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COLONIAS
Pruebas de Identificación
rápidas
1.Prueba de la catalasa
2.Prueba de la coagulasa
3.Prueba de PYR
4.Prueba de oxidasa
Pruebas de Identificación para
Cocos Gram +
1. DNasa
2. Prueba del manitol salado
3. Bilis esculina
4. CAMP
5. Hidrólisis del hipurato
6. Voges –Proskauer
1. Disco de Optoquina
2. Disco de novobiocina
3. Disco de Bacitracina
catalasa
Prueba de la catalasa
Fundamento: Detecta la presencia de la enzima
catalasa.
Procedimiento: En portaobjetos colocar sobre una
colonia unas gotas de H202 3 %.
H202 H20 + 02
Liberación de burbujas rápida y sostenida indica la
producción de oxígeno molecular = prueba (+)
Consideraciones:
No Agar sangre (peroxidasa en los eritrocitos).
coagulasa
Prueba de la coagulasa
Fundamento: Detecta un factor de agregación “clumping factor” en la
superficie de la bacteriana.
Procedimiento: se coloca una colonia sospechosa de pertenecer a
una especie de Staphylococcus y se emulsifica en una gota de
plasma de conejo.
Interpretación: “arracimamiento” bacteriano en 1 minuto = prueba
(+).
Si el resultado es negativo ensayar la producción de coagulasa en
tubo.
Consideraciones:
Utilizar plasma con
EDTA y no citratado, ya que organismos capaces de metabolizar el
citrato (Enterococcus spp.) pueden dar resultados falsos (+).
Las pruebas (-) luego
de 4 hs de incubación a 35ºC, dejar a temperatura ambiente y leer
luego de 18-24 hs a fin de evitar la fibrinólisis que producen
algunas cepas al ser incubadas en forma prolongada a 35ºC.
Prueba de PYR
Prueba del PYR:
Fundamento: detecta la enzima pirrolidonil arilamidasa se utiliza
como sustrato el reactivo L-pirrolidonil- beta-naftilamida (PYR), para
la identificación rápida de enterococos.
Procedimiento: Realizar un alto inóculo (2 MacFarland) e introducir
un disco de PYR.
Tiempo y Tº de incubación: 30 minutos a 35º C.
Tiempo de lectura: 5 minutos.
Interpretación:
Disco rosado o rojo (+)
Disco y/o solución amarillo a incoloro (-).
Consideraciones: Algunas especies de Staphylococcus y los
estreptococos del grupo A dan, también, una prueba positiva.
DNAsa
Prueba de la DNAsa
Fundamento: El S. aureus produce una DNAasa
termoestable que hidroliza DNA. La producción de
DNAsa puede determinarse incorporando ácido
desoxirribonucleico (DNA) en agar nutritivo .
Consideraciones:
La alta concentración de sal inhibe otros microorganismos excepto
enterococos (por lo tanto usar la placa para identificación, no para
aislamiento).
Bilis Esculina
Prueba de la bilis-esculina:
Fundamento: Se basa en la capacidad de ciertas bacterias
(estreptococos del grupo D) para hidrolizar la esculina en presencia
de 1-4% de sales biliares.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en la superficie de
un pico de flauta. Incubar 24 hs.
Interpretación: La beta glucosidasa escinde la esculina en glucosa
y esculetina. Esta ultima es soluble en el medio y forma un
complejo de color negro con Fe 3+ .La hidrólisis de esculina se
observa como un oscurecimiento del medio (color negro) en 24 hs
de incubación a 35ºC, raramente se requieren 48 hs de incubación
hasta que la hidrólisis sea aparente.
Consideraciones: Es importante que el medio contenga 40% de
bilis, ya que algunos productos contienen menos cantidad lo que
lleva a confundir algunos estreptococos viridans con enterococos
Prueba de CAMP
Fundamento: Los estreptococos grupo B secretan el factor CAMP
que interactúa con la ß-hemolisina secretada por una cepa ß-
hemolítica de S. aureus (ATCC 25923) lo que causa un
acrecentamiento o sinergismo de la hemólisis.
Procedimiento: En placa de agar sangre sembrar una estría de la
cepa de S. aureus y perpendicularmente a ésta (lo más cerca
posible, sin llegar a tocarla) sembrar la cepa de estreptococo en
estudio.
Tiempo y Tº de incubación: Incubar 24 hs a 35ºC en aerobiosis
(en CO2 aumentan los falsos positivos).
Interpretación: El sinergismo se observa como un área de ß-
Hemólisis en forma de “punta de flecha” en la zona
de desarrollo más cercana a ambas estrías.
Prueba de CAMP
Prueba del hipurato de sodio
Fundamento: Ciertas cepas son capaces de hidrolizar el hipurato
de sodio. La producción de hipuricasa resulta en la hidrólisis del
hipurato de sodio con la formación de benzoato de sodio y glicina.
Procedimiento:
Inocular un tubo con medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 24 hs a 35ºC. Centrifugar. Pipetear 0.8 ml
el sobrenadante. Agregar 0.2 ml de cloruro férrico 7%.
Inocular un tubo con 0.4 ml de medio hipurato de sodio con el
microorganismo. Incubar 2 hs a 35ºC. Agregar 0.2 ml de Ninhidrina.
Interpretación:
La formación de un precipitado denso y persistente por 10 minutos
= prueba (+) Benzoato de sodio
La aparición de un color púrpura profundo = prueba (+) glicina.
Hidrólisis de hipurato
Prueba de la susceptibilidad a
la Novobiocina
Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la
novobiocina.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en agar Mueller
Hinton según técnica de Kirby-Bauer, utilizando discos de
Novobiocina (5 µg).
Interpretación: Sensible: inhibición del desarrollo con un diámetro
mayor o igual a 16 mm
Staphylococcus R
Micrococcus S
Consideraciones:
Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35º
Prueba de la Bacitracina:
Fundamento: Se basa en que ciertas bacterias son sensibles a la
bacitracina.
Procedimiento: Se inocula el microorganismo en AS según técnica
de Kirby-Bauer utilizando discos de Bacitracina (0.04 U).
Interpretación: Sensible: Cualquier zona de inhibición del
desarrollo.
Consideraciones: Kirby Bauer (Difusión en disco)
Inoculo sin incubación previa
Tiempo de lectura: 18 a 24 hs.
Tº de incubación: 33º a 35º en CO2
Recordar que el uso de discos de Bacitracina en forma directa en
las placas primarias de cultivo puede dar como resultado un 40% a
50% de falsos negativos.
Prueba de la Bacitracina
Prueba de la optoquina
Pruebas de Identificación para
enterobacterias
1. Prueba OF
2. Prueba de la oxidasa o citocromooxidasa
3. TSI
4. SIM (Sulfhídrico- Indol- Movilidad)
5. Rojo de metilo - Voges –Proskauer
6. ONPG (O-nitrofenil-b-galactopiranosido)
7. Citrato
8. Ureasa
9. Fenil-alanina-desaminasa
10.Descarboxilasas
Oxidasa
NEG POS
CITOCROMOOXIDASA O
PRUEBA DE LA OXIDASA
Fundamento: El sistema citocromooxidasa, se halla en
microorganismo aerobios, microaerófilos y anaerobios facultativos.
(-) (+)
FENIL-ALANINA-DESAMINASA: