Antigene si anticorpi

Principiul
metodei IHC
Panelul minim de
anticorpi
Dr. Mihai Ceausu

Nu este Salvador Dali

 Istoric
• 1941 - Coons et al. - tehnica imunofluorescentei
• 1970 - L. Sternberger - metoda PAP (a complexelor imune
circulante)
• 1974 - Taylor & Mason - tehnica imunoenzimatica
• 1981-1983 - Hsu et al. - metoda ABC, modificata de Bussolati
& Gugliotta
• 1996 - DAKO En Vision TM Systems - metoda dextranului
• 2000 - metoda amplificarii cu tiramina (Sigma) - dupa Kerstens
et al. (1995)
 Antigenul
Ag este orice substanta de origine exo- sau endogena, capabila sa declanseze un
raspuns imun care, consta din stimularea si proliferarea celulelor antigen specifice
si sinteza unor molecule de recunoastere (anticorpi sau receptori) ce au capacitatea
de a se combina specific cu antigenul inductor.
Proprietatile antigenelor
• Imunogenitate =
capacitatea Ag de a
declansa raspunsul imun
• Specificitate =
capacitatea Ag de a
reactiona strict cu
produsele sistemului
imun (Ac) sau Ac
preformati

Dubla reactie IHC pentru lanturi k si 

intr-un folicul limfatic reactiv
(secventiere HRP / APAP)
PanCK (KL1 vs MNF116)
HMFG vs EMA

KL1
MNF116 MTS

HMFG - CDI
EMA - TD
 Anticorpul in imunohistochimie
• Este o molecula ce se
combina specific cu un Ag
pe baza unei recunoasteri
3-D a epitopului antigenic
(mecanism “cheie -
broasca”)
• Fiecare Ag nativ are mai
multi epitopi recunoscuti
de Ac diferiti
Dubla coloratie Cromo / PgR in CDI
cu diferentiere neuroendocrina
 Structura generala a anticorpilor
Fab = fragment antigen
binding; rol in recunoasterea
si legarea Ag la nivelul
situsului combinativ

Planul structural unic al oricarei

molecule de Ig este unitatea tetra- Fc = fragment crystalisable;
catenara, formata din 4 lanturi : 2 rol in specificitatea
grele (H = heavy chains) si 2 antigenica si activarea
usoare (L = light chains), soli- complementului
darizate prin punti disulfurice
Ac monoclonali versus Ac policlonali

Acm HPV

Acp BPV

• Acm este un Ac idiotipic specific pentru un singur

epitop produs de o clona de plasmocite hibride
• Acp este un antiser ce contine specii diferite de Ac
cu afinitati variabile, in cursul unei imunizari
 Acm versus Acp
Anticorpi monoclonali Anticorpi policlonali
Specificitate (+) Sensibilitate (+)
Reactie de fond (-) Reactie de fond (+)
Nu coloreaza celule Coloreaza celule
suplimentare suplimentare
Markeaza putine structuri Markeaza mai multe
histologice asemanatoare structuri histologice
asemanatoare
Proprietatile Ac
Specificitatea
Afinitatea si aviditatea
Echivalenta
Specificitatea si reactia incrucisata

• Este o reactie de cuplare a Ag cu Ac printr-un

mecanism de tip “cheie-broasca”, pe baza
complementaritatii epitop-paratop, ale caror
suprafete se adapteaza reciproc
 Afinitatea
paratop • Afinitatea evalueaza o
reactie de tip epitop-
epitop paratop sau intre Fab
si haptena

• Afinitatea mare
implica o adaptare
Atractie inalta Repulsie inalta mare a suprafetelor
(adaptare mare) (adaptare mica) Fab - epitop

Afinitatea =  Fa + Fr;
Fr Fa - forta
de atractie, Fr -forta de respingere
 Aviditatea
• Aviditatea evalueaza o
reactie de tip Ag - Ac
• Aviditatea implica o serie
de forte de interactiune
moleculare non-covalente
• Se supune legii actiunii
maselor
Ag + Ac  AgAc
Legea actiunii maselor :
[ Ag ][ Ac ]
K 
K = constanta de echilibru [ AgAc ]
 Echivalenta
• Cand intr-un sistem este
Retele Ag-Ac introdusa o cantitate
cu precipitare
suplimentara fie de Ag,
fie de Ac, echilibrul va
fi deplasat in sensul
cresterii cantitatii de
complexe Ag-Ac

Curba de precipitare in reactia

Ag - Ac (Heidelberger, 1930)
Recunoasterea unei molecule antigenice purtatoare a mai multor D-Ag diferiti
este cu mult mai specifica prin interactiunea cu un ser policlonal sau un
amestec proportionat de Acm diferiti, decit interactiunea cu un singur Acm !
 Imunohistochimia (IHC)
• Reprezinta combinatia dintre 2 stiinte :
imunologia si histochimia, avind ca scop
evidentierea proprietatilor antigenice ale unor
substante intr-un tesut utilizind Acm sau seruri
polireactive.
• Vizualizarea substantelor antigenice se poate
face atit la nivel tisular, cit si la nivel celular si
subcelular, pe preparate la gheata sau parafina.
 Tehnica IHC - principiul metodei
• Se lucreaza cu Acm, de care sunt legate una sau mai multe
molecule enzimatice, ce catalizeaza transformarea unui substrat
incolor intr-un produs de reactie colorat. Enzima este cuplata
covalent cu portiunea Fc a Ac; pe ea se plaseaza substratul
cromogenic.
• Enzimele utilizate sunt : - peroxidaza
- fosfataza alcalina
• Substratele folosite sunt : - DAB pentru peroxidaza (brun)
- “fast red” si “fast blue” pentru fosfataza alcalina
Metoda ABC (dupa Hsu et al., 1981,
modificata de G. Bussolatti, 1983)
CDI - EGFR (ABC)
 Panelul minim de Ac necesar
• Citokeratina
• Vimentina
• Desmina / actina
• Neurofilamente
• Gliofibrile (GFAP)
• CLA - L26 / UCHL1
• S-100
• F VIII
• TB-01
• Ki-67 / PCNA
Citokeratina - filament intermediar ; CK
1 20 (catalogul Moll); Pan CK : KL1 /
MNF116

ADK colon
 Vimentina

Melanom Sarcom
Desmina / actina

PAS
 NFT = neurofilamente totale
GFAP = proteina gliofibrilara acida

NFT - tesut nervos normal GFAP in astrocitom

CLA = CD45; L26  CD20; UCHL1 
CD45RO

CLA

L26 UCHL1
 S-100

S-100 in histiocite
S-100 in melanom
 Markeri vasculari : F VIII, CD31, CD34
FVIII vase peritumorale CD31

CD34 tesut granulatie

CD34 ADK gastric

 TB-01 / Leu 7 (CD57)

Celule NK

Hiperplazie neuroendocrina
 PCNA / Ki-67 (MIB 1)
PCNA - CDI

p53

Ki-67
• “Nu orice micrograf este un histolog şi nu orice histolog este un
histopatolog; histopatologul este totodată histolog şi medic […]
Histodiagnosticul este un act medical. El este o CONSULTATIE
MEDICALA în care responsabilitatea histopatologului este grav
angajată, cu atât mai mult, cu cât expertiza sa este cerută în
ultimă instanţă şi comandă terapeutică …
• Medicul histopatolog ar trebui plătit în raport cu serviciile pe
care le face.”
• (Masson, Histopatologie)