilirea
diagnosticului unei boli infecţioase şi
monitorizarea terapiei antimicrobiene şi să
descrie principalele metode utilizate în acest
scop
Diferenţierea bolilor şi stabilirea unui diagnostic pozitiv
se bazează pe trepiedul anamneză – examen clinic –
explorări de laborator şi paraclinice.

În prezent laboratorul dispune de numeroase teste,

unele mai simple, ieftine şi uşor de realizat, altele
complexe, necesitând personal specializat, timp
îndelungat şi costuri ridicate.

Informaţiile aduse de acestea pot fi decisive pentru

iniţierea antibioterapiei şi a măsurilor de limitare a
răspândirii unui anumit microb în comunitate.
În mod particulat în domeniul bolilor infecţioase
laboratorul ajută clinicianul în stabilirea
diagnosticului etiologic
prin identificarea unui anumit microorganism
a unor componente ale acestuia (antigene,
structuri genomice)
prin depistarea răspunsului organismului după
contactul cu acesta (diagnostic microbiologic şi
serologic)

După identificarea microorganismului cauzal pot fi

efectuate teste care să stabilească sensibilitatea
acestuia la medicamentele antimicrobiene.
Recoltarea probelor biologice trebuie să respecte
următoarele principii:

funcţie de sindromul identificat se vor recolta toate produsele biologice în care

este posibilă identificarea agentului microbian cauzal

recoltarea se va efectua astfel încăt să se evite contaminarea cu flora din

mediul înconjurător

probele vor fi recoltate pe căt posibil înainte de iniţierea antibioterapiei; dacă

aceasta a fost totuşi introdusă se va menţiona acest lucru în biletul de însoţire
a probelor

probele vor fi recoltate cât mai aproape de debutul bolii

examenele serologice presupun recoltarea de seruri perechi: o probă la
debutul bolii şi o alta după două săptămâni

probele trimise către laborator trebuie etichetate corect (nume, prenume,

salonul, numărul foii de observaţie, suspiciunea diagnostică, tipul de analiză
solicitată, data recoltării, eventual ora recoltării, riscul biologic funcţie de
microbul suspectat)

probele se trimit cât mai rapid către laboratorul de analize

 Identificarea microorganismului sau a componentelor
acestuia

Examenul microscopic permite evidenţierea unor bacterii,

virusuri, paraziţi sau fungi.

La microscopul optic se pot examina produse native sau

colorate

Există tehnici optice speciale

microscop cu câmp întunecat folosit pentru evidenţierea Treponemei pallidum

microscop cu ultraviolete ce permite identificarea microbilor după colorarea

acestora cu seruri fluorescente

Pentru microscopia electronică preparatele necesită

pregătiri speciale.
Imagine la microscopul cu camp
intunecat
Imagini la microscopul UV
La microscopul optice se pot observa:

detalii structurale: ex forma unor bacterii (coci,

bacili, spirili, vibrioni), dimensiunile acestora,
unele caracteristici structurale (aspect reniform,
prezenţa capsulei sau a unor cili, sporularea),
dispunerea acestora (in diplo, în grămezi, în
lanţuri, intra- sau extracelular)

afinitatea faţă de diferiţi coloranţi: ex. albastru de

metilen, Gram (Gram pozitivi / Gram negativi),
Ziehl-Nielsen sau alte tehnici speciale
Cultivarea microbilor urmăreşte izolarea şi
identificarea acestora şi, în unele cazuri, testarea
sensibilităţii la antimicrobiene.

Spre deosebire de microscopie cultivarea ne oferă date

despre viabilitatea germenilor patogeni.

Pentru bacterii se utilizează medii de cultură universale

(bulion, geloză simplă sau geloză-sânge) sau medii
speciale, selective, pentru identificarea unor anumiţi
patogeni (ex. mediul Lowenstein pentru micobacterii,
nediile MIU şi TSI pentru identificarea unor bacili
Gram negativi, etc). Mediul universal pentru
cultivarea fungilor este mediul Sabouraud.
Virusurile pot fi cultivate pe medii celulare diverse
(tehnică laborioasă, disponibilă doar laboratoarelor
de cercetare).

Tehnica necesită timp (creşterea bacteriilor se observă

după o incubaţie de 24 ore, unele necesitând o
perioadă mai mare – ex. bK – 21-30 zile).

Funcţie de produsul patologic cultivabil deosebim

hemocultura, bilicultura, urocultura, coprocultura.
Identificarea antigenelor structurale este o metodă
imunologică ce identifică componente microbiene
diverse; nu necesită existenţa unor microbi viabili.

Sunt disponibile o multitudine de teste, cele mai folosite

fiind latex-aglutinarea, contraimunelectroforeza,
imunofluorescenţa directă sau ELISA.
Poate fi folosită pentru toată gama de microorganisme.
Exemple de structuri identificabile: Streptococcus
pneumoniae – antigenul capsular, Salmonella typhi –
antigenul H flagelar, virusul hepatitic B - atg HBs,
Cryptococcus neoformans – antigenul capsular, etc.
Identificarea structurilor genomice poate fi făcută în
scopul identificării microbilor (determinare
calitativă) sau în scopul monitorizării evoluţiei bolii,
eventual în urma tratamentelor specifice aplicate
(determinare cantitativă). Evidenţierea unor gene de
rezistenţă la antibiotice poate fi utilă pentru
conducerea terapiei.

