PROGRAMUL NAŢIONAL DE SUPRAVEGHERE ŞI CONTROL AL INFECŢIILOR

NOSOCOMIALE ŞI MONITORIZARE A UTILIZĂRII ANTIBIOTICELOR ŞI A

ANTIBIOTICO-REZISTENŢEI

Interpretarea antibiogramelor in

sistem automat
Autor Dr. Mariana Buzea

Coordonator
Prof. Dr. Alexandru Rafila
PREAMBUL: UNDE NE AFLAM?

Procese
Financiare (bugetMEDIC DE LABORATOR SUB DIVERSE PRESIUNI de
mic, licitatii) acreditare

Tulpini a caror
Aprovizion
identificare si profil
are
de rezistenta ne pun
in dificultate
Resursa umana
Necesitatea de
(nr, calitatea
a raspunde
pregatirii - munca
repede si corect
este in echipa!)
solicitarilor

Complexitatea si Alte
numarul mare de responsabilitati
investigatii la locul de
efectuate munca
SINOPSIS
• Introducere: terapia antimicrobiana, orientare, monitorizare
• Terminologie si definitii

• Prezentarea sistemelor automate: avantaje/dezavantaje

• MicroScan

• Phoenix
• Vitek

• Sistemele expert in interpretarea antibiogramelor: rezistente intrinseci,

fenotipuri exceptionale, citire interpretativa
• Limite in interpretarea rezultatelor in sistemele automate

• Concluzii si perspective
Terapia antimicrobiana: orientare,
monitorizare
Identificare + Interpretare
Microorganism
antibiograma antibiograma

Deducere
fenotip de
Relevanta clinica a rezistenta
mecanismului de
rezistenta Deducere
mechanism
biochimic al
rezistentei
Redefinirea categoriilor clinice, daca
e necesar
Deducerea usceptibilitatii/rezistentei RAPORT
la agenti antimicrobieni netestati
Terapia antimicrobiana: orientare,
monitorizare
Agent
• TINTIREA ANTIBIOTERAPIEI: singura decizie medicala care priveste
antimicrobi
actiunile unui medicament concomitent la doua specii
• Omul bolnav
al
• Microorganismul infectant

• OBLIGATORII :
• Cunoasterea farmacologiei antibioticului
• intelegerea relatiei microorganism-antibiotic

Virulenta
Microorganism Mec. de aparare Pacient
 Terminologie si definitii

RELATIA in vivo:
RELATIA in vitro:
• CMI (concentratia minima inhibitorie) = cea mai joasa concentratie
• PUNCTE DE RUPTURA (CLINICAL BREAKPOINT)
exprimata in mg/L * care in conditii bine definite, in vitro, previne
Stabilite bacteriilor
• cresterea empiric prin coroborarea
intr-o unordefinita
perioada de timp factori
microbiologici, farmacologici si clinici *µg/ml – nerecomandata
– microorganismul testat
– distributia CMI/ ECOFFs
– mecanisme de rezistenta
– doza antibiotic
– farmacocinetica (Cmax, ASC, T½, legare de proteine)
– farmacodinamica (Cmax/CMI, ASC/ CMI, efectul postantibiotic)
– rezultat clinic(raspuns clinic/CMI)
 Terminologie si definitii
IMPORTANTA ACESTOR “CLINICAL BREAKPOINT’:
• permit incadrarea bacteriilor in categoriile clinice de
S/I*/R
* raspuns variabil sau indeterminat la
terapie, uneori benefic daca antibioticul este concentrat la
locul infectiei sau daca se creste doza

• Standardizare
• Armonizare
• NECESITATEA IMPLEMENTARII EUCAST:
• organizat de ESMID, ECDC
• breakpoint-urile definite de EUCAST sunt singurele
recunoscute de EMA
Metode de determinare a
sensibilitatii la ANTIBIOTICE
FENOTIPICE:
FENOTIPICE:
FENOTIPICE:
– Tehnici calitative:
•– Tehnici
Tehnici calitative:
calitative:
• antibiograma difuzimetrica pe subcultura standardizata
• •antibiograma
antibiogramadifuzimetrica
difuzimetricapepesubcultura
subculturastandardizata
standardizata
– Tehnici cantitative: determinarea CMI
•– Tehnici
Tehnicicantitative:
cantitative:determinarea
determinareaCMI CMI
• Indiferent
Tehnica de
dilutiilor metoda,
in bulion –determinarea
metoda de referinta
• •Tehnica
Tehnicadilutiilor
dilutiilorininbulion
bulion– –metoda
metodadedereferinta
referinta
• •sensibilitatii
Tehnica
Tehnica
Tehnica dilutiilor
dilutiilor
la
dilutiilor unin antibiotic
ininagar
agaragar a unei tulpini
• ••izolate
E-test de la un pacient in scopul stabilirii
E-test
E-test
GENOTIPICE:
GENOTIPICE:
GENOTIPICE: statutului de S/I/R este o problema de
•– Determinare
–
Determinaregene
Determinare
genede
gene exactitate!
derezistenta(mecA,vanA,.)..
rezistenta(mecA,vanA,.)..
de rezistenta(mecA,vanA,.)..
•– Determinare
Determinaremarkeri
markeride derezistenta(PBP2a,βlactamaze)
rezistenta(PBP2a,βlactamaze)
– Determinare
DEDUCTIVE = “EXPERT markeri
RULES” de rezistenta(PBP2a,βlactamaze)
DEDUCTIVE
mecA
•– mecA =rezistenta
“EXPERT
rezistenta lalaRULES”
ββlactamine
lactamine
•–
–IDID
mecA rezistente intrinseci
 rezistenta
rezistente intrinseci la β lactamine
Metode de determinare a
sensibilitatii la ANTIBIOTICE

PRINCIPIUL DETERMINARII CMI

• Un inocul standardizat al tulpinii testate este insamantat
intr-un gradient discontinuu de concentratii de antibiotic
• Macrodilutii ( tuburi cu volum de minim 2ml)
• Microdilutii(placute de microtitrare cu o
capacitate<500 /µL godeu)
• CMI= concentratia cea mai mica care inhiba complet
cresterea in vitro, in 18-24 ore de incubare
Sisteme automate

Automatizare si
sisteme expert
Citire
interpretativa
Criterii de
interpretare
Standardizarea
metodelor de
testare
Relatia rezistenta-esec
terapeutic
Descriere
mecanisme de
Introducere in rezistenta
practica clinica
Descoperire
antibiotice

1920 1930 1940 1950 1960 1970 1980 1990 2000

Sisteme automate

• performante
comparabile
• concordanta cu
metoda de referinta
>95%
 Sisteme automate
• Analizoare in care se efectueaza incubarea, citirea automata a
antibiogramelor si interpretarea rezultatelor printr-un sistem expert de
prelucrare computerizata care identifica fenotipurile de rezistenta

• Tehnica bazata pe metoda dilutiilor in bulion

• Functioneaza cu un software care asigura o conexiune birectionala cu

sistemul informatic al laboratorului (LIS)

• Ofera posibilitatea identificarii germenilor cu atentionarea de urgenta

asupra unor aspecte particulare ale testarii si interpretarii rezultatelor

• Program de QC

• Genereaza rapoarte epidemiologice

Sisteme automate

Certificarea unor criterii

de performanata
considerate acceptabile
pentru fiecare
combinatie antibiotic -
microorganism
 Sisteme automate
Performanta acceptata pentru sistemele automate/
metoda de referinta (FDA)

• Essential agreement (± 1 dilution): >89.9%

• Category agreement (interpretive results, SIR) >89.9%
• Major discrepancies (false resistance): ≤ 3%
• Very major discrepancies (false susceptibility): ≤ 1.5%
• Growth failure rates: < 10%

Antimicrobial Susceptibility Test (AST) Systems.

Guidance for Industry and FDA-Class II Special
Controls Guidance Document:, August 28, 2009
 Sisteme automate

Acuratetea sistemelor automate (ISO 20776-2:2007)

• Essential agreement (± 1 dilution): ≥ 90%

• Category agreement (interpretive results, SIR) ≥ 90%
• Major discrepancies ( false resistance): ≤ 3%*
• Very major discrepancies (false susceptibility): ≤ 3%**
• Reproducibility (± 1 dilution and/or SIR results): ≥ 95%

Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -

Susceptibility testing of infectious agents - evaluation of
performance of antimicrobial susceptibility test devices - Part 2:
Evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test
devices. International Standard ISO 20776-2:2007, ISO, Geneva.
 Sisteme automate- avantaje
• Performanta mediului lichid pentru exprimarea rezistentei
• Standardizarea
• Reproductibilitatea rezultatelor
• Rapiditatea obtinerii rezultatelor
• Castig de timp/ usurinta in utilizare exploatarea informatica a
rezultatelor a carei fiabilitate depinde de sistemul expert
• Trasabilitatate prin coduri de bara
• Beneficii clinice si financiare (spitalizare, mortalitate)
• Gestiunea facila a stocurilor de consumabile
• Controlul valabilitatii reactivilor/cardurilor
• Deseuri in cantitate mica
 Sisteme automate - dezavantaje
• Costul investitiei (echipament, consumabile, control intern)
• Predefinirea panelurilor de antibiotice
• Performante variabile in functie de germen
• Incapacitatea de a testa toate microorganismele (anaerobi, BGN-NF)
• Probleme cu detectarea fenotipurilor de rezistenta
• Nevizualizarea interactiunilor (sinergii/antagonisme)
• Realizarea manuala a inoculului (sursa de eroare)
• Conditii de instalare (spatiu adecvat la dimensiuni si greutate)
• Conditii de mediu (racire, ventilatie)
• Conditii pentru depozitarea reactivilor
• Pierderea “placerii “ bacteriologiei traditionale
• “Lenevirea mintii”
MICROSCAN WALK-AWAY PLUS SYSTEM
INOCULARE: Manuala/sistem RENOK

CAPACITATE: 40-96 microplaci// 96 godeuri

CMI/ID+CMI; dilutii duble seriate pentru
PANELURI:
18-22 antibiotice
Citire directa bazata pe inhibitia cresterii
PRINCIPIU DE DETERMINARE A CMI:
bacteriene
METODA/RITM DE CITIRE: Turbidimetrica (”read when ready”)
TIMP MEDIU DE REALIZARE
15-18 ore
ANTIBIOGRAMA:
SISTEM EXPERT: LabPro Alert
La schimbarea de lot/ ATCC recomandate
CONTROL DE CALITATE:
in insertul tehnic
 PHOENIX
INOCULARE: Manuala
CAPACITATE: 100 galerii
ID+CMI; galerii cu 51 godeuri pentri ID si 136
PANELURI: pentru AST; dilutii duble seriate pentru 14-22
antibiotice
PRINCIPIU DE DETERMINARE A Citire indirecta bazata pe modificarea culorii
CMI: generata de inhibitia cresterii bacteriene
Turbidimetrica si colorimetrica (indicator re-
METODA/RITM DE CITIRE:
dox), monitorizata la fiecare 20 min
TIMP MEDIU DE REALIZARE
12 ore (4-16 ore)
ANTIBIOGRAMA:
SISTEM EXPERT: BDExpert
La schimbarea de lot/ ATCC recomandate in
CONTROL DE CALITATE:
insertul tehnic
VITEK
INOCULARE: Automata
CAPACITATE: 30/60/120 carduri
ID sau CMI; carduri cu 64 godeuri ; 1-6
PANELURI:
concentratii pentru 9-20 antibiotice
Calcul pe baza unui algoritm bazat pe
PRINCIPIU DE DETERMINARE A
viteza de crestere in absenta / prezenta
CMI:
antibioticului in concentratiile testate
Nefelometrica , monitorizata la fiecare 15
METODA/RITM DE CITIRE:
min
TIMP MEDIU DE REALIZARE
6-8 ore (4-18 ore)
ANTIBIOGRAMA:
SISTEM EXPERT: Advanced Expert System (AES)
La schimbarea de lot/ ATCC recomandate
CONTROL DE CALITATE:
in insertul tehnic
 Sisteme expert

MICROSCAN PHOENIX VITEK

• Reguli publicate • Reguli publicate • Comparatii
• CLSI/EUCAST • CLSI/EUCAST fenotipice
• LabProAlert • BD Expert • >3500
System • BD EpiCARE fenotipuri
• HighFlexX • Update 6 luni • 30000
• Update 12- distributii CMI
18luni • CLSI/EUCAST
• I’Observa
• Update 12 luni
Sisteme expert
‘’An expert knows all the answers- if you ask the right questions’’ Levi
Strauss

APLICATIA MAJORA A SISTEMELOR EXPERT ESTE INTERPRETAREA

ANTIBIOGRAMELOR

REGULI

Rezistente Fenotipuri Citire

intrinseci exceptionale interpretativa
Sisteme expert - reguli

EUCAST Expert Rules

Version 3.1/26.09.2016
Intrinsic Resistance and
Exceptional Phenotypes
Tables
htpp://www.eucast.org/exp
ert rules
 Sisteme expert – reguli
~rezistente intrinseci~
• Caracteristica a tuturor reprezentantilor speciei respective

• Testare necesara

• Rezultatul “S” tb interpretat cu prudenta/retestat

• eroare ID/AST
• chiar daca “S” se confirma, preferabil a nu se utiliza in
terapie acel antibiotic
 Sisteme expeet– reguli
~fenotipuri exceptionale~

• Fenotipuri foarte rare sau inca neraportate

• Rezultatul “R” tb interpretat cu prudenta:

• eroare ID/AST
• testari suplimentare, trimitere la un laborator de referinta
 Rezistente intriseci
bacterii gram pozitive
Cefal
opso Ami
Ac. Cef rine nogli Mac Clin Vanc Teic Fosf Nov Sulfonamid
Fusi azidi (exc cozi rolid dam omic opla omic obio a
ORGANISM dic m epti icina ina nin ina cin
de
e
caz)
S.aureus R
S.saprophyticus R R R R
Streptococcus spp. R R R*
Enterococcus R R R R* R R R
faecalis
E.gallinarum/ R R R R* R R R R
caselliflavus
Enterococcus R R R R* R R
faecium
Listeria R R
monocytogenes
Corynebactrium R
spp.
 Rezistente intrinseci
bacili Gram negativi fermentativi
Amo
xicili Ampic
Am na/a ilina/ Ticarci Cefaz Cefoxi Cefur Tetrac Tigeci Colisti Nitrof
ORGANISM pici c uranto
sulbac lina olin tin oxim iclina clina n
lina clav tam in
ulani
c
Citrobacter freundii R R R R R R
Enterobacter R R R R R
cloacae cpx

Klebsiella
pneumoniae/ R R
oxytoca

Morganella R R R R R R R
morgannii
Proteus mirabilis R R R R

Proteus vulgaris R R R R R R R

Providencia stuartii R R R R R R R R R
 Rezistente intrinseci bacili Gram
negativi nonfermentativi
Piper Cefo Cefa Imip
Ticar acilin taxi zidi Erta ene Cipr Tigec
Ticar cilin a/ m/ m/ m/ Colis Fosfomi
cilin a/ ac cefe pene
ORGANISM oflox iclin
tazob cefr mer acin a tin cina
a clavu acta aixo pime m open
lanic m na em
Acinetobacter
baumannii/

nosocomialis/ R R
calcoaceticus cpx
Pseudomonas
aeruginosa R R R
Stenotrophomonas
maltophilia R R R R R R
Burkholderia cepacia
cpx R R R R R R R
 Rezistente exceptionale

ORGANISM FENOTIP EXCEPTIONAL

Enterobacteriaceae (exceptie Proteae si R: colistin

Serratia)

Pseudomonas aeruginosa R: colistin

Haemophilus R: CS3; carbapeneme, fluorquinolone

S. aureus R: vancomicina, teicoplanin, dalbavancin, linezolid, tigeciclina

St. pneumoniae R: carbapeneme, vancomicina, teicoplanin

SH grup A, B, C ,G R: penicilina, cefalosporine, vancomicina, teicoplanin, linezolid

R: linezolid, tigeciclina
Enterococcus spp. R: teicoplanin, dar NU la vancomicina

Enterococcus faecalis R: ampicilina

Corynebacterium spp. R: vancomicina, teicoplanin, linezolid
 Sisteme expert – REGULI
~citire interpretativa~
• Deducerea mecanismelor de rezistenta pe baza rezultatelor
antibiogramei si interpretarea sensibilitatii clinice pe baza
mecanismelor de rezistenta
• BENEFICII
• Impact major in raportarea rezultatelor si adecvarea terapiei
antibiotice
• Detectia unor noi mecanisme de rezistenta
• Analiza epidemiologica a rezistentei
• LIMITE
• Complexitatea mecanismelor de rezistenta
• Informatii limitate despre anumite mecanisme
• Existenta rezistentei de nivel jos
• Greseli la deducerea unor mecanisme de rezistenta
 Sisteme expert – REGULI
~citire interpretativa~

Exista bune evidente clinice in baza

carora raportarea ca “S” a rezultatului
testarii va conduce la esec terapeutic
A
Exista evidente slabe si bazate doar pe cateva
cazuri raportate ori pe modele experimentale.
Se presupune ca raportarea ca “S” a
rezultatului testarii ar putea conduce la esec B
terapeutic
Nu exista evidente clinice, dar datele
microbiologice sugereaza ca folosirea C
clinica a antibioticului respectiv trebuie
sa fie descurajata
 Sisteme expert
~citire interpretativa~

PATOGEN
PATOGEN STAPHYLOCOCCUS SPP.
ENTEROBACTERIACEAE
PATOGEN ENTEROCOCCUS
STAPHYLOCOCCUS
SPP.
SPP.
AB testat
AB testat Levofloxacin,
CS Moxifloxacin
¾ Gentamicina
, AMC, AMS, TZP
AB testat Cefoxitin

AB vizate
AB vizate Toate AMS,
AMC, fluoroquinolonele
TZP
PATOGEN
AB vizate β lactamine
Toate STAPHYLOCOCCUS
aminoglicozidele SPP.
(exceptie streptomicina)
R lalalevofloxacin/moxifloxacin
R/I CS ¾ siinalt
S la AMC, AMS, TZP(CMI>128mg/L)
se raporteaza conform
Regula R
R nivel
la meticilina la gentamicina test pozitiv
Regula
AB testat
Regula R la toate
testarii ,cu fluoroquinolonele
avertisment
Levofloxacin, asupra
Moxifloxacin rezultatului incert al
Regula pentru
R la toaterezistenta de nivel
β lactaminele inalt la toate
(exceptie aminoglicozidele
ceftaroline/ceftobiprol)
terapiei(exceptie
(exceptie infectiile
streptomicina)urinare)
Achizitia
Tulpinile de
ESBL mutatii
sunt combinate
deseori (gyrA)caconduce
incadrate S la la rezistenta
combinatii β unei
Explicatia Productia
Rezistenta de PBP2a (mecA)
de nivel inalt genereaza
este generata rezistenta
de producrea incrucisata
AB vizate incrucisata
Toate
lactamine/inhib. totala/partiala
fluoroquinolonele
Cu la toate fluoroquinolonele
exceptia APH(2’)-AAC(6)
inf. urinare si cele
a inf. invazive cu mica
pct
Explicatia
Explicatia pentru
enzimetoate β lactaminele
bifunctionale (exceptie cu
care afinitate
determina
Explicatia de plecare urinar, folosirea acestor
pentru
pierdera PBP2a)
sinergismului tuturorcombinatii pentru inf
aminoglicozidelor cauzate
(exceptie
Grad evidenta de
C tulpini
R ESBL este controversata
la levofloxacin/moxifloxacin
streptomicina) cu β lactaminele si tb
si indicata cu prudenta.
glicopeptidele
Regula
Grad evidenta R
A la toate fluoroquinolonele
Grad Grad
evidenta B A
Referinte evidenta (92.,116,117)/Leclercq
Achizitia de mutatiietcombinate
al EUCAST(gyrA)
expertconduce
rules la rezistenta
Explicatia
Referinte incrucisata totala/partiala
(13,15)/Leclercq et al EUCASTla toate
expert fluoroquinolonele
rules
Referinte
Referinte (44,45)/Leclercq et al EUCAST
(73,112)/Leclercq expertexpert
et al EUCAST rules rules
Sisteme automate
~limite in interpretare~

PATOGEN PROBLEME IDENTIFICATE

E.faecium VRE/HLAR/Amp-R/Lzd-R/ Dap-R/ Tgc-R

S.aureus MRSA/ MLS/Van-R/Lzd-R/ Dap-R

K.pneumoniae ESBL/CP-R/CT-R

Acinetobacter MDR CP-R/Tgc-R/ CT-R

Pseudomonas MDR TZP/CP-R,/CT-R

Enterobacter AmpC/ ESBL/CP-R

E.coli Cip-R/ESBL/CP-R
Sisteme automate- CONTROL
OBLIGATIVITATEA VERIFICARII:
• Controlul intern / gestionarea tulpinilor de referinta
• Participarea la scheme de comparare interlaboratoare
(control extern)

Ce furnizori alegeti ?
 Perspective

• Digital Microscopy
• Necesitatea de a dezvolta sisteme automate noi
• Rezultate mai rapide
• Micro-fluidics:
• Cost mai scazut rezultat 1-2 siore
pentru reactivi consumabile

•• ‘Early’
MetodeDisc reading:
moleculare rezultat
(teste 6-8 ore limitate
genotipice/PCR):
• nu intotdeuna genotipul este predictiv pentru fenotip
• sute de βactamaze
• (EUCAST Eurostar Rapid Disk Method)
• mutatii si expresii noi de rezistenta
• scumpe
• MALDI-TOF – screening de rezistenta

• COMPLEMENTARE TESTELOR FENOTICE

 CONCLUZII
• Beneficii incontestabile comparativ cu abordarile conventionale
privind:
• Calitatea rezultatelor
• Eficienta lucrului in laborator
• Politica de promovare si administrare a antibioticelor in
spitale
• Supraveghere epidemiologica locala si globala
• Educatie/instruire
DAR
• Este necesar a se tine cont de nevoia constanta de
actualizare tehnica si informationala
• Sistemele automate NU SUNT un “panaceu“ in laborator
pentru rezolvarea lipsei de cunostinte/solutii in interpretarea
antibiogramelor
 REFERINTE BIBLIOGRAFICE

•• Winstanley
JongersenT,J,Courvalin
Ferraro P-Expert systems in clinical
M – Antimicrobial microbiology.
Susceptibility Clin Microbiol
Testing: A review Rev., 2011, 24:515-
of General
556
Principles and Contemporary Practice. Clin Microbiol 2009, 49:1749 -1755
•• Quentin-Noury
ISO 20776:2007 C-Automatisation de l’antibiogramme au laboratoire de bacteriologie. Revue
francophone des laboratoires, 2016, 482:49-59
Jehl F,expert
•• Eucast Chomarat M – De2.1
rules Version la-antibiograma
29 octombrie 2011la prescriptie, Ed a III-a, 2010: 63-65
Buiucexpert
•• Eucast D, Negut
rulesM - Tratat
Version 3.1de
- 26microbiologie
septembrie 2016 clinica, Ed.aII-a, 2008: 387- 440
AutomatedBrownD,
•• KahlmeterG, methods for antibiotic
CantonR, LeclerqR susceptibility
– Antimicrobial testing. Clin testing
susceptibility Microbiol and Infection,
–practical
implementation
vol 12, supl 6,of2008the Eucast Breakpoints and methods; EW08, ECCMID , Viena, 2010
•• Richter
MahonC, S, Ferraro J - Suscepibility
LehmanD – Textbook Testing instrumentation
of Diagnostic and Computerized
Microbiology, Expert
Ed a IV-a, System
2011: for Data
276-315
Analysis and Interpretation – Manual of Clinical Microbiology, Ed ASM press, 2009, 1144-1151
• Canton R - Expert Rules in susceptibility testing - rationale, advantage and
• LivermoreD, Winstanley T, Shannon – Interpretative reading: recognizing the unusual and inffering
disadvantages.
resistence Clinfrom
mechanism Microbiol, 2012;
resistance 20:176-186
phenotypes. JAC, 2001, 48: 87-102
SundqvistM,
•• BourbeauPP, Littauer P –Disk
LedeboeurNN diffusionin using
- Automatision clinicalEUCAST methodology
microbiology. can2013,
Clin Microbiol be interpreted
51:1658-
after six hours or eight, 23 ECCMID Congress, 2013 (P1541)
1665 rd

• Mohan R, Mukherjee A – A multiplexed microfluid platform for rapid antibiotic

susceptibility testing. Journal of Microbiology Methods, 2013,182: 108-111
VA MULTUMESC!