Marcaje molecular por sonda.

Presenta: Elier soto.

 Objetivos de aprendizaje
 Explica los procedimientos para el marcaje
de fragmentos de DNA utilizando la
tecnología de PCR.
 Reconoce los tipos y características de
sondas moleculares y los fundamentos del
marcaje, asi como la importancia de su
utilización.
 Conoce y explica generalidades de
diferentes métodos de marcaje.
 Errores mas frecuentes.

 La mala traducción de algunos libros de

textos, tienden a cambiar la idea general de
los conceptos.
 Confundir las técnicas de los distintos tipos
de marcaje molecular.
 No saber de donde proviene el fragmento
de Klenow.
 Casarse con la idea de que solo existe un
solo tipo de marcaje de DNA por sonda
 ¿Qué es una sonda de DNA?

 Son moléculas de DNA de cadena sencilla

marcadas mediante radiación o agentes
químicos, con el fin de ser utilizadas para la
detección de secuencias complementarias
de DNA.
Importancia.
 La capacidad de encontrar en un genoma
las secuencias de DNA de interes mediante
sondas especificas siendo usado
principalmente en el campo de la medicina.
 marcaje de fragmentos de DNA
utilizando la tecnología de PCR.

 Se usan nucleotidos modificados con

moleculas fluorescentes o atomos
radiactivos (la molecula fluorescente solo
debe de fijarse a la base de uno de los
cuatro nucleotidos usados como
precursores en la sintesis de DNA)
 Los nucleotidos se marcan radiactivamente
con 32P y el 35 S.

 Tambien se pueden marcar los nucleotidos

con biotina o dixogigenina
marcaje de oligonucleotidos de DNA, para ser
Usados en la macarcion de sondas por la
la tecnología de PCR.
oligonucleotidos degenerados.
 MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
EN EL EXTREMO 3’

 SE MARCAN USANDO LA ENZIMA

TERMINAL DEOXINUCLEOTIDO
TRANSFERASA (TdT) QUE AGREGA
ISOTOPOS RADIACTIVOS DE P-32 EN
EL EXTREMO 3’
Marcación de oligonucleotidos
con TdT
 MARCACION DE OLIGONUCLEOTIDOS
EN EL EXTREMO 5’

• SE MARCAN USANDO LA ENZIMA

POLINUCLEOTIDO CINASA QUE
AGREGA UN SOLO FOSTATO DE P-32
EN EL EXTREMO 5’ DE CADA CADENA
DE DNA
 RNAm
RT-PCR

Plantilla para PCR cDNA

oligonucleotidos
Degenarados marcados

PCR

Sondas DNA marcadas.

 SONDAS MOLECULARES
CONVENCIONALES.
DNA.

SONDAS.

RNA.
Sondas convencionales, DNA
obtenido por clonacion celular.

•EXTRACCION DEL DNA

PLASMIDICO

•RESTRICCION DEL
INSERTO

•DESNATURALIZACION
DEL DNA
Sondas convencionales, RNA obtenido
por clonación celular.
 Método El marcador se detecta
Directo. unido a la sonda.
Marcaje
de
sondas

Método El marcador para poderse

Detectar debe unirsele una
Indirecto. Proteina detectora.
MARCAJE DE SONDAS,
METODO INDIRECTO
Generalidades de diferentes tipos de
marcaje.
 NICK – TRANSLATION.

 RANDOM PRIMER EXTENSION.

 MARCAJE TERMINAL POR RELLENO.

 MARCAJE DE OLIGONUCLEOTIDOS, descrito

en marcaje de fragmentos de DNA utilizando
PCR, se usa un nucleotido marcado con α–
32P–d NTP, α-35S–d NTP.
 Marcación de SONDAS
NICK trasnlation.

 ACTUAN DOS ENZIMAS: DNasa 1 Y

DNApolimerasa 1

 SE UTILIZA ADN DOBLE CADENA

 SE INTRODUCE LA MELLA AL AZAR MEDIANTE

LAS DNAasas.

 PUEDEN HACERSE SONDAS NO RADIACTIVAS

NICK TRANSLATION.
 Marcación de SONDAS
RANDOM PRIMER

 SE UTILIZA UNA SECUENCIA DE

OLIGONUCLEOTIDOS CONOCIDA.

 SE USA ADN SIMPLE CADENA (SE DESNATURALIZA

POR CALOR).

 SE USA EL FRAGMENTO DE KLENOW PARA

GENERAR UNA CADENA COMPLEMENTARIA
Metodo de cebador al azar
Marcaje terminal por relleno
 Bibliografia.
 Biologia celular y molecular. Lodish, Berk,
Zipursky, 4ta. Edicion, editorial
panamericana.

 Biología molecular e Ingeniería Genética.

Luque, José Ángel. ; Editorial Harcourt.