1

¿Qué es un bacteriófago?
Son parásitos intracelulares estrictos, solo se pueden replicar en el
interior de bacterias.

Fig. 1 Estructura de un bacteriófago T4 .

2
 Bacteriófagos

• Consisten fundamentalmente
Cabeza
icosaédrica
de material genético y
(Cápside) proteínas.
Cuello

• Cada “especie” de bacteriófago

Cola
infecta exclusivamente a una
Extremidades fibrosas
especie bacteriana y en
muchas ocasiones tan solo a
Espícula
algunas de sus variedades.

Fig. 2 Estructura de un bacteriófago típico. 3

Fuente: Miguel Ángel Cevallos. Revista ¿Cómo ves?
Su genoma puede componerse de DNA o de RNA el cual puede ser de
cadena doble o de una sola cadena.

• En muchas ocasiones
contienen bases modificadas
para protegerse de las
endonucleasas del huésped.

Fig 3. Cápside y genoma de un bacteriófago.

4
Fuente: Allan M. Campbell. Bacteriophages
 Conceptos

• Amplitud de huésped: Tipos diferentes de

bacterias que pueden ser infectadas por
un mismo fago.

• Tamaño de estallido: Número de fagos

que se libera por cada célula
monoinfectada.
Fig 4. Lisis bacteriana por fagos.

5
 Multiplicidad de infección (MOI)
• Es la relación entre el número de fagos y el número de bacterias en la mezcla de
infección.
𝐔𝐅𝐏
𝐌𝐎𝐈 =
𝐔𝐅𝐂

𝟕.𝟔𝑿𝟏𝟎𝟕 𝑼𝑭𝑷/𝒎𝑳
𝐌𝐎𝐈 = = 𝟎. 𝟏UFP/UFC
𝟕.𝟔𝑿𝟏𝟎𝟖 𝑼𝑭𝑪/𝒎𝑳
𝟕.𝟔𝑿𝟏𝟎𝟖 𝑼𝑭𝑷/𝒎𝑳
𝐌𝐎𝐈 = = 𝟏 UFP/UFC
𝟕.𝟔𝑿𝟏𝟎𝟖 𝑼𝑭𝑪/𝒎𝑳
𝟕.𝟔𝑿𝟏𝟎𝟖 𝑼𝑭𝑷/𝒎𝑳
𝑴𝑶𝑰 = = 𝟏𝟎UFP/UFC
𝟕.𝟔𝑿𝟏𝟎𝟕 𝑼𝑭𝑪/𝒎𝑳

6
Propagación fágica: Amplificación o multiplicación del número de
bacteriófagos presentes en la muestra.

Lisado fágico: Resultado de la propagación fágica sin los restos

celulares.

7
 Estallido simple
La finalidad de éste experimento es que en cada tubo con cultivo contenga una sola
célula infectada. Después de la lisis completada, todas las partículas fágicas
encontradas en un tubo resultan de una sola bacteria lisada. Para conseguir esto, el
cultivo de bacteria se debe infectar con una MOI menor a 1.0.

8
 Crecimiento en un solo paso
Liberación: Lisis de la
bacteria, virus
extracelulares.

Latencia: Aumento
en número de virus
intracelulares.

9
Fig. 5 Curva de crecimiento en un solo paso.
 Lisis artificial

10
Fig. 6 Lisis artificial.
Clasificación por la forma
Bacteriófago P2

Bacteriófago T4 Bacteriófagos
de DNA doble
Con cola cadena
Bacteriófago 

Bacteriófago T7
11
Clasificación por la forma
Bacteriófago PRD1

Bacteriófagos de
DNA doble cadena

Bacteriófago PM2.
• Poliédricos

Bacteriófago de DNA de
cadena sencilla

Bacteriófago 2 12
 Clasificación por la forma
Bacteriófago MV-L1

Bacteriófagos
de DNA de
Filamentosos cadena
sencilla

Inoviridae

Bacteriófago M13 13
Ciclo de multiplicación de fagos líticos

14
 Profago
Ciclo de
multiplicación de
fagos temperados

15
 Ciclo de multiplicación de fagos no líticos

16
Fig. 10 Infección de Escherichia coli por el bacteriófago M13.
 Bacteriófagos que se usarán en la práctica

• Virulentos
• Lítico: Fago T4.
Fago M13
• No lítico: Fago M13.

• Temperado
Fago T4
• Fago lambda. (Puede seguir
ciclo lítico o ciclo
lisogénico)

Fago λ
Fig 11. Tipos de bacteriófagos de interés. 17
 Bacteriófago T4

Morfología: Cabeza icosaédrica

elongada y cola contráctil.
Familia: Myoviridae.
Receptor: Lipopolisacárido.
Ciclo de infección: Lítico.
Ácido nucleico: DNA lineal de
doble cadena.
Parámetros de multiplicación:
>Tamaño de estallido 200
> Periodo de latencia de 23 min.

18
Fig. 12 Bacteriófago T4.
 Placa lítica de bacteriófago T4

Forma circular.

Placas claras.

1-2 mm de diámetro.

Bordes regulares.

19
Fig 13 Placas claras de un bacteriófago T4.
 Bacteriófago M13
Fig. 14 Bacteriófago M13.
Características
Morfología: Bacteriófago filamentoso.
Familia: Inoviridae.
Receptor: Pilina
Ciclo de multiplicación: Modelo del
círculo rotador.
Ciclo de infección: No lítico, se libera de
la célula sin lisarla.
Ácido nucleico: DNA monocatenario,
circular.
Parámetros de multiplicación :
>Tamaño de estallido 100
>Periodo de latencia 30 min 20
 Placas turbias del bacteriófago M13

Forma circular.

Placa turbia.

1-2 mm de diámetro.

Bordes difusos.

Fig. 15 Placa turbia del bacteriófago M13. 21

 Bacteriófago ʎ

Morfología: Cápside icosaédrica y

cola no contráctil.
Familia: Siphoviridae.
Receptor: Lam b.
Ciclo de infección: Lítico –
lisogénico.
Ácido nucleico: DNA lineal de
doble cadena.
Parámetros de multiplicación:
>Tamaño de estallido 100
>Periodo de latencia 30 min.

Fig. 16 Bacteriófago ʎ
22
 Placa de bacteriófago ʎ

Forma circular.

Turbias (forma de huevo

estrellado).

2-4 mm de diámetro.

Bordes regulares.

Fig. 17 Placas del bacteriófago lambda. 23

 Cuantificación de bacteriófagos

Dilución en placa: Consiste en

inocular una monocapa de
bacterias y ponerlas en contacto
con el virus.

UFP= Unidades formadoras de placa.

1 1
𝑈𝐹𝑃 = 𝑁𝑜. 𝑝𝑙𝑎𝑐𝑎𝑠 𝑥 x
𝐷𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖𝑜𝑛 𝐴𝑙í𝑐𝑢𝑜𝑡𝑎

24
Fuente: Frontiers in microbiology
 ARTÍCULO
“Propiedades estructurales y biológicas de
Mycoplasmavirus MVL3: Una interacción
inusual virus-procarionte”
Klaus Haberer, Gunther Klotz, Jack Maniloff, Albretcht K. Kleinschmidt.

25
 Objetivos generales
• Determinar las características estructurales e infecciosas del bacteriófago MVL3 en
Acholeplasma laidlawii.
• Analizar la multiplicidad de infección en Acholeplasma laidlawii.

26
 Materiales y métodos
Medios y Reguladores

● Caldo Triptosa (20g de triptosa, 10g de glucosa y 10mL de suero fetal

bovino)
● Agar Triptosa (20g de triptosa, 10g de glucosa y 10mL de suero fetal
bovino)
● Tris-EDTA NaCl pH 8.0 (Tris-hidrocloruro 0.01M, EDTA 0.001 M, NaCl
0.001M).

Células y Virus

● A. laidlawii 1305.K2 (Eficiente en UFP)

● Virus de Micoplasmas MVL3
27
• Se aislaron 3 diferentes tipos de Mycoplasmavirus, de los cuales solo se trabajo
con el virus MVL3.