Alte metode: testul Limulus poate evidenţia

endotoxina bacililor Gram negativi; fermentarea
unor zaharuri în mediul de cultură poate fi utilă
pentru identificare; evidenţierea unor aminoacizi
sau a unor produşi de metabolism poate fi
demonstrată după aproximativ 7 zile pe mediul
Lowenstein, înainte de apariţia coloniilor bK.
Evidenţierea răspunsului gazdei la contactul cu un anumit
microb poate fi specifică (sinteza de anticorpi ) sau
nespecifică (modificări hematologice – leucocitoză sau
leucopenie, neutrofilie sau limfocitoză, incluziuni toxice
leucocitare -, apariţia unor proteine în contextul inflamaţiei
– proteina C reactivă, procalcitonina, presepsin,
interleukine proinflamatorii sau TNF, modificări metabolice
– scăderea pH-ului sau apariţia de nitriţi la nivel urinar ).
Dintre anticorpi importanţă practică au cei de tip IgM
(cu semnificaţia de infecţie acută) şi cei de tip IgG (cu
semnificaţia de contact în trecut cu un anumit
microorganism, infecţia putând fi vindecată sau
cronicizată).
Există o multitudine de teste pentru evidenţierea
acestor anticorpi – hemaglutinoinhibare,
hemaglutinare pasiva, contraimunelectroforeză, reacţie
de fixare a complementului, neutralizare, precipitare,
imunifluorescenţă directă, ELISA, etc).
În cazul în care nu se identifică subtipul anticorpilor,
pentru diagnostic se vor practica determinări
serologice perechi, la interval de două săptămâni,
semnificativă fiind creşterea titrului cu cel puţin patru
trepte.
În unele etape ale unor infecţii pot coexista la un
moment dat anticorpi de tip IgM cu cei de tip IgG.
Sinteza anticorpilor IgM are loc în medie la două
săptămâni (sau chiar mai mult, săptămâni/luni – ex. în
infecţia cu HIV sau cu virusul hepatitic C) după
contactul infectant, până la apariţia acestora nefiind
posibil diagnosticul pe baze serologice (perioada de
„fereastră” a anticorpilor).
La noul născut este posibilă evidenţierea unor anticorpi
de tip IgG de origine maternă, ce au traversat bariera
placentară, în acest caz diagnosticul fiind fals pozitiv;
de regulă, în această situaţie anticorpii dispar treptat în
perioada următoare.
La persoanele cu agamaglobulinemie testarea
serologică poate fi fals negativă.
Prin intradermoreacţii se poate testa susceptibilitatea
organismului la unele infecţii (ex. tuberculoză,
bruceloză, histoplasmoză); se bazează pe migrarea
leucocitelor la contactul cu un anumit component
microbian.
Nu se utilizează la persoane cu imunodepresie pe linie
celulară.
Rolul laboratorului în iniţierea şi conducerea
antibioterapiei

Prin teste de laborator poate fi evidenţiată

sensibilitatea microbilor la antibiotice (determinarea
fenotipului de sensibilitate, antibiograma); metoda se
bazează pe cultivarea germenului pe un mediu de
cultură (însămânţare prin „inundare”) şi punerea
acestuia în contact cu microdiscuri conţinând o
cantitate determinată dintr-un anumit antibiotic;
funcţie de mărimea zonei de inhibiţie a creşterii din
jurul microcomprimatului se stabileşte dacă microbul
este sensibil la antibioticul în cauză, sensibil funcţie
de concentraţie (sau intermediar sensibil), ori
rezistent.
Metoda se practică curent pe medii de cultură solide,
pentru bacterii şi fungi.
Există metode ce utilizează medii de cultivare lichide,
ce determină şi concentraţia minimă de antibiotic
necesară pentru inhibarea creşterii microbului (CMI)
sau pentru bactericidie (CMB).
CMI poate fi determinată şi pe mediile de cultură
solide cu ajutorul unor benzi de test impregnate cu
diferite concentraţii ale antibioticului de testat
(metoda E-test).
Pentru virusuri determinarea fenotipului de
rezistenţă este o metodă complexă şi scumpă.
Pentru bacteriile comune informaţiile privind
sensibilitatea acestora la antibiotice se obţin după 48
de ore.
În sânge sau alte lichide biologice se poate determina
nivelul de antibiotic (nivelul inhibitor sau bactericid);
metoda este laborioasă, necesită timp şi se practică
doar în cazurile complicate sau în scop de cercetare.
Funcţie de informaţiile obţinute clinicianul poate alege
un anumit antibiotic, poate opta pentru o anumită doză
sau o poate modifica în aşa fel încât distrugerea
microbiană să fie maximală la locul infecţiei.