Fig 20. Microscopía electrónica de Acholeplasma laidlawii. Las células están teñidas con
acetato de uranilo y citrato de plomo.
28
Células y virus

29
 El virus se veía como
CsCl una banda cerca del
Ajustar hasta gradiente
1.48 g/cm3

40000 rpm
Extracción
de fase
superior Virus almacenado a
4°C con CsCl
Rendimiento= 1013 a
5x1014 Unidades
infecciosas/L de
cultivo.

30
 Determinación de título celular

Sonificación Los agregados celulares

que el microorganismo
forma son dispersados
“agitando” el cultivo en un
baño ultrasónico.

Cultivo en Agar
triptosa a 37°C/4
días.

Tinción de
Dienes.
Conteo de
colonias y
determinación del
título celular.
31
 Determinación de título viral

0.1 mL
agar 0.7%
en TES a
45°C 37°C / 24h

0.1 mL muestra
viral + 0.1 mL de Conteo de placas líticas
Agar triptosa
cultivo celular + 1 y determinación de
mL de caldo UFP.
triptosa 45°C.

32
 Adsorción del virus
Objetivo: Determinar la tasa de adsorción de MVL3 y compararlo con el número de
colisiones virus-células.

MOI= 1

Se toman
muestras cada
Determinación
5 minutos
de UFP

A. laidlawii
(1:5) Filtro de
membrana de
0.2 μm 33
Estudios estructurales
Objetivo: Determinar la estructura de MVL3, así como el peso
molecular de su DNA en base a su longitud.

34
Microscopía electrónica. Tinción negativa

Ácido
MVL3 fosfotúngstico 2%
(pH 7)

Microscopía
electrónica

35
Cabeza
poliédrica
Microscopía
Cola corta
electrónica
Tinción negativa

Fibras Resultados

Fig. 21 Microfotografía electrónica de

tinción negativa con ácido fosfotúnsgico
a 50,000x del virus MLV3.
36
 Medición del DNA
Dilución 1:10

SDS 1%
Dializado
Agitado Acetato de
suave
con TES
amonio 0.5 M

MVL3 Acetato de 50
10^11 UFP/mL uranilo 5x10- μL
4 M en
Etanol 50%

Medición por Acetato de

proyección de los amonio 0.25
negativos con una M
computadora Wang 37
2200
Medición del DNA

Resultados

Fig. 22 Histograma de mediciones del DNA de

MVL3. Las moléculas de DNA aisladas son
lineales, no se aisló ninguna circular. De las
mediciones de 93 moléculas se calculó un
peso molecular de (26 +/- 0.6)x106.
38
 Conclusiones

• Las cápsides de virus son poliédricas. (60nm)

• Los viriones tienen una cola corta (20nmx10nm) adherida a un cuello (8nmx16nm)
que frecuentemente tiene fibras.
• Las moléculas de DNA de MVL3 son lineales con un peso molecular estimado de
(26 + 0.6) x 106 Da.

39
Crecimiento en un solo
paso
Objetivo: Describir el crecimiento de MVL13 después de la infección en
tiempos cortos.

40
 Crecimiento de un solo paso

MVL3 a MOI de 0.1

Se toman
37°C 30 min muestras a
diferentes
tiempos

A. laidlawii (1:5)
El cultivo
infectado se
diluyó 106 veces
en caldo triptosa Se determinan las
UFP para cada
muestra
41
Crecimiento en un solo
paso

Resultados

Fig. 23 Curva de crecimiento en un solo paso al

tiempo cero. Las células y los virus fueron
mezclados con una multiplicidad de infección de 0.1
e incubados a una temperatura de 37°C.

42
 Conclusiones

• MVL3 tiene un periodo de latencia de 90 minutos.

• La liberación del virus continúa por más de 5 horas.

43
Crecimiento a tiempo
prolongado
Objetivo: Determinar el tiempo de liberación de las partículas
fágicas.

44
 Crecimiento a tiempo prolongado
MVL3 a MOI de 10

Se toma una muestra cada

30 min. durante las primeras
4 horas, posteriormente cada Se determina el valor
2 horas. Esto durante 42 de UFP de cada
horas. muestra.

A. laidlawii (1:5)

*A las 12 horas de iniciado el procedimiento, se comienza otro

cultivo exactamente igual.
45
Producción del virus a
tiempos prolongados

Resultados
Fig. 24 Curva de crecimiento a tiempo
prolongado las células fueron infectadas con
una multiplicidad de infección de 10 y
trabajado como el ensayo descrito en curva
de crecimiento en un solo paso.

46
 Conclusiones
• *A partir de las 10 horas las células dejan de lisarse y por eso el titulo fágico es
constante.
• La liberación del bacteriófago continua alrededor de 10 a 15 horas.
• La producción promedio de virus fue de alrededor de 120 por cada célula.

47
 Lisis artificial
Objetivo: Determinar la duración del periodo de eclipse y demostrar
la existencia de partículas infecciosas durante este periodo.

48
 Lisis artificial
Determinación de
MVL3 a MOI de 0.1
UFP

37°C 30 min Tomar

muestras por
duplicado a
Triton X-100
diferentes
concentración
tiempos
final de 0.1%
A. laidlawii (1:5) Dilución centesimal
en caldo triptosa

Dilución de 104 a 105 veces 49

 Lisis artificial

Resultados

Fig. 25 Lisis artificial de MVL3.

Células sin lisar (O).
Células tratadas con Tritón X-100. (•)

50
 Conclusión

• Las partículas de virus maduras se encuentran a partir de los 70

minutos de infección.

51
 Estallido simple
modificado
Objetivo: Determinar el número de fagos que se libera por cada
bacteria infectada (Tamaño de estallido).

52
Experimento de estallido simple modificado
MVL3 a MOI de 1

x100
Determinación de UFP
después de 8 horas

1 mL
30 min

x100
A. laidlawii (1:5) Determinación de UFP
después de 24 horas
Dilución 108 (volumen
final de 200mL) 53
1 mL
 Estallido
simple

Resultados

Figura 26. Distribución de los datos

de los experimentos de estallido
simple.

54
 Conclusión

• El tamaño de estallido varia por cada célula monoinfectada y es independiente del

tiempo.

55
Cinética de estallido
simple
Objetivo: Confirmar el tamaño de estallido durante un periodo
comprendido.

56
Cinética de estallido simple

Jeringa con caldo

triptosa

Filtros de 0.2 μm,

inoculados con 0 ó
una célula
infectada.
1 mL de cultivo
celular

Jeringa vacía

57
 Cada vez que
se obtiene una
Se hace pasar 1 muestra se
mL de caldo a hacen pasar 5
través del filtro mL de caldo
a las 3, 8 y 24 para eliminar
horas después restos de virus
de la infección. libres.

A las
muestras de 1
mL obtenidas
se les
determina
UFP.

58
Tabla. 5 Filtros para la cinética de estallido simple.

59
 Conclusión
• La tasa de liberación del virus de células individuales es altamente
variable y es independientes del tiempo.

60
Viabilidad de células
infectadas por el
bacteriófago MVL3
Objetivo: Analizar si la viabilidad de la célula hospedera influye sobre
la producción del virus.

61
Viabilidad de células infectadas por MVL3

Se tomaron
muestras a
diferentes
tiempos.
30 min, 1 hora, 9
horas.
MOI 10
K2

37 ºC/9 horas

UFC

62
 Viabilidad de las células
infectadas con MVL3

Resultados

Células sin infectar (O)

Células infectadas MOI: 10 (•)

Figura 27. Viabilidad de las células infectadas con MVL3.

63
 Conclusión

• Una vez infectada una célula ya no puede ser considerada como

una unidad formadora de colonia.

64
 Práctica No.4 “Aislamiento de Bacteriófagos
de Fuentes Naturales”
Objetivos:

• Conocer algunos aspectos de la metodología empleada en el trabajo con

bacteriófagos.
• Establecer algunas propiedades de las partículas fágicas que permiten su
identificación.
• Aislar bacteriófagos a partir de muestras de aguas negras.
• Determinar títulos y ciclos de multiplicación de los fagos presentes en la muestra
de agua, con base en su morfología de placa.

65
 Materiales
Medio Composición

2YT Triptona (16g), Extracto de levadura (10 g), NaCl (10g)

Luria (L) Triptona (10 g), Extracto de levadura (5g), NaCl (10g)

Agar Lambda (λ) Triptona (10 g), NaCl (10 g)

Agar blando Agar (7g)

Agar lambda blando Triptona (10 g), NaCl (10 g)

Agar (7.5 g)
66
 Cepa Genotipo y/o fenotipo

Escherichia coli W3110 F- λ-, rph-1, sup-

Escherichia coli B 837 Silvestre

glnV44, thi-1, Δ(lac-proAB), Δ(mcrB-

Escherichia coli TG1 hsdsSM)5,(rk-mk-)/F,traD36, lac Iq,lacZΔM15,
proAB+

Bacillus subtilis SB19 Silvestre

Salmonella typhimurium LT2 Silvestre

Staphylococcus aureus Silvestre

Klebsiella pneumoniae Silvestre

67
a) Preparación de las cepas indicadoras.

Sembrar una asada

 Escherichia coli
silvestre
 Escherichia coli TG1 Incubar a
 Bacillus subtilis SB19 37ªC x 18 hrs
 Salmonella sin agitación
typhimurium LT2
 Klebsiella pneumoniae 5ml de
 Staphylococcus aureus medio L

68
b) Tratamiento de las muestras. (Día 2)

Esterilizar por filtración

5 ml del filtrado

Agitar
Obtener 10 ml
Muestra de de filtrado claro
aguas negras Recoger
filtrado en
Filtrar a través de Jeringa acoplada a un tubo estéril
papel filtro y varias portafiltro con una
capas de gasas. membrana de
nitrocelulosa

69
Prueba de gota modificada

0.1mL
0.1
Agar
mL
blando
fundido vaciar

Del filtrado
en tubo Cepa
estéril indicadora
El proceso se
realiza por
cada cepa
indicadora
70
 B. Diferenciación de fagos temperados, virulentos y virulentos no
líticos por morfología de placa

0.1mL Escherichia coli

Realizar 0.1 vaciar

diluciones mL
Agar x2 Incubar las cajas
del lisado del λ blando
Dejar
a 37 ºC x 18 hrs
solidificar
bacteriofago lambda
fundido

10-4 10-5

71
 B. Diferenciación de fagos temperados, virulentos y virulentos no
líticos por morfología de placa

Escherichia coli
0.1mL
0.1
mL vaciar
Realizar diluciones del Dejar
lisado del bacteriofago Incubar las cajas
T4 solidificar
a 37 ºC x 18 hrs
Agar x2
blando
fundido
Luria
10-4 10-5

72
B. Diferenciación de fagos temperados, virulentos y virulentos no
líticos por morfología de placa

0.1mL Escherichia coli TG1 vaciar

0.1mL

M13 x2 Incubar las cajas a

Dejar
Agar 37 ºC x 18 hrs
solidificar
blando
fundido

10-4 10-5

73
 C. Determinación de la amplitud de huésped de los bacteriófagos T4, λ y
M13
Cortar una punta de
micropipeta al
diámetro de las
colonias
seleccionadas
Seleccionar tres
placas líticas
aisladas y con la
misma morfología
0.1 ml
 Escherichia coli silvestre cultivo de
 Escherichia coli TG1 18 hrs. Colocar
 Bacillus subtilis SB19 una gota
 Salmonella typhimurium LT2 37ºC
 Klebsiella pneumoniae 18-24 hrs.
solidificar
 Staphylococcus aureus
Agar fundido
Registrar los resultados 74
 Bibliografía
• Libro electrónico Smith K. M. introduction to Virology, editorial Chapman and Hall, New
York, (1980), pp 86-88
• Libro electrónico Madigan Michael T., Martinko John M., Dunlap Paul V. ,Clark David P.,
Brock Biología de los microorganismos 12ª edicion, Editorial Pearson Addison Wesley,
(2009) pp 290-292
• Lehninger. Principios de Bioquímica. 4ª ed.Nelson D. y Cox, M. Editorial Omega (2005) 1
vol.
• Neyoy, Christian (Virus. Estructura, clasificación y replicación) Mexico, marzo 2014.
Blogspot. http://apuntesbiologiamol.blogspot.com/2014/03/los-virus-como-modelo-de-
estudio-de-los.html
• Campbell, Alan (Bacteriophages, c.123) Estados Unidos. Asmscience.
http://www.asmscience.org/files/Chapter_123_Bacteriophages.pdf

75